DE3524644A1 - Undulin und dessen peptidfragmente, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung - Google Patents

Undulin und dessen peptidfragmente, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung

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Description

Die Erfindung betrifft Undulin und dessen Peptidfragmente, Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Produktion spezifischer Antikörper und zur Diagnostik, Prognostik und Therapie von das Bindegewebe betreffenden Erkrankungen und Tumorerkrankungen.
Interstitielles Bindegewebe besteht zur Hauptsache aus Kollagen-I-Fibrillen. Ultrastrukturelle Studien lassen vermuten, daß Makromoleküle den Zusammenhalt der Kollagenfibrillen vermitteln. Es wird vermutet, daß neben Fibronektin und Proteoglykan eine weitere Strukturkomponente für die supramolekulare Organisation der Kollagen-I-Fibrillen verantwortlich ist. Bisher sind Versuche, diese Komponenten zu isolieren, fehlgeschlagen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß bei der Extraktion von Häuten fötaler oder neugeborener Säugetiere das neue Protein Undulin erhalten wird, das eine wesentliche Rolle beim Zusammenhalt der Kollagen-I- Fibrillen spielt und das sich in der Medizin und Kosmetik verwenden läßt.
Die Erfindung betrifft Undulin und dessen Peptidfragmente, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung.
Unter den interstitiellen Bindegewebsproteinen scheint Undulin neben Kollagen-I und -III die Hauptkomponente darzustellen. Undulin ist ein stark aggregiertes, makromolekulares Glykoprotein, das hauptsächlich mit einem Molekulargewicht von »1 000 000 vorliegt, ermittelt anhand von SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen. Unter Verwendung eines Kollagen-I-Standards sind nach Reduktion eine charakteristische Bande bei 270 000 und ein Dublett bei 175 000/180 000 anfärbbar. Die Mobilität der Dublettbande ist deutlich größer als die des reduzierten Fibronektins.
Fig. 1 zeigt Undulin vor (1) und nach (2)-Reduktion in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Position kollagener α-, β- und γ-Komponenten ist durch Pfeile markiert (Standards).
Undulin ist nach Lyophilisation praktisch unlöslich in nicht-denaturierenden Puffersystemen, z. B. Tris · HCl Phosphat-Puffer oder verdünnterEssigsäure.
Dagegen ist Undulin in 6 M Guanidin-HCl, pH 7 bis 8, in Gegenwart von Proteaseinhibitoren gut löslich. In Assoziation mit Kollagen-I läßt sich Undulin in 0,1 M Essigsäure/1% Triton X-100 in Lösung bringen.
Derartige Präparationen lassen sich nach Kegelbedampfung elektronenmikroskopisch untersuchen. Dabei erscheint das Molekül in Form einer bisher unbekannten Struktur, die aus einem globulären Kopfanteil mit einem Durchmesser von ca. 12 nm und einem ca. 100 nm langen Schwanzteil besteht. Häufig werden aggregierte Formen, die sich aus zwei, vier oder mehreren dieser Strukturen zusammensetzen und die oft mit Kollagen-I-Molekülen assoziiert sind, beobachtet. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme, auf der Undulin in isolierter (Pfeile) und aggregierter Form neben Kollagen I zu sehen ist, ist in Fig. 2 abgebildet (Leiste=100 nm).
In der Aminosäureanalyse (6 M HCl, 24 Stunden, unter Stickstoff bei 110°C) ergibt Undulin eine für große Glykoproteine typische Aminosäurezusammensetzung mit einem hohen Anteil an hydrophoben und sauren Aminosäuren.
Die Aminosäurezusammensetzung ist aus der nachfolgenden Tabelle ersichtlich.
Tabelle 1: Aminosäureanalyse von Undulin
Eine weitere Eigenschaft des Undulins wird anhand von Undulinantikörpern, deren Herstellung später beschrieben wird, deutlich:
Auf unfixierten 4-μm-Kryostatschnitten von Haut oder Leber zeigen Undulinantikörper in der indirekten Immunfluoreszenz ein neuartiges Muster, das sich von allen bekannten Mustern für Bingegewebsproteine unterscheidet. Wie aus Fig. 3 ersichtlich, besteht das Undulinmuster aus wellenförmigen, parallel angeordneten Fibrillen mit einem einheitlichen Durchmesser (ca. 1 μm). Diese typischen wellenförmigen Fibrillenbündel durchziehen das gesamte Interstitium und sind in Basalmembranen nicht vorhanden. In der Immunelektronenmikroskopie dekorieren Antikörper gegen Undulin (mit Ferritin-konjugiertem 2. Antikörper) globuläres Material an der Oberfläche von und zwischen Kollagenfibrillen (und elastischen Fasern), wie in Fig. 4 gezeigt (Leiste = 200 nm).
Das Verfahren zur Herstellung von Undulin ist dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Proteaseinhibitoren
A) Häute von fötalen oder neugeborenen Säugetieren einer Neutralextraktion unterzieht,
B) den Extrakt einer fraktionierten Salzfällung unterzieht,
C) das Präzipitat löst, und durch DEAE-Chromoatographie reinigt, wobei man Undulin als Rohprodukt erhält,
D) das Rohprodukt nach Dialyse und Lyophilisierung weiter durch Extraktion reinigt,
E) das Undulin zur Herstellung der Fragmentierungsprodukte mit neutralen oder sauren Proteasen spaltet, bis man Fragmente mit einem Molekulargewicht ≦ωτ400 000 erhält, und
F) das gemäß Stufe E erhaltene Produkt mittels CM- und DEAE-Cellulose-Chromatographie, Molekularsieb und/ oder HPLC in einem Puffer von pH 3,6-8,2 reinigt.
Vorzugsweise erfolgt die Extraktion gemäß Stufe A), indem man zunächst eine Vorextraktion mit Neutralpuffer zur Entfernung von Serumproteinen und Lipiden durchführt. Dazu verwendet man einen 10-200 mM Neutralpuffer, beispielsweise 50-200 mM Tris · HCl, 4-5 M NaCl vom pH 7-8, 20-200 mM HEPES- oder PIPES-Puffer 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]- ethanesulfonsäure bzw. Piperazin-N,N′-bis(2-ethanesulfonsäure, zusammen mit 0,1-2% eines nicht-ionischen Detergens, beispielsweise Triton X-100. Man verwendet etwa 2-4 l Puffer pro kg Haut (Feuchtgewicht). Daran schließt sich die eigentliche Extraktion an, die vorzugsweise im gleichen Puffersystem und mit der gleichen Menge erfolgt, jedoch bei niedrigerer Ionenstärke durchgeführt wird.
Der Extrakt wird anschließend gemäß Stufe B) einer fraktionierten Salzfällung unterzogen. Im ersten Schritt wird der Extrakt durch Zugabe von Ammoniumsulfat gefällt, bis ein Sättigungsgrad von 20 bis 50% erreicht ist. Das so erhaltene Präzipitat wird dann erneut in 10-200mM Neutralpuffer gelöst, und einer fraktionierten Salzfällung mit einem Alkalihalogenid, beispielsweise NaCl, KCl, unterworfen. Die Hauptmenge des Undulins wird zwischen 1,5 M und 4,5 M gefällt.
Zur Reinigung wird das Präzipitat in Neutralpuffer/1-4 M Harnstoff/0,25-0,5 M NaCl gelöst und mit DEAE-Cellulose behandelt. Die ungebundene Fraktion wird gegen den gleichen Puffer, der jedoch nur 0,01-0,05 M NaCl enthält, dialysiert. Das so erhaltene Präzipitat besteht zu ca. 70% aus Undulin. Der Überstand enthält weiteres Undulin, das man durch Chromatographie an DEAE-Cellulose, wobei man einen Salzgradienten als Elutionsmittel verwendet, in mehr als 90%-iger Reinheit gewinnen kann.
Die Präparate werden durch Dialyse, beispielsweise gegen Essigsäure, von Salzen befreit und lyophilisiert. Das 70%-ige Präparat kann durch Extraktion mit Neutralpuffer oder 0,05-0,5 M Essigsäure, gegebenenfalls in Gegenwart eines nicht-ionischen Detergens, von Verunreinigungen befreit werden, wobei man ein Produkt mit einer Reinheit von mehr als 90% erhält. Durch wiederholte Anwendung dieser Schritte erhält man homogenes und reines Undulin. Die Ausbeute beträgt ca. 200 bis 300 mg/kg Haut (Feuchtgewicht).
Weiter läßt sich Undulin noch reinigen, wie unten für die Fragmente des Undulins beschrieben.
Das gesamte Verfahren wird zweckmäßigerweise bei Kühlraumtemperaturen (4-10°C) und in Gegenwart von Proteaseinhibitoren, beispielsweise Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), N-Ethylmaleimid (NEM), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Sojabohnen-Trypsininhibitor (SBTI), Trasylol und Benzamidinhydrochlorid, durchgeführt.
Undulin ist sehr sensitiv gegenüber neutralen oder sauren Proteasen. Geeignete neutrale Proteasen sind z. B. Trypsin, Thrombin, Plasmin, Elastase, Kathepsin, V8-Staphylokokkenprotease, Chymotrypsin, Papain und Thermolysin. Beispiele geeigneter saurer Proteasen sind Pepsin, saures Kathepsin, Chymosin etc.
Bevorzugte Proteasen sind Trypsin, Elastase, Plasmin, Thrombin, V8-Staphylokokkenprotease und Chymotrypsin, sowie Pepsin.
Proteasefragmente von Undulin mit einem Molekulargewicht von ≦ωτ400 000, vorzugsweise ≦ωτ100 000 sind in neutralen Puffern löslich, unter Wahrung der wesentlichen antigenen Merkmale des Undulins.
So liefert beispielsweise der Abbau des Undulins mit Trypsin bei 30°C über Zwischenstufen mit einem Molekulargewicht von 180 000, 120 000 und 90 000 ein Hauptprodukt mit einem Molekulargewicht von 60 000. Das Endprodukt des Pepsinabbaus bei 40°C besitzt ein Molekulargewicht von 45 000.
Die Fragmente lassen sich mittels CM- und DEAE-Cellulose- Chromatographie, Molekularsieb und/oder HPLC in üblichen Puffern mit einem pH von 3,6 bis 8,2 reinigen. Geeignete saure Puffer sind beispielsweise Acetat- und Zitratpuffer. Geeignete Neutralpuffer wurden bereits oben erwähnt und geeignete alkalische Puffer sind Ammoniumbicarbonat, Natriumacetat.
Undulin und seine Fragmente sind stark antigen wirksam. Zum Beispiel genügt eine dreifache Applikation von 0,3 mg Undulin oder seinen Fragmenten zur Herstellung von hochtitrigen Antiseren. Ein spezifischer Antikörper kann mit Hilfe bekannter Verfahren, z. B. Affinitätschromatographie erhalten werden. Auch mit der monoklonalen Technik lassen sich hochaffine Antikörper gegen Undulin und seine Fragmente herstellen. Derartige Immunreagentien lassen sich in der Immunhistologie, für Zellkulturexperimente, in der Gentechnologie und zum analytischen Nachweis von Undulin und seinen Fragmenten verwenden.
Darüber hinaus dienen die oben erwähnten Antikörper und Antigene zur quantitativen Bestimmung von Undulin und/oder seiner Fragmente in Körperflüssigkeiten, Zellmedien und Extrakten mittels Radio-Immuno-Assay, in ELISA- Fluoreszenz-Immuno-Assay (FIA), Lumineszenz-Immuno-Assay und dergleichen. Es konnte nämlich gezeigt werden, daß Undulin-Antigenität in Körperflüssigkeiten zirkuliert und mit Krankheitsbildern, die das interstitielle Bindegewebe betreffen, wie Entzündungen, fibrotischen Erkrankungen, und Tumorleiden, in Form erhöhter Spiegel korreliert. Undulin und seine Fragmente lassen sich auch in kosmetischen Zubereitungen, wie Lotionen, Gelen, Cremes, zur Verbesserung des Aussehens und des Zustandes der Haut verwenden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Herstellung von Undulin
Die Haut von fötalen oder neugeborenen Affen, Kälbern oder Ratten wird eingeweicht, homogenisiert und in 100 mM Tris 4,5 M NaCl vom pH 7,4, das 2 mM PMSF, 4 mM NEM und 10 mM EDTA als Proteaseinhibitoren enthält, tiefgefroren. Alle Arbeiten erfolgen bei 4°C und in Gegenwart von Proteaseinhibitoren (PI), wenn Puffer verwendet werden, deren pH oberhalb von 4,0 liegt. Das Homogenisat wird zunächst mit 50 mM Tris/PJ/4,5 M NaCl, pH 7,4 und 1% Triton X-100 (31/kg Feuchtgewicht) extrahiert. Der Rückstand wird anschließend mit 50 mM Tris/PI/0,5 M NaCl, pH 7,4 (31/kg Feuchtgewicht) extrahiert. Aus der überstehenden Flüssigkeit erhält man durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 30% (168 g/l) ein Präzipitat. Dieses wird erneut in Tris/PI/0,5 M NaCl (31/kg Feuchtgewicht) gelöst. Die Lösung unterwirft man einer fraktionierten Salzfällung mit NaCl bis zu Endkonzentrationen von 1,7, 2,7 und 4,5 M.
Die Fraktion bei 2,6 M NaCl wird in 50 mM Tris, PI, 0,3 M NaCl, 1-4 M, pH 7,4 Harnstoff gelöst und gegen dieses Gemisch dialysiert. Einen Niederschlag (Kollagen-I- Aggregat) zentrifugiert man ab und die überstehende Flüssigkeit rührt man mit DEAE-Cellulose. Die ungebundene Fraktion dialysiert man gegen Tris, PI, 0,02 M NaCl, pH 7,4, wobei man ein Präzipitat erhält, das aus Undulin, Kollagen I und einem Protein mit einem Molekulargewicht von 35 000 besteht. Das lösliche Material chromatographiert man an DEAE-Cellulose, wobei man nach Elution mit einem Salzgradienten von ungefähr 0,25 M NaCl Undulin mit einer Reinheit von ≦λτ90% erhält.
Die Undulin enthaltenen Fraktionen werden gegen 0,1 M Essigsäure dialysiert und lyophilisiert. Zur weiteren Reinigung wird das Lyophilisat mit 0,5 M Essigsäure, 1% Triton X-100 bei 4°C extrahiert, wobei u. a. verunreinigende Proteine entfernt werden. Auf diese Weise hergestelltes Undulin ist homogen und rein, die Ausbeute beträgt 200 mg/kg eingesetzter Haut (Feuchtgewicht).
Beispiel 2 Trypsinabbau von Undulin
Das lyophilisierte Protein wird zu 1 mg/ml in 0,2 M Na4HCO3/ Essigsäure, ph 7,0, suspendiert und mit Trypsin-TPCK (Serva, Heidelberg) im Enzym:Substrat-Verhältnis 1:50 bei 25°C unter Schütteln abgebaut. Aliquote werden nach 10, 30, 60 Minuten, 4 und 16 Stunden entnommen, mit Trypsininhibitor (Soybean Trypsin-Inhibitor, Serva, Heidelberg) versetzt und lyophilisiert. Der Abbau nach 16 Stunden enthält hauptsächlich ein Peptid vom Molekulargewicht 60 000.
Beispiel 3 Pepsinabbau von Undulin
Für den Pepsinabbau wird Undulin zu 1 mg/1 ml in 0,5 M Essigsäure suspendiert und bei 4-8°C im Verhältnis 1:50 (Enzym zu Substrat) unter Schütteln mit Pepsin (Sigma, Taufkirchen) abgebaut. Nach 6 bis 10 Stunden erhält man als Hauptprodukt ein Fragment mit dem Molekulargewicht 45 000.
Beispiel 4 Herstellung polyvalenter Antiseren und polyklonaler Antikörper
Hochtitrige Antiseren gegen Undulin und seine Fragmente lassen sich folgendermaßen herstellen (von Affen, Kälbern oder Ratten): Man verabreicht 0,2 mg Antigen, das in 0,5 ml Neutralpuffer suspendiert und in 0,5 ml komplettem Freund's Adjuvans emulgiert ist, subkutan. Daran schließen sich in 3-Wochenintervallen zwei weitere Injektionen unter Verwendung von inkomplettem Adjuvans an. Das Antiserum gibt man über säulenimmobilisierte Bindegewebsantigene. Nach ausgiebiger Spülung mit Puffer können zuletzt von immobilisiertem Undulin spezifische Antikörper hoher Affinität eluiert werden.
Beispiel 5 Herstellung monoklonaler Antikörper
8-12 Wochen alte Balb/c Mäuse erhalten s.c. 3-4 Injektionen von 100 μm Undulin bzw. Undulinfragmenten im Abstand von jeweils 2 Wochen. Die erste ist im Verhältnis 1:1 mit Freund'schen Adjuvans (komplett) gemischt, die nächsten sind im Verhältnis 1:1 mit Freund′schen Adjuvans (inkomplett) gemischt.
Nach positivem Antikörpertiter in der Maus wird deren Milz mit isogenen Myelomzellen (NS1) fusioniert und in Gewebekultur gebracht. Positive Antikörper produzierende Zellklone werden subkloniert, um einzelne Antikörper produzierende Zellinien zu erhalten. Der Antikörper kann mit bekannten Methoden aus dem Gewebekulturüberstand bzw. aus der Ascites von als Zellkulturträger dienenden Mäusen gereinigt werden.

Claims (24)

1. Undulin und dessen Fragmentierungsprodukte, dadurch erhältlich, daß man in Gegenwart von Proteaseinhibitoren
A) Häute von fötalen oder neugeborenen Säugetieren einer Neutralsatzextraktion unterzieht.
B) den Extrakt einer fraktionierten Salzfällung unterzieht,
C) das Präzipitat löst, und durch DEAE-Chromoatographie reinigt, wobei man Undulin als Rohprodukt erhält,
D) das Rohprodukt nach Dialyse und Lyophilisierung weiter durch Extraktion reinigt,
E) das Undulin zur Herstellung der Fragmentierungsprodukte mit neutralen oder sauren Proteasen spaltet, bis man Fragmente mit einem Molekulargewicht ≦ωτ400 000 erhält, und
F) das gemäß Stufen D und E erhaltene Produkt mittels CM- und DEAE-Cellulose-Chromatographie, Molekularsieb und/ oder HPLC in einem Puffer von pH 3,6-8,2 reinigt.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Proteaseinhibitoren
A) Häute von fötalen oder neugeborenen Säugetieren einer Neutralsalzextraktion unterzieht,
B) den Extrakt einer fraktionierten Salzfällung unterzieht,
C) das Präzipitat löst, und durch DEAE-Chromoatographie reinigt, wobei man Undulin als Rohprodukt erhält,
D) das Rohprodukt nach Dialyse und Lyophilisierung weiter durch Extraktion reinigt,
E) das Undulin zur Herstellung der Fragmentierungsprodukte mit neutralen oder sauren Proteasen spaltet, bis man Fragmente mit einem Molekulargewicht ≦ωτ400 000 erhält, und
F) das gemäß Stufen D und E erhaltene Produkt mittels CM- und DEAE-Cellulose-Chromatographie, Molekularsieb und/ oder HLPC in einem Puffer von pH 3,6-8,2 reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Neutralsalzextraktion gemäß Stufe A in zwei Stufen durchgeführt wird, wobei die erste Stufe mit einem 10-200 mM Neutralpuffer und die zweite Stufe mit einem Neutralpuffer niedrigerer Ionenstärke erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vorextraktion in Gegenwart von 0,1-2% eines nichtionischen Detergens durchführt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die fraktionierte Salzfällung gemäß Stufe B durchführt, indem man zu dem aus Stufe A erhaltenen Extrakt Ammoniumsulfat gibt, bis ein Sättigungsgrad von 20-50% erreicht ist, das so erhaltene Präzipitat in einem 10-200 mM Neutralpuffer löst und die Lösung einer fraktionierten Salzfällung mit einem Alkalihalogenid unterwirft.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung gemäß Stufe C durchführt, indem man das aus Stufe B erhaltene Präzipitat in 10-200 mM Neutralpuffer/1-4 M Harnstoff/ 0,25-0,5 M NaCl löst und mit DEAE-Cellulose behandelt, und die ungebundene Fraktion gegen den gleichen Puffer, der 0,01-0,05 M NaCl enthält, dialysiert, wobei man ein Präzipitat von 70-%igem Undulin erhält.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den nach der Dialyse erhaltenen Flüssigkeitsüberstand durch Chromatographie an DEAE-Cellulose unter Verwendung eines Salzgradienten als Elutionsmittel reinigt, wobei man Undulin von mehr als 90-%iger Reinheit erhält.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung gemäß Stufe D durchführt, indem man gegen die Essigsäure dialysiert, lyophilisiert und das Lyophilisat mit 10-200 mM Neutralpuffer oder verdünnter Essigsäure, gegebenenfalls mehrmals, extrahiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die Extraktion in Gegenwart von 0,1-2% eines nichtionischen Detergens durchführt.
10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet daß man als Protease zur Spaltung des Undulins Trypsin, Elastase, Plasmin, Thrombin, V8-Staphylokokkenprotease, Chymotrypsin, und/oder Pepsin verwendet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man Trypsin oder Pepsin verwendet.
12. Verwendung der Produkte nach Anspruch 1 zur Herstellung von Antikörpern, für immunologische Nachweismethoden und zur Diagnose, Prognose und Verlaufskontrolle fibrotischer, entzündlicher und tumoröser Erkrankungen.
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