JPS63500245A

JPS63500245A - ウンデュリンおよびその断片化生成物、それらの製造法ならびにそれらの用途

Info

Publication number: JPS63500245A
Application number: JP50431586A
Authority: JP
Inventors: シュッパン，デトレフ; ハーン，エッカート　ゲー
Original assignee: ハイル、ヘミッシェ−ファルマツォイティッシェ、ファブリク、ゲ−エムベ−ハ−、ウント、コンパニ−、カ−ゲ−
Priority date: 1985-07-10
Filing date: 1986-07-09
Publication date: 1988-01-28
Also published as: EP0227827A1; DE3524644A1; WO1987000176A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウンデニリンおよびその断片化生成物、それらの製造法ならびにそれらの用途本発明は、ウンデニリン（Ｕｎｄｕｌｉｎ　）およびその断片化生成物、それらの製造法ならびに特定の抗体の生産および結合組織に関係しまた疾患および腫瘍性疾患の診断、予後および治療へのそれらの応用に関するものである。

間質結合組織は主としてコラーゲンニー小線維からなっている。

超微細構造研究の結果、高分子がコラーゲン小線維の結合を支えていると推測される。フィブロネクチンおよびプロテオグリカン以外に、コラーゲンＩ小線維の超分子組織を支えるもう一つの構造成分があると推測される。従来、この成分を単離しようとする試みは不成功に終わっている。

驚くべきことに、哺乳動物の胎仔または新生仔の皮膚を抽出するとき新規な蛋白質ウンデニリンが得られ、このものはコラーゲン■小線維の超分子組織において重要な役割を演じており、医学および美容上利用できることが今回見出された。

本発明は、ウンデニリンおよびそのペプチド断片ならびにそれらの製造法およびそれらの用途に関するものである。

間質結合組織の蛋白質の中で、ウンデニリンは、コラーゲンＩおよび■と並んで、主成分の一つをなしていると思われる。ウンデニリンは、強度に凝集した高分子糖蛋白質であり、主として分子量が１００万をはるかに越える交差架橋複合体として存在し、非還元性条件下での５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出される。コラーゲン■の標準品を用いるとき、還元後に、２７０，０００のところに特徴的なバンド（Ａ鎖）および１７５，０００／１８０，０００のところに二重線バンド（それぞれＢ１鎖、Ｂ２鎮）を染色することができる。

二重線バンドの移動度は、還元型フィブロネクチンのそれよりもはっきりと大きい。

第１図は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動における還元前（１）および還元後（２）のウンデニリンを示す。コラーゲン性α、βおよびγ成分の位置は矢印で示しである（標準）。

ウンデニリンは、凍結乾燥後には、中性の非変性性緩衝系、たとえばＴｒｉｓ− ＨＣｅ燐酸緩衝液、または希酢酸にはほとんど溶解しない。

これに対し、ウンデニリンは、プロテアーゼ阻害剤の存在下に、ｐＨ７〜９の６Ｍ塩酸グアニジンによく熔ける。ウンデニリンは、コラーゲンＩと組合せて、０．５Ｍ酢酸／１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に熔解させることができる。

かかる調製物は２７円錐蒸着後、電子顕微鏡により精査することができる。この場合、分子は従来未知の構造の形態をとっており、それは、直径約１８ｎｍの球状の頭部、長さ約７０ｎｍの尾部およびそのもう一方の末端の部分的な小球状の領域（直径約６ｎｌ＋＋）からなっている、２．４またはより多くのこの構造からなり、しばしばコラ−デフ１分子と連係した凝集形態が多く観察される０円錐蒸着後の、単離された形（矢印）および凝集した形（二重の矢印）のウンデニリンをコラーゲンＩと共に見ることのできる電子顕微鏡写真を第２図に示す。

アミノ酸分析（６Ｍ塩酸、２４時間、窒素雰囲気下、１１０℃）では、ウンデニリンは大型の糖蛋白質に特異的な、しかし非特徴的な、疎水性および酸性のアミノ酸の含量が高いアミノ酸組成を与える。

しかし、そのアミノ酸組成が基底膜蛋白質であるラミニンのそれあるいはフィブロネクチンのそれとは明瞭に相違することは、次表から明らかである。

第１表：ウンデニリンのアミノ酸分析４　１−ｔｙｐ　Ｍｅｔ　２２Ａｓｘ　９８　１１ｅ　５４Ｔ　ｈ　ｒ　６５　Ｌ　ｅ　ｕ　８９Ｓｅｒ　８８　Ｔｙｒ　３３Ｇｌｘ　９３　Ｐｈｅ　３９Ｐｒｏ　５５　Ｈｉｓ　２６Ｇｌｙ　８６　ＨｙｌＡｌａ　５９　Ｌ）’ｓ　５２Ｃｙｓ　２７　Ａｒｇ　４９Ｖａｔ　６５アルジＩ・−ルアセテートのガスクロマトグラフィーにより４、および質量分析によりめたウンデニリンの炭水化物含量は約２％（ウンデュリン１００ｇ当たりの重量）で、ラミニンのそれ（約１２％）およびフィブロネクチンのそれ（約５％）よりも明らかに低い。炭水化物分析を次表に示す。

第２表：ウンデニリンの炭水化物分析蛋白質１００ｇ当り炭水化物ｇ数Ｎ−アセチルグルコサミン　０．９４Ｎ−アセチルガラクトサミン　０．２２ウンデユリンのもう一つの性質はウンデュリン抗体により明らかとｊＪ、る（この抗体の製造法はのちに記載する）：間接免疫螢光法において、ウンデュリン抗体は、皮膚または肝の未固定４μｍ低温保持切片上で、結合組織蛋白質について既知の全てのパターンと異なる新しいパターンを示す。第３図から明らかなように、ウンデュリンのパターンは、直径が一様で（約１μｍ）、波形の、平行に配列された小線維からなっている。この典型的な波形小線維束は、間質を横断ているが、基底膜中には存在しない。ウンデュリンは、成熟型コラーゲン（タイプＩ）の小線維をも予想できる密な組合組織中に主として見出され、ときには皮膚の深層中に（第３図）、相対的に太い血管の外股または肝の門脈領域（第４図）に見られる。ヒトにおいてのみならず、マウス、ラット、ウシにおいても、同様の分布パターンが見られる。興味あることには、ウンデュリンは、腫瘍領域では他の結合組織蛋白質よりも速やかに分解される。免疫電子顕微鏡写真では、抗つンデュリン抗体は（フェリチン結合第２抗体と共に）、第５図に示すように、コラーゲン小線維の表面およびそれらの間の球状物質を修飾している。（Ｅ＝弾性線維；横線の長さ一５００ｎ■）。

ウンデュリンの製造法は、プロテアーゼ阻害剤の存在下に、Ａ）哺乳動物胎仔または新生仔の皮膚を中性塩抽出に付し、Ｂ）抽出物を分画塩析に付し、Ｃ）析出物を熔解し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製して、ウンデュリンを粗製物として取得し、Ｄ）該粗製物を、透析および凍結乾燥後、抽出によりさらに卑責製し、Ｅ）断片化生成物を調製するために、ウンデュリンを中号生また番ま酸性プロテアーゼにより、分子量＜４００，０００の断片が得られるまで分解し、Ｆ）工程りまたはＥで得られた生成物をＣＭ−およびＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、分子ふるし１および／また番まＨＰＬＣによりｐ　）（２，５〜９．０の緩衝液中で精製することを特徴とする。

工程Ａ）の抽出は、まず中性緩衝液による予備抽出を１テって、血清蛋白質および脂質類を除去するようにして実施するの力蒐好ましシ１゜このためには、１０〜１００１中性緩衝剤、たとえＬｆ５０〜２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈα、ｐＨ７〜Ｂの４〜５ＭＮａｃｉ！、２０〜２００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（２−（４−（２ −ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル〕エタンスルホン酸）緩衝液またはＰＩＦＥＳ（ピペラジン−Ｎ。

Ｎ゛−ビス（２−エタンスルホン酸））緩衝液を、０．１〜２％の非イオン性界面活性剤、たとえばτｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と共に用し）る。皮ｉｉ’ｃ湿潤重量）１ｋｇ当たり約２〜４１の緩衝液を用し）る。続し）て、本来の抽出を行うが、これは同様の緩衝系中で同様の量を用Ｌ１て１テうのが好ましいが、イオン強度はより低（して行う。

抽出物はつぎに工程Ｂ）に従って、分画塩析に付す。第一ステップでは、硫酸アンモニウムを飽和度が２０〜５０％となるまで添加して抽出物を沈澱させる。こうして得た沈澱を再び１０〜２００ｍＭ中性緩衝剤中に溶解し、ハロゲン化アルカリ、たとえ４ｆＮａαを用し）た分画塩析に付す、ウンデュリンの大部分が１．５Ｍ〜４．５Ｍの間で析出する。

精製のため、沈澱を中性緩衝液／１〜４？ｌ尿素１０．２５〜０．５ＭＮａＣｊ！に熔解し、ＤＥＡＥ−セルロースで処理する。結合しな力）つた画分を同じ、ただいａｃｊ！を０．０１〜０．０５＋１Ｌか含有しなし）緩ｉ動液に対して透析する。かくして得た沈澱は、約７０％まで力（ウンデュリンよりなる。上澄みはさらにウンデュリンを含有し、これｂま、溶離剤として塩勾配を用いたＤＥＡＥセルロースクロマトク゛ラフイーにより、純度９０％以上で回収できる。

調製物を、たとえば酢酸に対する透析により脱塩し、凍斧吉乾燥する。７０％調製物は、所望により非イオン性界面活性剤の存在下に、中性緩衝液で抽出することにより、不純物を除くこと力（できる。力・くして回収した純度８０％以上の製品を１０〜１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ（ｊ！、５〜６Ｍグアニジン、ｐ’　Ｈ８〜９に溶解し、分子ふる（、Ｎカラム（たとえばセファクリル２Ｂ、Ｃｌ４Ｂまたは５−１０００　’）で低分子不審屯物を分離、除去する。ここで得られる純度はほとんど１００％である。

収量は、皮膚１ｋｇ（湿潤重量）当たり約１００■である。ウンデュリンは、その断片について後述するように、さりこ精製することができる。

プロセス全体は、冷室温（４〜１０℃）下に、プロテアーゼ阻害剤、たとえばフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）−Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）　、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）　、大豆トリプシン阻害剤（ＳＢＴＩ）、トラジローＪし、塩酸ベンズアミジンの存在下に行うのが適当である。

ウンデュリンは、中性または酸性プロテアーゼＧこ対して極めて敏感である。適当な中性プロテアーゼは、たとえばトリプシン、トロンビン、プラスミン、エラスターゼ、カテプシン、■８−ぶどう球菌プロテアーゼ、キモトリプシン、パパインおよびサーモリンである。適当な酸性プロテアーゼの例は、ペプシン、酸性カテプシン、キモシンなどである。

好ましいプロテアーゼは、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、■８−ぶどう球朶プロテアーゼ、キモトリプシンならびにペプシンである。

分子量が４０万以下、好ましくは１０万以下であるウンデュリンのプロテアーゼ断片は、中性緩ｊｈ液に部分的に可溶で、ウンデュリンの抗原特性の若干がその際維持される。

たとえば、ウンデコ、リンをトリプシンにより３０℃で分解すると、分子量３０万〜４０万の中間段階を経て、分子量３万〜５万、６万〜７万および８万の主生成物が生じる。４℃でのペプシン分解の最終産物ば、２５，０００〜ｓｏ、ｏｏｏの間の分子量をもつ。

これらの断片は、ｐ　Ｈ２，５〜９，００通常の緩衝液中で、ＣＭまたはＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー、分子ふるｌＩ）および／またはＨＰ　Ｌ　Ｃにより精製できる。適当な酸性緩衝液はたとえば酢酸またはくえん酸緩衝液である。適当な中性緩衝液は既に述べである。

適当なアルカリ性緩衝液は重炭酸アンモニウム、酢酸ナトリウムである。

ウンデュリンおよびその断片は強い抗原として作用する。たとえば、高力価の抗血清の調製には、ウソデュリンまたはその断片０．３■を３回適用すれば十分である。とくにウサギおよびマウスで、既知の方法、たとえばアフィニティークロマトグラフィーにより、特異抗体を得ることができる。これらの試剤はうニスターンプロット、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　（Ｅｎｚｙｎ＋ｅ−Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉａａ＋ｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）または放射免疫検定において他の結合組織蛋白質とは全（交差反応しない、モノクロナール技法によっても、ウンデュリンおよびその断片に対して高親和性の抗体を調製することができる。かかる免疫試剤は、免疫組織学上、細胞培養実験のため、遺伝子工学で、またウンデュリンおよびその断片の分析証明のため利用することができる。かくして、免疫組織学的に抗つンデュリンモノクロナール抗体を用いて、ポリクロナール抗体によるのと同じ特徴的パターンが得られることを示し得た。

しかも、上記の抗体および抗原は、放射免疫ヰ★定、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、螢光免疫検定（ＦＩＡ、）、発光免疫検定などによって体液、細胞抽出液中のウンデュリンおよび／またはその断片を定量するのに役立つ。すなわち、高特異性の鋭敏な放射免疫検定によって、ウンデュリンの抗原活性が体液中を循環していて、間質結合組織が関与する疾患像、たとえば炎症、線維症性疾患、Ｉｌｔ瘍性疾患と高水準の相関を示すことを示し得た。ウンデュリンおよびその断片は、ローション、ゲル、クリームなどの化粧品にも、皮膚の外観および状態を改善する目的で利用することができる。

以下、実施例により本発明を説明する。

実五拠上ウンー゛ユ１ンの−１サル、ウシまたはラットの胎仔または新生仔の皮膚を膨潤させ、ホモジェナイズし、２ｍＭのＰＭＳＦ、４ｍＭのＮＥＭおよび１０ｍＭのＥＤＴＡをプロテアーゼ阻害剤として含有するｐＨ７，４の１００ｏ＋ＭＴｒｉｓ−４，５Ｍ　Ｎａ（ｊ！中で冷凍する。全ての作業は４℃で、プロテアーゼ阻害剤類（ＰＩ）の存在下で行い、緩衝液を用いるときには、そのｐＨを４．０以上とする。ホモジェネートをまず、ｐ　Ｈ７，４の５０＋＋＋ＭＴｒｉｓ／ＰＩ／４Ｚ５Ｍ　ＮａＣｊ！＋　１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（３（１／ｋｇ湿潤重量）により抽出する。つぎに残渣をｐ　Ｈ７，４の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　／ＰＩ１０．５ＭＮａＣ１！　（３Ｒ／　ｋｇ湿濶重Ｎ）で抽出する。飽和度が３０％（１６８ｇ／Ｉｌ）となるまで硫酸アンモニウムを加えることにより、上澄み液から沈澱を得る。これを再びＴｒｉｓ　／ＰＩ１０．５Ｍ　ＮａＣｅ　（３ｊｉ！　／　ｋｇ湿清重量）に溶かす。溶液を、最終濃度が１．７．２．６および４．５ＭとなるまでＮａＣ１−を用いての分画塩析に付す。２．６ＭＮａαでの分画をｐＨ７，４の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　、、ＰＩ、０．３ＭＮａＣｊ？、１〜４Ｍ尿素に熔かし、この混合物に対して透析する。沈澱（コラーゲンＩの凝集物）を遠心分離し、上澄み液をＤＥＡＥセルロースと混合、攪拌する。結合しなかった両分をｐＨ７，４のＴｒｉｓ　／ＰＩ１０．０２Ｍ　ＮａＩ：ｊ！に対して透析すると、ウンデュリン、コラーゲン■および分子量３５，０００の蛋白質からなる沈澱が得られる。可溶性の物質をＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーに付す、約０．２５ＭＮａαの塩勾配を用いて溶出すると、純度９０％以上のウンデュリンが得られる。

ウンデュリン含有画分を０．１　？Ｉ酢酸に対して透析し、凍結乾燥する。さらに精製するには、凍結乾燥物をｐＨ８，２の５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊｌ！、２１尿素、プロテアーゼ阻害剤、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００により４℃で抽出する。このとき、とりわけ夾雑蛋白質が除去される。熔けなかった約り０％純度のウンデュリンをつぎにｐＨ８，２の５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｆｌ！、６ｉグアニジンに熔かし、セファロースＣＩ　４Ｂによって同じ緩衝液中で低分子量不純物を除去する。こうして調製されたウンデュリンは均質で純粋である。収量は、仕込んだ皮ｉｉ’１ｋｇ（湿潤重量）当たり１００■である。

災丘拠１ウンー゛ユ１ンの　１プシン凍結乾燥した蛋白質をｐＨ７，０の０．２Ｍ　ＮＨ４ＣＯ３／酢酸に０．５■／ｙ＋ＪＩＪｆに懸濁し、トリプシン＝Ｔ　Ｐ　ＣＫ　（Ｓｅｒｖａ　、ハイデルベルク）により、酵素／基質比１：５０で２５℃にて振とう下に分解する。１０．３０および６０分後ならびに４および１６時間後にアリコートを採取し、トリプシン阻害剤（大豆トリプシン阻害剤、５ｅｒｖａ、ハイデルベルク）を混合し、凍結乾燥する。１６時間後の分解産物は、分子量８万以下のペプチド類を主として含有する。

尖施孤主ウンー゛ユ１ンのペプシンゝ” ペプシン分解のため、ウンデュリンを０．５Ｍ酢酸中に１ｗ／ｍ濃度に懸濁し、４〜８℃で、１：５０（酵素対基質）比で振とう下にペプシン（Ｓｉｇｍａ　、タウフキルヘン）で分解する。６〜１０時間後に、分子量が２５．０００〜ｓｏ、　ｏｏｏの間の断片が主生成物として得られる。

ス】直江（支頂ｒ　Ｘ　゛よびポＩクロ　ニＲ且盗皇］裂つンデュリンおよびその断片（サル、ウシまたはラットからの）に対する高力価抗血清を次のようにして調製できる：中性緩衝液０．５　ｄに懸濁し、完全フロインドアシュパン）　０．５　ｍＲ中に乳化した抗原０．２■を皮下投与する。ひき続き、３週間間隔で、不完全アジュバントを用いてもう２回注射を行う。カラムに固定した結合組織抗原に抗血清を作用させる。緩衝液で十分洗ったのち、最後に、固定ウンデュリンから高親和性特異抗体を溶出することが８〜１２週令のＢａ１ｂ／ｃマウスに、１００ μｇのウンデュリンないしはウンデュリン断片を各２週間間隔で３〜４回皮下注射する。

最初は、フロインドアジュバント（完全）と１：１比で混合し、以後はフロインドアジュバント（不完全）と１：１比で混合する。

マウスで抗体価がプラスとなったのち、その肺臓を同系の骨髄腫細胞（ＮＳＩ）と融合させ、組織培養する。陽性抗体産生性細胞クローンのサブクローニングによって、単一の抗体を産生ずる細胞系を得る。抗体は、既知の方法によって、組織培養上澄みないしは細胞培養のキャリアーとして用いたマウスの腹水から精製することが実施例１のセファロースＣｌ４Ｂクロマトグラフイー後の精製ウンデュリンは、１０Ｍｇ１５０μ！！５０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯｉ！、６Ｍグアニジン、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｓｐ　Ｈ８，２で、クロラミンＴ法により、１ｍｃｉの１２５１で放射活性標識化できる（標識化の時間０．５〜３分間）。

低分子量活性の除去を、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！、８Ｈ尿素、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、ｐ　Ｈ８，２に対する室温での透析により行う　１２５１−ウンデュリン（３，０００〜１０，０００　ｃｐｍ／ｎｇ蛋白質）は、その抗血清に９０〜１９９％の結合率を示し、たとえば血清または血漿中の循環抗原の定量のための、敏感な液相放射免疫抑制アッセイの実施を可能ならしめる。

Ｆｉｇ、３国際ｖ４′４を餠失ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　ｍ　ＩＮＴＥＲＮＡＴｒＯＮＡ乙　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯＲＴ　ＯＮ

Claims

【特許請求の範囲】

１．プロテアーゼ阻害剤の存在下に、Ａ）哺乳動物胎仔または新生仔の皮膚を中性塩抽出に付し、Ｂ）抽出物を分画塩析に付し、Ｃ）析出物を溶解し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製して、ウンデュリンを粗製物として取得し、Ｄ）該粗製物を、透析および凍結乾燥後、抽出によりさらに精製し、Ｅ）断片化生成物を調製するために、ウンデュリンを中性または酸性プロテアーゼにより、分子量＜４００，０００の断片が得られるまで分解し、Ｆ）工程ＤまたはＥで得られた生成物をＣＭ−およびＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、分子ふるいおよび／またはＨＰＬＣによりＰＨ２．５〜９．０の緩衝液中で精製することによって得られる、ウンデュリンおよびその断片化生成物。
２．プロテアーゼ阻害剤の存在下に、Ａ）哺乳動物胎仔または新生仔の皮膚を中性塩抽出に付し、Ｂ）抽出物を分画塩析に付し、Ｃ）析出物を溶解し、ＤＥＡＥクロマトグラフィーにより精製して、ウンデュリンを粗製物として取得し、Ｄ）該粗製物を、透析および凍結乾燥後、抽出によりさらに精製し、Ｅ）断片化生成物を調製するために、ウンデュリンを中性または酸性プロテアーゼにより、分子量＜４００，０００の断片が得られるまで分解し、Ｆ）工程ＤまたはＥで得られた生成物をＣＭ−およびＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、分子ふるいおよび／またはＨＨＰＬＣによりＰＨ２．５〜９．０の緩衝液中で精製することを特徴とする請求の範囲第１項記載の化合物を製造する方法。
３．工程Ａの中性塩抽出を２段階で行い、第１段階は、１０〜２００ｍＭの中性緩衝塩基を用いて行い、第２段階はイオン強度がより低い中性緩衝液を用いて行うことを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
４．前抽出を０．１〜２％の非イオン性界面活性剤の存在下に行うことを特徴とする請求の範囲第３項記載の方法。
５．工程Ｂの分画塩析を、工程Ａで得た抽出液に硫酸アンモニウムを飽和度２０〜５０％になるまで加え、かくして得た沈澱を１０〜２００ｍＭ中性緩衝剤溶液中に溶解し、その溶液をハロゲン化アルカリによる分画塩析に付すことにより実施することを特徴とする請求の範囲第２項ないし第４項のいずれかに記載の方法。
６．工程Ｃの精製を、工程Ｂで得られた析出物を１０〜２００ｍＭ中性緩衝剤／１〜４Ｍ尿素／０．２５〜０．５ＭＮａｃｌ中に溶解し、ＤＥＡＥ−セルロースで処理し、結合しなかった画分を０．０１〜０．０５ＭのＮａｃｌ含有する同じ緩衝液に対して透析することにより行い、ウンデュリン含量７０％の沈澱を得ることを特徴とする請求の範囲第２項ないし第５項のいずれかに記載の方法。
７．透析後に得られた上澄み液を、溶出液として塩勾配を用いたＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィーにより精製して、純度９０以上のウンデュリンを得ることを特徴とする請求の範囲第６項記載の方法。
８．工程Ｄの精製を、酢酸に対して透析し、凍結乾燥し、凍結乾燥物を１０〜２００ｍＭ中性緩衝剤または稀酢酸により、所望によってさらに、抽出することを特徴とする請求の範囲第２項ないし第７項のいずれかに記載の方法。
９．０．１〜２％の非イオン界面活性剤の存在下に抽出を行うことを特徴とする請求の範囲第８項記載の方法。
１０．ウンデュリン分解用プロテアーゼとして、トリプシン、エラスターゼ、プラスミン、トロンビン、Ｖ８ぶどう球菌プロテアーゼ、キモトリプシンおよび／またはペプシンを用いることを特徴とする請求の範囲第２項記載の方法。
１１．トリプシンまたはペプシンを用いることを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
１２．抗体の製造、免疫学的検定法および線維症性、炎症性および腫瘍性疾患の診断、予後および経過監視のための、請求の範囲第１項記載の生産物の利用。