HU195857B - Process for production of alpha amidated peptides or polipeptides - Google Patents

Description

A natív fehérjék prekurzor formáinak sejten belüli műveleteit (hasítás és/vagy funkcionális csoport módosítás) a kódoló nukleinsav-szekvenciákból való transzlációjukat követően már világosan dokumentálták.

Általában az emlős sejtek és más eukarióták végre tudnak hajtani bizonyos transzláció utáni feldolgozási folyamatokat, míg a prokarióták ezt nem tudják elvégezni. Bizonyos prokariólakat, mint pl. E. colit, széles körben alkalmaznak gazdaszervezetként emlős fehérjék előállításához rekombináns DNS (rDNS) technológia útján, mivel ezeket könynven lehet növeszteni nagy mennyiséget magában foglaló fermentációs eljárásokban, és mivel ezek genetikailag jól jellemzettek. A genetikai manipulációk révén termelt sok emlős fehérje azonban bizonyos típusú transzláció utáni feldolgozási folyamatokat igényel, és így gyakran kell végezni komplex, in vitro kémiai vagy enzimes folyamatokat, amelyek nagy léptékű termelésben alkalmazva megfizethetetlen költségűek.

A feldolgozási folyamat aktivitások egyik típusa egy fehérje karboxi-terininális aminosavának fajlagos amidálása (a -COOH csoport átalakítása -CONH2 csoporttá). Több, természetben előforduló hormon és pepiid tartalmaz ilyen módosítást, amely gyakran nélkülözhetetlen, ha a fehérjéknek biológiailag aktívnak kell lennie. Egy példa erre a kalcitonin, ahol egy nem-araidéit prolin gyökbe helyettesítése a natív formájú amidéit prolin helyébe a biológiai aktivitás 3000-szeres csökkenését eredményezi.

Az az eszköz, amely hal erre a C-terminális (alfa) amidálásra, egy glicin gyököt ismer fel, amely kötvellenül követi az amidálni kívánt aminosavat (R-X-gly, ahol R a fehérje további része, X az a gyök, amelyet amidálni kívánunk, és gly a glicin gyök). A glicint lehasítjuk és az amino-részt valóban hozzáadjuk az utolsó előtti aminosavhoz, ezáltal áraidéivá ezt.

A peptidek és fehérjék karboxi-terminálisának amidslására képes enzim-készítményeket különböző forrósokban leírlak, igy pl. Bradbury A.F. és munkatársai [Natúré, 29fi, 686-688(1982)] beszámolnak egy «-amidáló enzimes aktivitásról, amely sertés agyalapi mirigyben van jelen.

Húsain, J. és Taté, S.S. [FEBS Letters, 152(2), 277-281(1883)] olyan oc-amidáló aktivitást írnak le, amely a szarvasmarha agyalapi mirigy neuroszei; réciós granulumaiban van jelen.

Eipper és munkatársai [PNAS 80, 5144-5148(1983)] olyan «-amidáló enzim-aktivitásról számolnak be, amely a patkány agyalapi mirigy első, középső és hátsó lebenyében van jelen.

Gomez és munkatársai [FEBS Letters, /67(1), 160-164(1984)] meghatározták, hogy a patkány hipolalamusz szintén tartalmaz «-amidáló enzim aktivitást.

Bradbury, A.F. és Sinythe, D.G. [Peplides Structure and Funetion: Proceedings of the 1 iglit American Peptide Symposium (Peptid-szerkezet és működés: Vili Amerikai Pepiid Szimpózium Közleményei), 249-52(1953), Uruby, V.J. és Ficli, I’.ll. szerkesztésében] leírjuk if-amídáló enzim-aktivitás jelenlétét patkány pajzsmirigyekben.

Mains, R.E. és munkatársai [Endocrinology, 114, 1522-15 JÜ{ 198 í) ] beszámolnak arról, hegy egy agyalapi mirigy első lebenyből származó rágc.sáló scjtvonal (ΛΤΤ-20) tc-amidáló aktivitást tartalmaz, amely nyilvánvalóan csökken a tenyésztés idejének előrehaladtával.

Azok a mirigyek és sz,érvek, amelyekről ismert, hogy amidéit peptideket tartalmaznak olyan enzimet, amely képes katalizálni az amidálási reakciót. így pl. alacsonyabbrendű élctforinójú állatokról, mint a kutyahalról (Sqvalus acanthias) leírták O’Ponahue, T.C. és munkatársai [Peptides, 3, 353-395(1982)), hogy agyalapi mirigy extraktuinai amidéit peptideket tartalmaznak. Scheller, R.H. és munkatársai [Cell, 32, 7-22(1983)] beszámoltak amidáló szignál peptidek jelenlétéről az Apylsia tengeri csigában. Ennek az aktivitásnak a természetben láthatóan mindenütt jelen való elterjedése ellenére kevés információt publikáltak ennek fizikokemiai jellemzőiről. Ez unnak tulajdonítható, hogy az enzim igen alacsony szinten van jelen ezekben n ncuroendrokrin ewrvckben.

Mindeddig az cc-'nüiná'ö enzimek tisztítását és jellemzését nem publikálták. A részlegesen tisztított enziiiikész.ítmónyek fiziokémiui tulajdonságairól azonban beszámoltak.

Az első szerzők, akik beszámoltak egy hozzávetőleges molekulasúlyról az cc-amidaló enzimekhez, Bradbury, A.F. és munkatársai voltak [Natúré, 298, 686-881(1982)]. Sephadex G-100-at alkalmazva mintegy 60 000 dalton minimális látszólagos molekulatömeget feltételeztek.

A további tanulmányok arra a következtetésre jutottak, hogy az enzim molekulatömege 60 000 és 70 000 dalton között van. Ilyen tanulmányok pl. a kővetkezők: Húsain,

J. és Taté, S.S.: FEBS Letters, 152(2), 277-281-( 1983); Eipper, Β.Λ.: PNAS, B.A. kötet, 167(1), 3228-3232(1984); és Kizcr, J.S. és munkatársai: PNAS 81, 3228-3232(1984).

Eipper ós munkatársai [PNAS, 80, 5144-48(1983)] beszámoltak arról, hogy molekuláris oxigén hozzáadásán kivül két kofák tor is szükséges a maximális enzimük tivitásboz; ezek: az aszkorbinsav és a réz(ll) ion.

Λ pepiid karboxi-lerniinálisának amidálását eredményező kémiai reakció egy amino-csoport forrást is igényel. Bradbury, A.E. és munkatársai [Natúré, 298, 686-688(1982) J bemutatták, hogy a glicin elhasad és átadja az amino-részt az utolsóelőtti aminosavriak, ez utóbbi arnidálását eredményezve. Arinak

19ο8ο7 υ

szükségéi, hogy a glicin amino-csoport donor legyen, más szerzők is igazolták.

Landymore, A.E.N. és munkatársai IBBRC, 777(1), 289-293(1983)] azt mutattak be, hogy az alariin is szolgálhat aminocsoport-donorként az aniidálási reakcióban. Kizcr és munkatársainak ezt követő munkája [PNAS 87,(3228-3232(1984)] kél különböző enzimaktivitást mutatott ki patkány-agyban, amelyek képesek voltak katalizálni az «-amidáló aktivitást. A nagyobb molekulatömegéi fajtának (70 000 dalion) glicinre korlátozott fajlagossága van a szubszlrátum karboxil-terminálisánál. A kisebb molekulatümegü enzim elfogad tc-alaninnal, mint karboxil-terininális aininosavval rendelkező szubsztrálumol.

A sertés agyalapi mirigyből kivont és részlegesen tisztított cc-amidáló enzimek pH optimumáról Bradbury A.F. és Smythe, D.G. számoltak be [BBRC, 772,(2), 372-377(1983)], ezt 7,0-nak találták. Eipper B.A. és munkatársai [PNAS, 80, 5144-5148(1983)] megerősítették ezeket az eredményeket, arról számolva be, hogy patkány agyalapi mirigyekből részlegesen tisztított cc-amidáló enzimek pH optimuma 7. ők azt is megjegyezték, hogy az enzimaktivitás gyorsan csökken 6,5 alatti vagy 7,5 fölötti pH szinten.

Az összes fentebb említett közleményben a kivonatok és részben tisztított enzim-keverékek tartalmaztak más proteolitikus enzimeket is, umolyek elbontják a lehetséges szubsztrátumokat és termékeket, valamint az cc-amidáló enzimet is.

A találmány célja, eljárás biztosítása tisztított cc-amidáló enzimek alkalmazásával cc-amidált peptidek előállítására peptid- vagy polipeptid szubsztrátumokból.

A találmány tárgya eljárás cc-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására karboxil-terminális glicincsoportot tartalmazó peptidek bői vagy polipeplidekből oly módon, hogy az említett peptideket vagy polipeptideket min. 25 mU/mg fehérje aktivitású (dansyl-D-Tyr-Val-Gly-COOIí dansyl-D-TyrVal-CONHí-vó alakításakor 37 °C-on pH = 7-nél meghatározva) peplidil-glicin-oc-amidáló monooxigenázt tartalmazó tisztított enzimkészítmény jelenlétében - amely lényegében inás protealitikus, a kiindulási peptideket vagy polipeptideket, az amidált peptideket vagy polipeptideket, valamint magát a peptidil-glicin-oc-ainidáló monooxigenázt lebontani képes enzimet tartalmaz, és amely enzimet úgy nyertük, hogy pajzsmirigy velő karcinóma szövetet, pajzsmirigy velő karcinóma sejtvonalat vagy ilyen sejtvonalakat tartalmazó szövettenyészetek tápközegét anioncserélő kromalográfiának, majd méretkizárásos kromatográfiának, majd az ezeknél kapott peptidil-glicin-oc-amidáló monooxigenázt tartalmazó cluens frakciót erős anioncserélő kromatográfiának vetettük alá - oxidálunk.

Felfedeztük, hogy a találmány szerinti eljáráskor szükséges homogénen tisztított tc•l

-amidált) enzimet előállíthatjuk egy többlépcsős eljárás révén, szilárd tumor kivonatokból, tumor sejtvonnlakból és az ilyen sejtvonalakból készített szövettenyésztő tápközegből végzett kombinált eljárást alkalmazva, a n éret-kizárásos módszert és az ioncserélő króm Biográfiát kombinálva.

Az enzimet WAG/Rij Wistar pjatkányokon kifejlődött patkány pajzsmirigy velő karcinómábói extraliáljuk, amint ezt Roos és munkatársai leírták I Endocrinology, 150,(1), 27-32(1979)]. Ezt a szövetet IVI-10028-ként helyeztük letétbe. Az enzimet más forrásokból is extraháluk, nevezetesen humán és patkány pajzsmirigy velő karcinóma sejtvonalakból. A 77(74) patkány sejtvonal pajzsmirigy ve-lő karcinóma tumorokból származott passzálósok sorozata után, amint ezt Muszynski, M. és munkatársai leírták [JBC 258, 11678-83(1983)]. Ezt a sejlvonalnl lVI-10029-kcnt definiáltuk. A 1ITT54(34) humán sejtvonalat Roos B.A. fejlesztette ki a VA Medinai Center-nél (Cleveland, Ohio), humán pajzsmirigy velő karcinóma sejteket alkalmazva az elsődleges tenyészethez. A HTT 54(34) humán sejlvonalat IVI-10031-kénl helyeztük letétbe. A meghatározott szöveltenyéztő tápközegről - mind a humán, mind a patkány sejtvonalakból - azt mutattuk ki, hogy jelentős oc-ainidáló enzimaktivitás szintet tartalmaz, jelezve, hogy az enzim egy része kiválasztódik n sejtből.

Az enzimet kinyerjük óh tisztítjuk, a nyersanyagot először anioncserélő kroinatográfianak vetve aló. A mintát pl. lehet nagy tömegben terhelni preperatív léptékű anion-cserélö oszlopra, pl. DE-52 gyantára (Whalnan Limited). Az cc-amidáló aktivitást tartalmazó terméket azután mérelkizárásos kromatográfiónak vetjük alá megfelelő szétválasztó népességgel rendelkező gyantán, pl. Sephacryl 5-200 szuperfinom oszlopon, amely a Pharmacia Fine Chemicals-nál kapható. Az aktivitást tartalmazó eluált frakciókat azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, erős anioncserélő mátrixot alkalmazva. Egy gyanta, amit alkalmazhatunk, a Mono Q HR 5/5 erős anioncseréiö gyanta a Pharmacia Fine Chemicals-tól; és egy vagy több étbocsátáe is szükséges lehet az oszlopon az enzim homogén tisztításához. Mindegyik tisztítási lépést figyelhetjük mind fehérje-tartalom szerint, mind <c-ami<iáló aktivitás szerint. Ezt az információt alkalmazzuk, hogy kiszámítsuk az enzim fajlagos aktivitását, amely az enzim relatív tisztaságának jcizőjcként szolgál.

Az így létrejött enzim peplidil-glicin tc-amidáló monooxigenóz {patkány-eredetű; IV1-

-10032	; humán	eredetű:	IVI—30033), amelynek
molekulatömege	mintegy	60 000 és bő 000
dalion	között	van. Ez	úgy van tisztítva,
hogy	legalább	mintegy	25 míilí-egység/mg

fchérje, előnyösen legalább 50 niilli-cgység/ntg fehérje fajlagos enziniaktivitásl mutasson. Ez olyan módon van tisztítva, hogy egyedi, homogén, jól defini7.lt csíkot mu.tas-36 són nátrium—dodecil-szulfát (poliakrilamid) gélen (SDS-PAGE) végzett elektroforézis után.

A fentiek szerint tisztított peplidil-glicin «-amidáló monooxigenázt alkalmazzuk a találmány szerinti eljárásoknál egy terminális glic.in-gyökkel rendelkező polipeptid alfakarbonil csoportjának amidálására, ahol a glicin úgy működik, mint aminoc.soport-átadó. Λ szubsztrátuin pepiidet vagy polipeptidet természetes forrásokból lehet tisztítani, vagy alkotó aminosavból szintetizálni, vagy rekombináns DNS technikával előállítani. A glicinnel befejeződő polipeptidet kombináljuk oxigénnel megfelelő mennyiségű enzim jelenlétében. Az igényelt enzim mennyisége számos változótól függ, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a következőket: az adott enzimkészítmény fajlagos aktivitása, az átalakítandó szubsztrótum mennyisége és kémiai szerkezete, az idő, amelyen belül az átf alakulás végbemegy, valamint a rekaciókeverék hőmérséklete és pH-ja. Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerhetnek más változókat is, amelyek befolyásolhatják az igényelt enzim pontos mennyiségét egy adott helyzetben. Az oxigént általában sztöchiometrikus mennyiségben alkalmazzuk, de az oxigén fölöslege nem befolyásolja a reakciót. A réz-ionok jelenléte is szükséges, és ezt szolgáltathatja bármilyen réz-só, amelynek anionja nem befolyásolja károsan a reakciót. Amikor az enzim mintegy 1 milli-egység/mg fehérje fajlagos aktivitással bír, a maximális «-amidálás 4,7 réz(TI)-ion koncentrációnál megy végbe. Ahogy az enzim tisztasága növekszik, a külső réz(ll) ionra való koncentrációigény csökken. Az enzimes aktivitást lehet növelni aszkorbát-ion jelenlétével is, amelyet bármilyen sója szolgáltathat,, amenynyiben a só kationjának nincs káros hatása a reakcióra. Az olyan tisztított enzimnél, amely mintegy 50 milli-egység/mg fehérje fajlagos aktivitással rendelkezik, az «-amidálás maximális aktivitása mintegy 5,5 mmól/1 aszkorbátnál van. Az «-amidáló aktivitást lehet növelni kataláz hozzáadásával is. Az «-amidálásí reakció optimális pH-ja 6,5 és 7,5 között van.

A jelen találmány szerinti eljárásnál felhasznált tisztított enzim «-amidáló aktivitását tisztított enzim oc-amidáló aktivitását úgy demonstráljuk, hogy radioaktív jódozott D-Tyr-Val-Gly-t alkalmazunk szubsztrátumként, vagyis olyan peptidet, amelynek szekvenciája utánozza a melanocita stimuláló hormon prekurzor karboxi-terminálisát. A vizsgálatokat 100 mmól/1 TES (Ν-triszl hidroxi-metill-metil2-amino-etánszulfonsav 1 pufferben hajtjuk végre, pH = 7,0-nál, 37 C hőmérséklet 3 órán ál. A terméket a [¹²⁵I] Tyr-Val-NHz-t, kationcseréló krornatográfiával különítjük el a szubsztrátumtól. Az amidáló enzim aktivitását szintén demonstráljuk, olyan szintetikus szubsztrátumok alkalmazva, amely a kalcitonin karboxi-terminális szekvenciáját, a [Tyr^z5Gly³³l kalcitonin-(26-32)-t utánozza.

A találmány részletesebben a következő példákkal illusztráljuk.

____ 1. példa - - ·· - · Eljárás az MTC-daganatokbói származó iz-amidáló enzinikészilmény tisztítására

Fagyasztott patkány-MTC-daganatokat apró részecskékké poritunk, és 150 mmólos Tris-oldatban (pH = 7,5) homogenizálunk, amely 250 mM szaccharózt, 0,25 % N-acetil-glukopiranozidol, 0,lmM PMSF-t, 20 pg/ml pepsztatint és 100 jug/ml szójabab-tripszin-gáilól tartalmaz. Általában 25 g daganatszövelel homogenizálunk 200 ml fenti pufferelegyben, jéghütés közben. A homogenizólást négy, egyenként 20 másodperces művelettel érjük el, l’olytron homogenizáló berendezésben (Birkman) 7-es beállítás mellett. A homogenizátumot 15 percig 9000 x g sebességgel Ja-20 rotorban (Beckman) centrifugáljuk, és a ’elülúszót (a továbbiakban: Sup.l) dekantéljuk. A centrifugakalácsot ismételten homogenizáljuk 60 ml homogenizáló pufferelegyben, három 20 másodperces műveletben, aminek során a berendezést mindig 7-es beállí tásban tartjuk. Ezt a második homogenizátuinot ismételten 15 percig 9000 x g sebességgel centrifugáljuk. Ez utóbbi centrifugálásból származó felülúszót (a továbbiakban: Sup.2) komiriáljuk a Sup.l-vel. Az egyesített Sup. 1 és Sup.2-t 30 percig 100 000 x g sebességgel SW28 rotorban (Beckman) 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A derített hornogenizátumhoz (a továbbiakban: Sup..3) annyi ammónium-szulfátot adunk kristályos formában, hogy az oldat 25 % ammónium-szulfátot tartalmazzon. A kristályos sót fokozatosan, állandó keverés közben 15 perc alatt adjuk a 4 °C-on tartott hornogenizátumhoz. További 30 perces, 4 °C-on végzett keverés után az elegyet Ja-20 rotorban (Beckman) 4 ’C-on 15 percig 27 000 x g sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, és a felülúszóhoz addig adunk ammónium-szulfátot, amíg 40 % ammónium-szulfátot nem tartalmaz. További 30 percig keverjük, majd 15 percig 27 000 x g sebességgel centrifugáljuk. Ez utóbbi műveletből származó felülúszót eldobjuk, és a lepényt, amely a homogenizátumbari lévő összes enzimaktivilásnuk legalább 50 %-át tartalmazza, ismét szuszpendáljuk 50 mmólos Tris-HCL (pH = 7,0) pufferban. fgy kapjuk a mintát, amelynek aktivitása 8,2 mU/mg fehérje.

2. példa

Az enzimkészitmény sejttenyészet fehilúszó jóból az alábbi módon is elkülöníthetjük:

Meghatározott összetételű szövettenyészet-közeget (F10/DMEM) alkalmazunk MTL (CA-77) patkány-daganatsejtek tenyésztésére. Mihelyt á sejtek összefolyása bekövetkezik (a szubkultúrázást követően körülbelül 7-10 nappal), a közeget cseréljük, és minden második napon összegyűjtjük. Ezt a közeget az alábbiakban leírt módon dolgozzuk fel és tisztítjuk az enzimkészitmény előállítása céljából. Használt szóvettenyészet-kőzeget szivattyúzunk eg.v DEAE anioncserélő töltetre (250 a C-UNO, Inc. cégtől) 25 ml/perc áramlási sebességgel. Az enzimet a töltet megköti, és utána 500 mniólos konyhasóoldattal eluáljuk. Az alfa-amidáló enzimaktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, liofilizáljuk, az igy kapott terméket desztillált vízzel reszuszpendáljuk, és méret-kizárásos kromatográfiának vetjük alá. E célra Sephaeryl 300 szuperfinom gyantát használunk (Pharmacia cég, lásd az alábbi 8. fejezetet) Az amidáló enzimkészitmény a tisztasági fokon mentes a nemspecifikus proteolitikus aktivitástól, és aktivitása legalább 50 mU/mg fehérje. Az e lépésből származó amidáló enzimkészítményt sikeresen Alkalmaztál·· rekombináns. vív—v°i kiegészített humán kalcitonin, valamint növekedési hormont felszabadító faktor amidálására.

Ha 1-1,5 x 10⁶ sejt/mt sejtsűrűségről indulunk, akkor rutinszerűen 200-350 mii hozammal kapunk amidáló enzimaktivitást a használt közeg 1 literére számítva, a fenti két tisztítási lépés után. Az enzim stabilis, és alkalmas arra, hogy amidáló reagensként használjuk közvetlen or-amidálására vagy enzim-immobilizálásra.

3. példa

Sepharcyl S-300 gélszűrés: méret-kizárásos kromatográfia

Sepharcyl S-300-at (Pharmacia) 50 inmólos Tris-HCL (pH = 7,0) puffereleggyel kiegyensúlyozunk, majd K 50/100 oszlopba öntjük (Pharmacia) a gyártó cég használati utasítása szerint. Az oszlop agytérfogata körülbelül 1,3 liter. Az 1. vagy 2. példa szerint kapott mintát körülbelül az oszlop agytérfogata 3 %-ának megfelelő mennyiségben viszsziik az oszlopra. Az oszlopról a fehé.rjéket 50 mmólos Tris-HCL oldattal (pH - 7,0) kb. 2 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és ezek amidáló enzimaktívitását Dansyl-1)-Tyr-Val-G)y-szubsztrálum alkalmazásával megmérjük. Az enzimet az oszlopról eluálva olyan terméket kapunk, amelynek - az 1. ábra szerint egyetlen aktivitási csúcsa van, amelynek molekulatömege 00 000-65 000 dalton. A termék aktivitása legalább 50 mU/mg fehérje.

*!. példa

Mono <? kromatográfia 6,0 píi értéken: erős anioncserélő kromatográfia

A Sephaeryl S-300 oszlopról kapott, maximális enzimaktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és 4 liter 20 mmólos bisz-Tris puffereleggyel (pH = 6,0) szemben dializál.juk. Az ig.v kapott terméket Mono Q HR 5/5 oszlopra töltjük (Pharmacia), amelyet előzőleg a gyártó cég használati utasításai szerint előkezeltünk, és 20 mmólos bisz-Tris puffereleggyel (6,0) kiegyensúlyoztunk. Miután az oszlophoz nem kötődő fehérjéket az oszlopról eltávozó eluátumban összegyűjtöttük, az oszlopon megkötött fehérjéket 20 mmólos biszTris pufferoldatban (pH = 6,0) oldott 0-300 hiM natrium-kloriddal a lineáris koncentráció-gradiens elve alapján eluáljuk. Az oszlopon az eluálószert 0,5 ml/perc áramlási sebességgel vezetjük át, és 2 ml térfogatú frakciókat veszünk. A Mono <? oszlopról 6,0 pH-értéken eluált fehérjék oldatát rögtön közömbösítjük úgy, hogy olyan csövekbe gyűjtjük, amelyek mindegyike 200 pl 1,0 mólos 7,0 pH-értékű Tris-t tartalmaz. A frakciók oc-amidáio enzimaktivitását a fentebb elmondottak szerint meghatározzuk; a csúcsaktivitást az oszlopról eltávozó azon eluátumban figyelhetjük meg, amelyet kb. 160 mmólos nátrium-klorid oldattal kapunk (lásd a 2. ábrát). Az aktivitás 161 mU/mg fehérje.

5. példa

Mono Q kromatográfia 8,0 pH értéken

A 6,0 pH értéken végzett Mono 0 kromatográfiából származó cc-amidáló enzim-csúcsaktivitást tartalmazó frakciókat két váltással, egyenként 4 liter 50 mmólos Tris-HCL oldattal szemben (pH = 8,0) dializáljuk. Ezután az enzimet 50 mmólos Tris-HCL oldattal (pH = 8,0) kiegyensúlyozott Mono Ö HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) visszük, a fehérjéket 0-300 mM nátriumkloridot tartalmazó oldatokkal (50 mmólos Tris-HCL oldatban, pH = 8,0) a lineáris koncentráció-gradiens elve szerint eluáljuk. Az áramlási sebesség 0,5 ml/perc, 2 ml térfogatú frakciókat veszünk. Minden egyes frakciót 200 pl 1,0 mólos Tris oldattal (pH = 7,0) semlegesítünk. Ennek során két különböző enziniaktivitásl—csúcs figyelhető meg; az egyiket 190 mmólos, másikat 220 mmólos nátrium-klorid koncentrációval eluáljuk (lásd a 3. ábrát). Az

-510 aktivitások értéke: legalább 800 md/rrig fehérje, illetve legalább 400 inll/nig fehérje.

6. példa

Az enzim gél-elektroforézise: a Mono 0 (pH - 8,0) kromatográfiából származó, enzimcsücsot tartalmazó frakció

A 220 mmólos nátrium-klorid koncentrál cióval eluált, 408 mU/mg fehérje aktivitású enzim-csúcsfrakció alikvot. SDS-t és 2-rnerkapto-etanolt tartalmazó pufferoldatban melegítéssel denaturáljuk, majd 10 %-os SDS-políakrilamid gélre töltjük. A 220 mmólos nátrium-klorid koncentrációval eluált frakcióban egyetlen sávot figyelhetünk meg, amelynek molekulatömege megközelítőleg 73 000 Halton (4.ábra).

7. példa

A 7300 daltonos sávot és az ec-amidáló enzim azonosságainak igazolása

A fentikeben leírt kritériumok szerint tisztított, további tc-amidáló enzimkészítményekből alikvotokat vetünk alá elektroforézisnek nem-denaturáló 10%-os akrilamid-gélen. Minden egyes lapra 50 /j1 térfogatú alkivotot viszünk. Az elektroforéziás után a lapok egyikén a fehérjét ezüstfestési módszerrel detektáljuk. Az egyik lapból 3 mm szélességű csíkokat vágunk, és minden egyes üregbe 100 μΐ olyan keveréket helyezünk, amely Dansyl-szubszlrátumot, katalázt, aszkorbinsavat és 150 mM Tris-t (pH - 7,0) tartalmaz. Az inkubálast 16 órán át 36-37 °C hőmérsékleten állandó rázás közben végezzük. Ezt követően minden egyes üregben lévő alikvot részt elemzőnk, hogj' a szubsztrátumnak amidált termékké való konverzióját megállapítsuk. Két gélcsíkban figyelhetünk meg enzimaktivitást: az enzimaktivitás együtt vándorol egy erősen festödő fehérjesávval géllapon (5. ábra).

a megfelelően festett

8. példa

Eljárás rekombináns humán kalcitonin • - előállítására

A humán (emberi) kalcitonin 32 aminosavat tartalmazó peptidhormon, amelynek karboxil-végződésén amidált prolilcsoport van. Géntechnológiai úton olyan mikroorganizmust képeztünk, amely olyan rekombináns fúziós fehérjét termel, amely a humán kalcitoninnak megfelelő aminosav-szekvéneiét tartalmazza. A fúziós fehérje génjét úgy terveztük, hogy a humán kalcitonin szekvenciáját az aminovégződésen egy argínilcsoport, karboxil végződésén pedig egy glicilcsoport zárja be, amely egyszersmind a rekombináns fúziós fehérjét is lezárta. A humán kalcitonin-gént plazmidhoz kötöttük, és így egy megfelelő fúziós plazmidot képeztünk, majd egy mikroorganizmust ezzel a plazmiddal átalakítottunk, amivel elértük a fúzió kifejeződését. Ezt a humán kalcilonint tartalmazó fehérjét a rekombináns mikroorganizmusok lizátumából kicsapással különítettük el, majd a ciszteinilcsoportokat S-szulfonálokkó alakítottuk, és a lizilcsoportokat reverzibilisen védtük citrakonsavanhidriddel végzett reakcó útján. Mivel a humán kalcitonin nem tartalmaz arginint, a re'·’ kombináns fúziós fehérje tripszines emésztése olyan peptidet eredményez, amelj’ a humán kalcitoninszekvenciát a karboxil-végzödésen glicinnel kiegészítve tartalmazza. Ezt a pepiidet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPCb) (6. ábra) vagy ioncserélő kromatográfiával elkülönítettük, és szerkezetét aminosav- és mikroszekvenciás analízis segítségével állapítottuk meg.

A peptid glicincsoportját eltávolitottuk, és az utolsó előtti helyen lévő propilcsoportot prolinamiddá alakítottuk a találmány szerinti c<-aniidáló enzimkészitménnyel. Ezt a peptidet félpreparativ méretben végzett if-amidálással, például a következő feltételek medett állíthatjuk elő:

200-300 nanomól liofilizált pepiidet (szubsztrátumot) 200 pl 150 mmólos Tris-HCL pufferoldatban (pH = 7) oldunk, amely kb.

750 μΙΙ <c-amidáló enzimkészítményt tartalmaz.

Az enzimet patkány-MTC-szővetból vagy használt szöveltenyészet-közegböl (patkány-MTC CA-77 sejttörzsból) veszünk. Az enzimet olyan mértékben tisztítjuk, hogy az ösz40 szes proteolitikus aktivitást eltávolítjuk (lásd a fentiekben leírt eljárást). Ezt úgy érhetjük el, hogy az ioncserélő és a méretkizárásos kromatográfíát kombináljuk (lásd a fentiekben leírt eljárást). Ennek során a tiszta, ho45 mogen enzim nem feltétlen követelmény. Az így kapott keverékhez aszkorbinsavat és réz-szulfátot adunk olyan mennyiségben, hogy ezek végkoncentrációja megközelítőleg 3 mM, ill. 2 μΜ legyen. Az így kapott oldatot

Gú alaposan összekeverjük, és 37 °C hőmérsékleten 5-6 órán át inkubáljuk. A szubsztrátum általában 70-90%-os konverzióval alakul át a termékké. Ezután az S-szulfonát-csoportokat eltávolítjuk, és a rekombináns humán kalcito·'·’ nint, fordított fázisú HPLC segítségével tisztítjuk (lásd a 7. ábrát). A végterméket a fordított fázisú HPLC során kapott retenciós idővel (lásd a 8. ábrát), kvantitatív tripszines leképzéssel (szerkezetmeghatározássai) βθ (9, ábra), aminosav-elemzéssel (I. Táblázat) és biológiai aktivitással jellemezzük (10. ábra). A rekombináns humán kalcitonin minden egyes esetben megkülönböztethetetlen volt a szintetikus humán kalcitonintól.

-612

A fenti eredmények igazolják, hogy a találmány szerinti eljárás során alkalmazott enzimkészilrnény képes egy fiziológiailag fontos szubsztrátuni, például a humán kalcitonin amidálására, amelyet rekombináns DNS módszerrel állítottunk elő, azt, amely kizárólag . L aminosavakat tartalmaz.

9. példa

A találmány szerinti eljárásnál alkalmazott készítmények specifikus aktivitásának meghatározáséra alkalmazott mérési rendszerek összehasonlítása

A technika állása szerint ismert cc-amidáló enzimek aktivitásának meghatározására több módszert alkalmaztak. A legtöbb, ismeri módszer szerint a mérést D-Tyr-Val-Gly t.ripeptidnek D-Tyr-Val-amiddá történő konverziójára alapozták. E mérést kvantitatív módon radioaktivan jelzett anyaggal (¹²⁵J-D-3'yr-Val-Gly) végzik, amelyet nem jelzett anyag (d-Tyr-Val-Gly) feleslegével összekeverve alkalmaznak. A jelzett anyag konverziójának mérése lehetővé teszi a nem jelzett anyagra vonatkozó extrapolációt, s így lehetővé válik az aktivitás kiszámítása.

• Jóllehet ezt a mérést is alkalmaztuk, a készítmények aktivitásának meghatározását a dansvl-Tyr-Val-Glv dansyl-Tyr-Val-amiddá történő konverziójának közvetlen mérésére alapoztuk.

Abból a célból, hogy lehetővé váljék a technika jelenlegi állása szerint ismert készítmények specifikus aktivitásának értelmes összehasonlítása a találmány szerinti eljárásnál alkalmazott készítmények specifikus aktivitásával, kísérleteket végeztünk a mérési rendszerek összehasonítására.

A kísérleti eredményeket az alábbiakban összegeztük.

I. Monodansyl-L-Tyt— Val-Gly

Patkány-medulla tiroid-karcinómából és CA-77 Bejttenyészet-közogéből elkülönített ·.<-amidáló enzimkészitmény L alkalmaztunk enzimforrásként kísérleteink során. Összes kísérleteink során az alkalmazott enzimkoncentrációt állandó szinten tartottuk {ha erre vonatkozóan külön megjegyzést nem teszünk).

A monodansyl-szubsztrátumra vonatkozó reakciókörülmények az alábbiak.

A reakcióelegy összetétele:

pl enzim, p 1 30 mmólos réz-szulfát.-oldat, pl 20 mikromólos réz-szulfát-oldat, pl 100 mg/ml-es szarvasmarha-hasnyálmirigyből eredő kataláz, jul 2 nanomól szubsztrátuniot tartalmazó oldat., pl 150 mmólos TES-oldat (pH = 7,0).

A mintákat két ismétlésben készítettük, és 37 °C hőmérsékleten 10, 20, ill. 30 percig inkubáltuk. Ezután az enzimreakciót 10 pl 500 mmólos EDTA hozzáadásával leállítottuk. A szubsztrátuniot és a terméket fordított fázisú HPLC alkalmazásával, HP-1090 folyadékkromatográfiás rendszer alkalmazásával elkülönítettük, és a mennyiségi meghatározást HP-3392 integrátorral végeztük. Kimutattuk, hogy a monodansyl-L-Tyr-Val-Gly-konverziója az <c-amidélt termékké az időre vonatkoztatva lineáris.

II. ^t25J-D-Tyr-Val-Gly

A D-Tyr-Val-Gyl-t és a D-Tyr-Val-NHí-t Pierce-féle jódgyöngyök segítségével jódoztuk. A radioaktivan jelzett szubsztrátuniot és terméket felhasználtuk egy szulfil-propil kationcserélő oszlop kalibrálására. ¹²⁵J-D-Tyr-Val-Gly-t adtunk 650 pM D-Tyr-Val-Gly-hoz, és ezt használtuk szubsztrátumként a következő reakciókörülmények között:

A reakcióelegy összetétele:

pl enzim, pl 30 mmólos aszkorbáloldat, pl 100 mg/ml katalázt tartalmazó oldat, pl 20 mikromólos réz-szulfát-oldat, pl szubsztrátumoldat, amelynek végkon650 pM és 25 pl 150 mmólos TES-oldat (pH = 7,0)

A mintákat 37 °C hőmérsékleten 10, 20, ill. 30 percig inkubáltuk, majd a reakciót 500 mmólos EDTA hozzáadásával leállítottuk. Ezután az egész mintát 10 mmólos nátriuin-foszfát pufferoldattal (pH = 5,2) hígítottuk, és szulfil-propil kationcserélő oszlopra vittük. A szubsztrálum nem kötődött az oszlophoz; az amidéit terméket 500 mmólos nátrium-klorid oldattal eluáltuk. A radioaktivan jelzett. szubsztrátumnak a termékké történő konverziója az időre vonatkoztatva lineárisnak adódott.

III. D-Tyr-Val-Gly

Λ D-Tyr-Val-Gly amidálására a fentebb dansyl- és jódozott szubsztratumokra leírt reakciókörülményeket alkalmaztuk. A szubsztrálum koncentrációja a reakcióelegyben 650 pm volt. A szubsztrátuniot és a terméket fordított fázisú HPLC-ben, HP-1090 folyadékkromatográfiás rendszer alkalmazásával, gradiens-eluálássnl értük el. Az oszlopról távozó eluátumot 280 nm hullámhossznál vizsgáltuk. E mérés érzékenysége sokkal kevesebb, mint a dansyl- vagy a jódozott szubsztrátumok esetében. Abból a célból, hogy ezt a kisebb mértékű érzékenységet is megfelelő módon tudjuk alkalmazni, az <r-ainidáló reakciókat hosszabb ideig végeztük, és/vagy nagyobb

-714 mennyiségű oc-amidáló enzimet alkalmaztunk. A ^lísJ-D-Tyr-Val-Gly-nek ^l“J-D-Tyr-Val-. -amiddé, valamint a dansyl-Tyr-Val-Gly-nak dansyl-Tyr-Val-amiddá történő konverziójának elemzése azt mutatja, hogy bármely időpontban megközelítőleg 1,55-ször több jódozott szubsztrátum alakul át, mind dansvl-szubsztrátum. így, ha a technika állása szerint ismert mérési rendszerL összehasonlítjuk _a saját mérési rendszerünkkel, akkor megközelítőleg 1,5-szörös konverziós faktort kell alkalmazni, az általunk alkalmazott dansyl-szubsztrátumos módszerre vonatkozóan.

A továbbiakban egy némileg szigorúbb kinetikai elemzést alkalmaztunk a saját dansyl-Tyr-Val-Gly mérőmódszerűnknek a technika állása szerint ismert D-Tyi—Val-Gly mérőmódszerével való összehasonlításra. Ez az elemzés a kővetkezőt mulatja:

Szubsztrátum K'(/.im) Vmaxípmól termék min'¹⁷ pl)

D-Tyr-Val-Gly 37 31 (ismert módszer)

Dansyl-Tyr-Va)-Gly 1,7 21 (saját módszer)

A maximális sebesség (Vnax) mindkét szubsztrátumra vonatkozó összehasonlításából látható, hogy a technika állása szerint ismert D-Tyr-Val-Gly megközelítőleg 1,48-szor nagyobb aktivitást eredményez, mint az általunk alkalmazott dansyl-Tyr-Val-Gly. Ez megegyezik a fentebb leírt részletekkel és azokat alátámasztja.

10. példa

Az aktivitás összehasonlítása

Eipper (PNAS) az 5147. oldalon (4. ábra) közli, hogy a V„ax óránként 39 pikomól/ /mikrogramm. Ez megfelel 0,65 mU/mg fehérje/perc specifikus aktivitásnak. Ez a legmagasabb aktivitás, amelyet a technika jelenlegi állása szerint közöltek. Ha ezt a fentebb említett 1,5 konzerviós faktorral osztjuk, akkor 0,4 mU/mg fehérje/perc. specifikus aktivitást kapunk. Ezt az értéket közvetlenül összehasonlíthatjuk az általunk elért, fentiekben leírt specifikus aktivitásokkal.

Amint fentebb közöltük, mi legalább 25 mU/mg fehérje aktivitást értünk el, ami 60-1000-szer nagyobb aktivitást jelent, mint az Eipper (PNAS) által közölt aktivitás.

Claims (7)

1. Eljárás α-amidált peptidek vagy polipeplidek előállítására karboxil-terminális gli5 ciricmiportot tartalmazó peptidekből vagy polipeptidekből, azzal jellemzve, hogy az említett peptideket vagy polipeptideket min. 25 ml/mg fehérje aktivitású (dansyl-D-Tyr-ValGly-COOH dansyl-D-Tyr-Val-CONH2-vé alaki10 tusakor 37 C-on pll = 7-nél meghatározva)peptidil-glicin-cc-amidáló monooxigenézt tartalmazó tisztított, enzimkészítmények jelenlétében - amely lényegében más proteolitikus, n kiindulási peptideket vagy polipeptideket, _az amidéit peptideket vagy polipeptideket, valamint magát a peptidil-glicin-uc-amidálé monooxigenázt lebontani képes enzimet nem tartalmaz, és amely enzimet úgy nyertünk, hogy pajzsmirigy velő karcinoma szövetet, pajzsmirigy velő karcinoma sejtvonalat vagy ilyen sejtvonalakat tartalmazó szövettenyészetek tápközegét anioncserélő kromatográfiának, majd méretkizárásos kromatogr áfiá25 nak, majd az ezeknél kapott peptidil-glicin-cc-amidáló monooxigenázt tartalmazó eluens frakciót erős anioncserélő kromatográf iának vetettük alá - oxidálunk.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal

2q jellemezve, hogy min. 50mU/mg fehérje aktivitású enziinkészítrnényt alkalmazunk.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homogén, tisztított enzimkészílményt alkalmazunk.

35

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy patkány pajzsmirigy velő karcinómából kinyert enzimkészítményt alkalmazunk.

5. A 4. igénypont szerinti ejárás, azzal

40 jellemezve, hogy IVI-10028 szám alatt deponált és IVI-10029 szám alatt deponált pajzsmirigy velő karcinoma sejtvonalból származó enz'mkészítményt alkalmazunk.

6. Az 1-3. igénypontok bármelyike sze45 rinti eljárás, azzal jellemzve, hogy 60 000-65 000 dalton molekulatömegű peptidil-glicin-cc-amidáló enzimet alkalmazunk.

7. A 2. vagy 3. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy SDS/poliakrila50 mid gélelektroforézisnél egyedi, homogén, jól definiált csíkot mutató, tisztított enzimkészitményt alkalmazunk.