RU1802814C - Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получени @ -амидированного пептида - Google Patents

Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получени @ -амидированного пептида

Info

Publication number
RU1802814C
RU1802814C SU864027596A SU4027596A RU1802814C RU 1802814 C RU1802814 C RU 1802814C SU 864027596 A SU864027596 A SU 864027596A SU 4027596 A SU4027596 A SU 4027596A RU 1802814 C RU1802814 C RU 1802814C
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
enzyme
peptide
protein
alpha
amidating
Prior art date
Application number
SU864027596A
Other languages
English (en)
Inventor
П.Джиллиган Джеймз
Н.Джоунз Бэрри
Original Assignee
Юниджин Лабораторис, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24628603&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU1802814(C) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Юниджин Лабораторис, Инк. filed Critical Юниджин Лабораторис, Инк.
Application granted granted Critical
Publication of RU1802814C publication Critical patent/RU1802814C/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
    • C12Y114/17003—Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Использование: биотехнологи , медицина , биохими , получение лекарственных препаратов. Сущность изобретени : объектами данного изобретени   вл ютс  способ очистки а -амидирующей монооксигеназы и способ получени  а -амидированного пеп- тида. Пептидил-глицинова  а, -амидирую- ща  монооксидаза представл ет собой фермент, экстрагируемый из раковых линий клеток и тканей медулл рной железы, имеющий молекул рную массу примерно 60000-65000 дальтон. Она в такой степени очищена, что использование электрофоре- тической процедуры, осуществл емой на гел х додецилсульфат натри -полиакриламид обнаруживает единую гомогенную хорошо выраженную полосу, и имеет удельную ферментную активность не менее.50 мЕд на мг белка. Свободный или иммобилизованный фермент в присутствии ионов двухвалентной меди, аскорбата и кислорода может использоватьс дл  получени  а-амидированного белка из полипептидно- го субстрата, содержащего глициновый радикал с концевой карбоксильной группой. Изобретение охватывает также способ пол- ; учени  а -амидирующего пептида из пеп- тидных или полипептидных субстратов, содержащих концевую глициновую остаточную группу, путем химического взаимодействи  данного субстрата с кислородом в присутствии очищенного фермента, аскор- бэта или меди. 1 ил. 00 о кэ 00

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии и биохимии.
Известен фермент, обладающий а-амидирующей активностью, присутствующий в
свином гипофизе, очищенный с использованием сефагел -100 до такой степени, что обнаруживает минимальную кажущуюс 
молекул рную массу примерно 60000 даль- тон.
Целью объекта изобретени  способ очистки а-амидирующей монооксигеназы  вл етс  улучшение качества и чистоты целевого продукта.
Целью  вл етс  ускорение способа и повышение выхода целевого продукта.
Предложенный способ обеспечивает очистку а -амидирующей монооксигеназы экстрагированной из раковых клеток меду- л рной железы, в частности, ткани IVI-10028 спинномозговой карциономы крысы или ее клеточной линии IVI-10029, имеющей молекул рную массу примерно от 60000 до 65000 дальтон, в такой степени, что электрофоре- тический процесс, осуществл емый на гел х додецилсульфат натри /полиакриламид, обнаруживает одну единственную гомогенную четко выраженную полосу, и котора  имеет удельную ферментную активность не менее 50 м Ед на мг белка (1 Ед. конверси  . одного миллимол  Дансил-Д-тир-Вал-Гли- COQH в 1 миллимоль Данси-Д-Тир-Вал-Со На в минуту при 37°С и при величине ,0).
Данный фермент был экстрагирован из раковых клеток медулл рной железы крысы , котора  была привита крысам WAG/Rij Wistar, как описано Roos В.А. и др., Endocrinology; 1979 г., том 150, № 1, стр. 27-32. Эта ткань хранитс  под официальным номером 1VI-10028. Данный фермент был экстрагирован также из других источников , главным образом, раковых линий клеток медулл рной железы человека и крысы. Лини  клеток крысы 77(74) была выделена из раковых новообразований медулл рной железы крысы путем последовательных операций, как описано Muszynshi M., и др. JBC 1983 г., том 258, стр. 1167-1183. Эта лини  клеток хранитс  под официальным -номером IVI-10029.
Данный фермент выдел ют и очищают путем первоначальной обработки, гомогена- та ткани методом ионообменной хроматог- рафии. Так, например, образец может быть подвергнут общей весовой нагрузке в пре- паративной анионообменной колонке, наполненной , например, смолой ДЕ-52, Whatman, Limited. Продукт, содержащий монооксигеназу с а-амидирующей активностью , затем подвергают хроматографии исключени  с использованием смолы с подход щей раздел ющей способностью, например в колонке с наполнителем Sephacryl S-200 очень сильной степени помола . Фракцию элюента, содержащую активный фермент, затем подвергают обработке методом ионообменной хроматографии с использованием сильно анионообменной смолы. Смола, котора  может использоватьс  дл  данной цели, представл ет собой сильную анионообмен- ную смолу Mono Q HR5/5, поставл емую Pharmacia Fine Chemicals, и дл  гомогенной очистки фермента может потребоватьс  один или более проходов через колонку. В каждом этапе очистки может осуществл тьс  контроль как содержани  белка, так и степени активности а -амидировани . Данна  информаци  используетс  дл  расчета удельной активности фермента, котора  служит показателем относительной чистоты
фермента.
Очищенна  пептидил-глицинова а-ами- дирующа  монооксигеназа используетс  дл  амидировани  альфа-карбоксильной группы полипептида, имеющего концевую глициноВуЮ остаточную группу, где глицинова  группа функционирует как донор аминогруппы . Пептидный или полипептидный субстрат может быть очищен от естественных источников, синтезированных из составл ющих его аминокислот, или может быть получен1 методами рекомбинантной ДНК, Полипептид с концевым глицином соедин етс  с кислородом в присутствии эффективного количества фермента. Количество
требуемого фермента зависит от различных параметров, хорошо известных, включающих , в частности, (но ограничивающихс  ими) следующие: удельна  активность данного ферментного препарата, количество и
химическа  природа подвергаемого конверсии субстрата, врем , в течение которого происходит конверси , и температура и величина рН реакционной смеси. Специалистам в данной области известны другие
0 .параметры, которые могут вли ть на точное количество фермента, требуемого дл  данного процесса. Кислород обычно используетс  в стехиометрическом количестве, но избыток кислорода не оказывает вредного
5 вли ни  на реакцию. Наличие ионов меди также необходимо, и эти ионы могут обеспечиватьс  любой солью меди, котора  не оказывает вредного вли ни  на реакцию, Когда фермент имеет удельную ферментную ак0 тивность примерно 1 м Eg/мг белка, то максимальное а -амидирование происходит при концентрации ионов двухвалентной меди 4,7 мкМ. По мере.увеличени  степени чистоты фермента необходима  концентра5
ци  экзогенного иона двухвалентной меди снижаетс . Ферментна  активность может быть увеличена за счет присутстви  ионов аскорбата, наличие которых обеспечиваетс  любой солью, пока катион данной соли не
оказывает нежелательного вли ни  на реакцию . Дл  очищенного фермента с удельной ферментной активностью примерно 50 м.Ед/мг белка максимальна  активность а-амидировзни  имеет место при концентрации аскорбата примерно 5,5 мМ. Активность о. -амидировани  может быть увеличена путем введени  каталазы. Оптимальна  величина рН реакции о. -амидировани  составл ет от 6,5 до 7,5,
Альфа-амидирующа  активность очищенной монооксигеназы, отвечающей насто щему изобретению, была продемонстирована с использованием субстрата радиоиодированного Д-Тир-Вал-Гли, пептида, последовательность которого имитирует карбоксильную концевую группу ме- ланноцита,стимулирующего предшественник гормона. Анализы осуществл ют в 100 мМол, буферном растворе TES (М-трис(оксиметил)метил-2-аминоэтан- сульф&кислота), ,0, при температуре 37°С в течение трех часов, Продукт, / 1/Тир-Вал-ЬШ2, выдел ют из субстрата методом катионообменной хроматографии. Была продемонстрирована также активность амидирующего фермента с использованием синтетического субстрата, который имитировал последовательность карбоксильной концевой группы кальцитонина, /Тир Гли /кальцитонина,и с использовав нием в качестве субстрата фактора высвобождени  гормона роста человека, выделенного из рекомбинантного микроорганизма .
Хот  данное изобретение описано со ссылкой на предпочтительные принципы его осуществлени , дл  специалистов в данной области должно быть  сно, что могут быть многие варианты и модификации.
П р и м е р 1. Способ очистки альфа-ами- дирующей монооксигеназы из опухолевых тканей мозговой тироидной карциномы.
Замороженные опухолевые ткани мозговой тироидной карциномы крысы измельчают до крошечных фрагментов и гомогенизируют в 150 мМ Трис, рН 7,5, содержащем 250 мМ сахарозы, 0,25% М-аце- тилглюкопиранозида, 0,1 PMSF, 20 мкг/мл пепстатина и 100 мкг/мл ингибитора трипсина соевых бобов.
Обычно гомогенизируют 25 грамм в опухолевой ткани в 200 мл вышеуказанного буфера на льду. Гомогенизацию осуществл ют в четыре импульса по 20 секунд каждый с использованием гомогенизатора Polytron (Brinkman) при установке на 7. Гомогенат подвергают центрифугированию в течение 15 минут при Э.ОООхд в роторе
IA-20 (Beckman), а всплывшее вещество (svp. 1) отстаиваетс . Осадок вновь гомогенизируют в 60 мл гомогенизационногр буфера в ходе 3 импульсов по 20 секунд 5 каждый при установке на 7, Этот второй гомогенат подвергают аналогичному центрифугированию в течение 15 минут при Э.ОООхд,
Всплывшее вещество после этого цент0 рифугировани  (svp.2) соедин ют с svp.1. Соединенные svp.1 и svp,2 затем центрифугируют 30 минут при 100.000хд в роторе sw28 (Beckman) при 4°С. К осветленному . гомогенату (svp.3) добавл ют достаточное
5 количество кристаллов сульфата аммони  дл  получени  25%-ного раствора сульфата аммони , Добавление кристаллов производ т постепенно в течение 15 минутного периода с посто нным перемешиванием
0 гомогената при 4°С. Спуст  дополнительно 30 мин перемешивают при 4°С, смесь центрифугируют 15 минут при 27.000хд в роторе IA-20 (Beckman) при 4°С. Всплывшее вещество декантируют и добавл ют дополни-«
5 тельное количество сульфата аммони  к всплывшему веществу до получени  раствора с 40% сульфата аммони . После дополнительных 30 минут перемешивани  смесь вновь центрифугируют 15 минут при
0 27.000хд согласно вышеуказанному. Всплывшее вещество после этого центрифугировани  отбрасывают, а осадок, который содержит по крайней мере 50% активности фермента в гомогенате, вновь
5 перевод т в суспензию в 50 мМ Трис HCI, рН 7,0 дл  получени  пробы. Активность составл ет 8,2 mv/мг белка. Затем осуществл ют хроматографическое разделение, использу  следующие этапы.
0 Гель-фильтраци  с сефакрилом S-300.
Вытеснительна  хроматографи  (по размеру).
Сефакрил S-300 (Pharmacia) уравновешивают в 50 мМтрис HCI, рН7,0 и выливают
5 .в колонку К 50/100 (Pharmacia) согласно инструкци м изготовител . Объем сло  колонки составл ет примерно 1,3 литра. Пробу загружают в колонку в объеме, представл ющем примерно 3% объема сло  колонки.
0 Белки элюируют из колонки в 50 мМ Трис HCI, рН 7,0, при протоке примерно 2 мл в минуту. Фракции по 10 мл собирают и испытывают в отношении альфа-амидирующей монооксигеназной активности с использо5 ванием субстрата Dansyl-D-Tyr-Vrl-Cly. Фермент, элюированный из колонки в единичном пике активности, характеризуетс  молекул рной массой от 60.000 до 65.000 дальтон. Активность составл ет по крайней мере 50 mv/мг белка.
Моно Q Хроматографи  при рН 6,0 Сильна  анионообменна  хроматогра- фи .
Фракции с колонки из Сеф.акрила S-300, содержащие максимальную ферментную активность, сливают и диализируют с использованием 4 литров 20 мМ бис-Трис буфера рН 6,0. Объединенные фракции затем помещают на колонку Моно Q HR 5/5 (Фармаци ), котора  предварительно обрабатывалась в соответствий с инструкци ми производител , и уравновешивались в 20 мМ бис-Трис с рН 6,0. После Tqro, как белки, не св зывающиес  с колонкой, собирались в элюенте с колонки (проток через колонку), св занные белки элюируют с помощью 20 мМ бис-Трис с рН 6,0 с линейным солевым градиентом 0-300 мМ NaCI. Колонка работает при скорости протока 0,5 мл в м инуту, и собирают фракции, кажда  по 2 мл. Раствор белков, элюируемый с моно Q колонки при рН 6,0, немедленно нейтрализуетс  путем сбора его в пробирки, содержащие кажда  200 мкл 1,0 М Трис с рН 7,0. Фракции анализируют на альфа-амидирующую моно- оксигеназную активность, как и раньше, и наблюдают пик активности, который элюируют с колонки приблизительно при 160 мМ NaCI. Активность составл ла 161 м Ёд/мг белка.
Моно Q хроматографи  при рН 8,0 Фракции, содержащие пик альфа-ами- дирующей ферментнрй активности, от Моно Q хроматографии при рН 6,0 диализируют с использованием двух обменов каждый по 4 литра 50 мМ Трис HCI с рН 8,0. Фермент затем помещают на Моно Q HR 5/5 колонку (Фармаци ), уравновешенную 50 мМ Трис HCI с рН 8,0. Белки элюируют в 50 мМ Трис HCI рН 8,0 с солевым градиентом 0-300 мМ NaCI. Используют скорость протока 0,5 мл в минуту, и собирают фракции по 2 мл. Каждую фракцию нейтрализуют добавлением 200 мкл 1,0 М Трис рН 7,0 в каждую из собирательных пробирок. Наблюдают два отчетливых пика ферментной активности при элюировании соответственно при 190 м М NaCI и 220 мМ NaCI. Активности составл ют соответственно не менее 80 м Ед/мг белка и 400 м Ед/мг белка.
Электрофоретический анализ чистоты ферментного препарата с использованием окрашенного серебром SDS полиакрила- мидного гел  на каждой стадии очистки приведен на ,фиг. 1. Полоса 1: маркеры молекул рного веса (0,5 мкг каждого белка); полоса 2: плавающий на поверхности слой нейтрального экстракта ткани после высокоскоростного центрифугировани  (6,9 мкг); полоса 3: осадок 26-46% сульфата аммони 
(4,7 мкг) от высокоскоростного отделени  плавающего на поверхности сло ; полоса 4: размерно-эксклюзионна  хроматографи  осадка сульфата аммони  (4,4 мкг); полоса 5:
анионообменна  хроматографи  при рН 6,0 (0,5 мкг); полоса 6: анионообменна  хроматографи  при рН 8,0.
Полосы 2-6 показывают ферментный состав на последовательных стади х процесса очистки. Трэк 1 показывает маркеры молекул рного веса и не соответствует ферментному составу. Активность состава, соответствующего трэку 2, равна 2.97х103. Активность состава, соответствующего трэку 3, равна 1,89x10 . Состав, соответствующий трэку 4S имеет активность 1,23x10 , Активность х; состава, соответствующего трэку 5, равна 7,90x10 . Состав, соответствующий трэку 6, имеет активность 2,07 х
х106.%
П р и м е р 2. Получение вещества Р. а -Амидирование биологически уместных / релевантных пептидных гормонов с использованием фермента а -амидировани .
Несколько субстратов рекомбинантно-. го и синтетического пептидного гормона, включающих субстраты лососевого и человеческого кальцитонина, фактов высвобождени  человеческого гормона роста, пептид, родственный гену человеческого кальцитонина , и вещество Р человека, получались и успешно а -амидировались с помощью фер- . ментного препарата а -амидировани  данного изобретени . Поскольку скорость а-амидировани  зависит от первичной структуры субстрата, дл  каждого пептидного предшественника услови  реакции, требуемые дл  достижени  эффективных скоростей а -амидировани , должны оптимизироватьс . С целью иллюстрации ниже описана методика, разработанна  дл  а-амидировани  предшественника вещества Р.
. Вещество Р  вл етс  П-членным пептид- ным гормоном, имеющим а -амидирован- ный метионильный остаток на карбоксильном конце. Пептидный предшественник , содержащий последовательность
вещества Р, с раст жением карбоксил-концевого глицила, приготавливалс  с помощью синтетических методов и использовалс  в качестве опытного (тест) субстрата дл  фермента а -амидировани .
при оптимизированных услови х реакции под действием фермента «-амидировани  предпоследний метионильный остаток пептидного предшественника быстро превращаетс  в метионин-амид. Соответствующа 
процедура данного превращени  заключаетс  в следующем. Лиофилизованный пеп- тидный субстрат (раст нутый глицином предшественник вещества Р, 300 наномо- лей) раствор етс  в 100 мкл 150 мМ TES буфера, рН 7. К данному раствору субстрата добавл етс  50 мкл (приблизительно 1,2 мЦ) ферментного препарата а-амидйровани . Фермент может происходить или из опухолевой ткани крыс МТС ил из отработанной тканевой культуральной среды от клеточной линии крыс МТС СА-77. Фермент должен очищатьс  до такой степени, чтобы вс  посторонн   протеолитическа  активность была удалена. Это обычно достигаетс  с помощью сочетани  ионообменной и размер- но-эксклюзионной хроматографии. Реакци  а-амидировани  затем инициируетс  путем добавлени  100 мкл свежеприготовленной смеси, содержащей этанол (2,5%, объем/объем ), каталазу (0,25 мкг/мкл), L-аскор- биновую кислоту (25 мМ) и Твин-20 (0,025% обьем) (объем). Указанна  выше реакционна  смесь тщательно смешиваетс  и инкубируетс  при 37°С. Эти реакционные услови  обычно дают 100% превращение предшественника вещества Р ва-амидиро- ванный продукт менее, чем за 60 минут. Очистка продукта может быть легко достигнута с помощью обратно-фазной жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности,
П р и м е р 3. Фактор высвобождени  гормона роста человека (ФВГРч) представл ет собой гормон пептида с 44 членами, содержащий альфа-амидированный лейци- ловый остаток на своем карбоксильном окончании. Ген белка сли ни  дл  ФВГРч был создан так, что аминокислотна  последовательность дл  гормона пептидз была сгруппирована триптофанильным остатком на его окончании амино-,а на его карбоксильном окончании - глициловым остатком, который также завершал рекомбинантный белок сли ни , ФВГРч-содержащий белок сли ни  изолировали от лизатов рекомби- нантного микроорганизма осаждением. Часть без ФВГРч белка сли ни  денатурировали путем превращени  цистеинильных радикалов в производные S-сульфоната. Так как ФВГРч не содержит триптофана, химическое разложение рекомбинантного белка сли ни  с реагентом BNPS-скатол расщепл ло окислением белок сли ни , создава  таким образом неамидированный ФВГРч с карбоксил-терминальным удлинением глицина. Одновременно с этим, мети- ониловый радикал в положении 27 в молекуле ФВГРч окисл лс  до сульфоксида
метионина. Этот пептид с глициновым удлинением изолировали с использованием гель-фильтрации и жидкостной хроматографии высокого разрешени  с обращенной 5 фазой. Его структуру устанавливали аминокислотным анализом фрагмента пептидов, полученных в результате переваривани  с использованием трипсина.
Предпоследний радикал лейцила пре0 вращали в лейцинамид с помощью воздействи  альфа-амидирующего фермента согласно насто щему изобретению, Пример условий, используемых дл  приготовлени  альфа-амидированного ФВГРч, будет та5 ким. Лиофилизированный субстрат пептида (20-40 наномолей) раствор ли в 150 мл деи- онизировзнной воды и смешивали с 90 мкл (500 мкед) (рН 7,0) препарата альфа-амидирующего фермента, производного либо из
0 опухоли МТС крысы или из использованной среды дл  культивировани  тканей из клеточной линии СА-77 крысы. Фермент очищали дл  удалени  вс кой посторонней активности протеолитического фермента в
5 результате сочетани  хроматографии с вытеснением по размеру и ионообменной хроматографии , Добавл ли аскорбиновую кислоту и сульфат меди затем к смеси фермента и субстрата в достаточном количестве
0 дл  получени  концентраций в 3 мМ и 2 мкМ, соответственно. Полученный раствор смешивали и инкубировали при 37°С в течение 4-6 ч. Типичный процент превращени  субстрата в продукт составл ет 95% на ос5 нове аминокислотного анализа фрагментов, высвобожденных при переваривании с трипсином. И, наконец, остаток сульфоксида метионина был восстановлен до метионина воздействием бэта-меркаптоэтанола
0 4М в буфере при рН 4 с Ю.мМ ацетата натри  при 80°С в течение одного часа. Конечный продукт очищали высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой и характеризовали его
5 временем удержани , анализом триптиче- ского переваривани  и аминокислотного анализа. Рекомбинант, альфа-амидированный продукт, также испытывали на биологическую активность, Во всех случа х
0 рекомбинантный ФВГРч был неотличим от синтетического ФВГРч.

Claims (4)

  1. Формула изобр е т е н и   1. Способ очистки пептидилглициновой а -амидирующей монооксигеназы из исход5 ного гомогената ткани животного, отличаю- щ и и с   тем, что, с целью улучшени  качества и чистоты целевого продукта, гомогенат подвергают анионообменной, хроматографии и полученную фракцию, содержащую фермент , подвергают хроматографии исключени  по размеру с использованием хроматог- рафического носител , способного к выделению фермента с мол.м. 60-65 кД и удельной активностью не менее 50 мЕд/мг белка, после чего фракцию элюента, содержащую фермент, подвергают сильной анио- нообменной хроматографии.
  2. 2. Способ по п. 1, отличаю щи и с   тем, что используют ткань 1V1-10028 спинномозговой карциономы крысы или ее клеточной линии 1V1-10029.
  3. 3. Способ получени  а-амидмрованно- го пептида, включающий контактирование субстрата с пептидилглициновой альфаа- мидмрующей монооксигеназой в присутствии кислорода и восстановител  с
    0
    последующим выделением целевого продукта , отличающийс  тем, что, с целью ускорени  способа и повышени  выхода целевого продукта, субстрат контактируют с монооксигеназой, имеющей мол.м, 60-65 кД и удельную активность не менее 25 мЕд/мг белка,
  4. 4. Способ по п. 3, отличающийс  тем, что в качестве субстрата используют пептид, получаемый с помощью синтеза ин- витро, или природный пептид, или пол- ипептид, или пептид, или полипептид, получаемый с помощью технологии реком- бинантных ДНК.
    Mr
    1 23456
SU864027596A 1984-09-27 1986-05-26 Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получени @ -амидированного пептида RU1802814C (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/655,366 US4708934A (en) 1984-09-27 1984-09-27 α-amidation enzyme

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU1802814C true RU1802814C (ru) 1993-03-15

Family

ID=24628603

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU864027596A RU1802814C (ru) 1984-09-27 1986-05-26 Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получени @ -амидированного пептида

Country Status (13)

Country Link
US (1) US4708934A (ru)
EP (1) EP0201511B1 (ru)
JP (1) JP2594037B2 (ru)
AT (1) ATE92522T1 (ru)
CA (1) CA1341037C (ru)
DE (1) DE3587506T2 (ru)
DK (1) DK241486D0 (ru)
FI (1) FI100993B1 (ru)
HU (1) HU195857B (ru)
LT (1) LT2661B (ru)
NO (1) NO862100L (ru)
RU (1) RU1802814C (ru)
WO (1) WO1986002099A1 (ru)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6319685B1 (en) * 1984-09-27 2001-11-20 Unigene Laboratories, Inc. Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use
DE3612302A1 (de) * 1986-04-11 1987-10-15 Hoechst Ag Chromophore peptide, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung zum nachweis der peptidylglycin-(alpha)-amidierenden monooxygenase
JPH0775541B2 (ja) * 1986-06-07 1995-08-16 壽之 松尾 Ｃ末端アミド化酵素及びその製造方法
JP2598050B2 (ja) * 1987-07-17 1997-04-09 サントリー株式会社 Ｃ−末端α−アミド化酵素
US5821083A (en) * 1987-07-17 1998-10-13 Suntory Limited Recombinant C-terminal α-amidating enzyme
US5789234A (en) * 1987-08-14 1998-08-04 Unigene Laboratories, Inc. Expression systems for amidating enzyme
US6255067B1 (en) * 1987-09-15 2001-07-03 The Johns Hopkins University cDNA encoding peptidyl-glycine alpha-amidating monooxygenase (PAM)
JP2653820B2 (ja) * 1988-03-14 1997-09-17 壽之 松尾 アミド化酵素及びその製造方法
DE68917154T2 (de) * 1988-05-30 1994-12-22 Shiseido Co Ltd C-terminus-amidierungsenzym-zusammensetzung, verfahren zur herstellung und verwendung.
JP2512575B2 (ja) * 1988-05-30 1996-07-03 株式会社資生堂 Ｃ末端アミド化酵素組成物、調製方法および使用
JP2845468B2 (ja) * 1989-01-17 1999-01-13 サントリー株式会社 ヒト甲状腺由来Ｃ―末端α―アミド化酵素
US5871995A (en) * 1989-08-15 1999-02-16 Shiseido Company, Ltd. Purified enzymes participating in C-terminal amidation
EP0448513A3 (en) * 1990-03-21 1991-12-27 Japat Ltd Process for production of peptidylglycine alpha-hydroxylating monooxygenase and use thereof
US5580751A (en) * 1990-09-14 1996-12-03 Carlsberg A/S Process for the preparation of C-terminally amidated peptides
DK220890D0 (da) * 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
JP2774769B2 (ja) * 1993-04-26 1998-07-09 賢治 寒川 アドレノメデュリン
WO1997013410A1 (en) * 1995-10-13 1997-04-17 Boston Medical Center Corporation Hybrid molecules containing amidated polypeptide binding ligands
US5912014A (en) * 1996-03-15 1999-06-15 Unigene Laboratories, Inc. Oral salmon calcitonin pharmaceutical products
AU742270B2 (en) 1997-04-16 2001-12-20 Enteris Biopharma, Inc. Direct expression of peptides into culture media
US6507788B1 (en) 1999-02-25 2003-01-14 Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Rational selection of putative peptides from identified nucleotide, or peptide sequences, of unknown function
US8088734B2 (en) 2003-01-21 2012-01-03 Unigene Laboratories Inc. Oral delivery of peptides
US7445911B2 (en) * 2004-11-24 2008-11-04 Unigene Laboratories Inc. Enzymatic reactions in the presence of keto acids
DE102004058306A1 (de) * 2004-12-01 2006-07-27 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Verfahren zur Herstellung von Carboxy-terminal amidierten Peptiden
PA8660701A1 (es) 2005-02-04 2006-09-22 Pfizer Prod Inc Agonistas de pyy y sus usos
EP1907561B1 (en) * 2005-06-24 2013-08-28 Unigene Laboratories, Inc. Cell lines for expressing enzyme useful in the preparation of amidated products
US8377863B2 (en) 2007-05-29 2013-02-19 Unigene Laboratories Inc. Peptide pharmaceutical for oral delivery
EP2172550B1 (en) * 2007-06-29 2014-08-06 Daiichi Sankyo Company, Limited C-TERMINAL-alpha-AMIDATED RECOMBINANT ENZYME DERIVATIVE
ES2622877T3 (es) * 2009-01-22 2017-07-07 Keybioscience Ag Tratamiento para la obesidad
WO2011067283A1 (en) 2009-12-01 2011-06-09 Novo Nordisk A/S Novel peptidyl alpha-hydroxyglycine alpha-amidating lyases
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
ES2712805T3 (es) 2011-06-15 2019-05-14 Resother Pharma Aps Næsseslottet Productos farmacéuticos antiinflamatorios
US9533022B2 (en) 2011-11-02 2017-01-03 KeyBioscience A/S Peptide analogs for treating diseases and disorders
JP6170933B2 (ja) 2011-11-02 2017-07-26 キーバイオサイエンス・アクチエンゲゼルシャフト ペプチドの使用
HUE039105T2 (hu) 2011-11-02 2018-12-28 Keybioscience Ag Kalcitonin mimetikumok betegségek és rendellenességek kezelésére
DK3068796T3 (en) 2013-11-14 2018-03-05 Keybioscience Ag CALCITONIN MIMETICS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND DISORDERS
WO2015084875A1 (en) 2013-12-02 2015-06-11 Stealth Peptides International, Inc. Compositions and methods for treating vitiligo
US10576124B2 (en) 2014-05-28 2020-03-03 Stealth Biotherapeutics Corp Therapeutic compositions including frataxin, lactoferrin, and mitochondrial energy generating enzymes, and uses thereof
WO2015183988A1 (en) 2014-05-28 2015-12-03 Stealth Peptides International, Inc. Therapeutic compositions including therapeutic small molecules and uses thereof
US10627392B2 (en) 2014-06-17 2020-04-21 Stealth Biotherapeutics Corp Methods of identifying and monitoring mitochondrial dysfunction using monocyte screening
GB201500263D0 (en) 2015-01-08 2015-02-25 Keybioscience Ag Calcitonin analogues for treating diseases and disorders
US9833411B2 (en) 2015-01-12 2017-12-05 Enteris Biopharma, Inc. Solid oral dosage forms
WO2016130899A1 (en) 2015-02-13 2016-08-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Peptide inhibition of ccr3-mediated diseases or conditions
GB201704429D0 (en) 2017-03-21 2017-05-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201707955D0 (en) 2017-05-18 2017-07-05 Keybioscience Ag Dual amylin and calcitonin receptor agonists for treating diseases and disorders
GB201813677D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Calcitonin mimetics for treating diseases and disorders
GB201813678D0 (en) 2018-08-22 2018-10-03 Keybioscience Ag Acylated calcitonin mimetics
JP2022543056A (ja) 2019-07-29 2022-10-07 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ ユニヴァーシティ オブ イリノイ 創傷治癒を促進するための組成物および方法
GB202001024D0 (en) 2020-01-24 2020-03-11 Key Bioscience Ag Oxyntomodulin mimetics

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6319685B1 (en) * 1984-09-27 2001-11-20 Unigene Laboratories, Inc. Alpha-amidating enzyme compositions and processes for their production and use

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bradbury A.F., M.D.F. Finnil and D.G . Smyth Mechanism of C-termihal amide formation by pituctary enzymes Nature 298, p. 686-688, 1982., BradburyA.F., SmytheD.C., BB.R.C., 112, №2, p. 372-377, 1983. Eipper B.A., R.E. Mains and C.C. Glembotski. Identification in pituitary tissne of a peptide a-amidation acivlty that acts on glycine extended peptides and requires molecular oxygen copper and ascorbls acid Proc: NatlAcad Sci USA, 80,5144-5148,1983. Landymore A.E. N. et al., B.B.RiC. vol. 117, N 1, p. 289-293, 1983. *

Also Published As

Publication number Publication date
FI94361C (fi) 1995-08-25
LT2661B (lt) 1994-04-25
JPS62500560A (ja) 1987-03-12
AU594026B2 (en) 1990-03-01
FI862216A0 (fi) 1986-05-26
NO175214C (ru) 1994-09-14
DK241486A (da) 1986-05-23
EP0201511A1 (en) 1986-11-20
WO1986002099A1 (en) 1986-04-10
FI862216A (fi) 1986-05-26
DE3587506D1 (en) 1993-09-09
NO862100L (no) 1986-05-27
FI100993B1 (fi) 1998-03-31
JP2594037B2 (ja) 1997-03-26
FI94361B (fi) 1995-05-15
DK241486D0 (da) 1986-05-23
AU4802785A (en) 1986-04-17
EP0201511B1 (en) 1993-08-04
CA1341037C (en) 2000-06-27
HU195857B (en) 1988-07-28
EP0201511A4 (en) 1988-05-31
US4708934A (en) 1987-11-24
HUT41444A (en) 1987-04-28
NO175214B (ru) 1994-06-06
DE3587506T2 (de) 1994-01-13
ATE92522T1 (de) 1993-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU1802814C (ru) Способ очистки пептидилглициновой @ -амидирующей монооксигеназы и способ получени @ -амидированного пептида
MONTECUCCHI et al. Isolation and amino acid composition of sauvagine: an active polypeptide from methanol extracts of the skin of the South American frog Phyllomedusa sauvagei
Kangawa et al. α-neo-endorphin: A “big” leu-enkephalin with potent opiate activity from porcine hypothalami
Sandberg et al. Purification and partial characterization of a soluble elastin-like protein from copper-deficient procine aorta
RU2080385C1 (ru) α -АМИДИРУЮЩАЯ МОНООКСИГЕНАЗА (ВАРИАНТЫ) И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ a -АМИДИРОВАННОЙ ФОРМЫ РЕГУЛЯТОРНОГО ПОЛИПЕПТИДА
Audhya et al. Complete amino acid sequences of bovine thymopoietins I, II, and III: closely homologous polypeptides
Li et al. Human pituitary growth hormone: XIX. The primary structure of the hormone
Hofmann et al. An approach to the targeted attachment of peptides and proteins to solid supports.
WEDEKiND et al. Hormone binding site of the insulin receptor: analysis using photoaffinity-mediated avidin complexing
EP0128849A1 (en) Purified transforming growth factor-beta derived from human platelets and placentas
Karelin et al. Proteolytic degradation of hemoglobin in erythrocytes leads to biologically active peptides
Acharya et al. Crosslinking of elongation factor EF-G to the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli
Houen et al. Human placental calreticulin: purification, characterization and association with other proteins
TSURU et al. Isolation and amino acid sequence of a peptide containing an epoxide-reactive residue from the thermolysin-digest of Scytalidium lignicolum acid protease B
Bansal et al. Expression of fatty acid-binding proteins in the developing mouse mammary-gland
US4409141A (en) Peptides for assaying human parathyroid hormone
Sanger et al. A study of the products from a polynucleotide-directed cell-free protein synthesizing system
Hong et al. Isolation and characterization of a soluble, immunoactive peptide of glial fibrillary acidic protein
OGAWA et al. Studies on peptides. LXXVIII. Synthesis of the nonacosapeptide corresponding to the entire amino acid sequence of avian glucagon (duck)
EP0085220A2 (en) Method for purification of anterior pituitary hormones
Westman A soluble, stable polyelectrolyte derivative of trypsin
US4370312A (en) Decapeptide
Fujisawa et al. In vitro and in vivo association of dentin phosphophoryn with a1CB6 peptide of type I collagen
Yeh et al. Isolation of two bovine amelogenin peptides and their amino acid sequences
JPH01500188A (ja) ヘパトーム由来成長因子