JP2594037B2 - アルファアミド化酵素組成物及びその製造方法 - Google Patents

アルファアミド化酵素組成物及びその製造方法

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    • C12Y114/17—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced ascorbate as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.17)
    • C12Y114/17003—Peptidylglycine monooxygenase (1.14.17.3)

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 核酸暗号配列から天然蛋白の前駆物質を翻訳し、これ
ら前駆物質を細胞内処理（開裂および／または官能基の
変性）することについては、各種文献に明示されてい
る。
一般に、哺乳動物の細胞および他の真核細胞は、或る
翻訳後の処理を行うことができるが、原核生物では、そ
のような処理を行うことができない。大腸菌のような特
定の原核生物は、組換型DNA（rDNA）技術によって哺乳
動物の蛋白を生成する宿主として広く用いられている。
なぜならばこのような原核生物は、バッチ式発酵法で容
易に培養することができ、かつ一般的にそれらの特性が
充分に決定されているからである。しかしながら、遺伝
工学技術によって生成された多くの哺乳動物の蛋白に
は、或る種の翻訳後の処理が必要であり、この処理は複
雑な生体内における化学的、または酵素的処置を利用す
ることにより行わなければならないことがしばしばあ
り、このような化学的、または酵素的処置はコストが高
く、このため大量生産に適用することができない。
或る種の処理活性は、蛋白のカルボキシル基末端保有
アミノ酸の特殊なアミド化（−COOH基を−CQNH2基に変
換すること）を伴う。多くの天然のホルモンおよびペプ
チドには、そのような変性が起り、蛋白が生物学的に活
性でなければならない場合、その変性がしばしば必須と
なる。１つの例はカルシトニンであり、この場合、天然
のアミド化プロリンの代わりに非アミド代プロリン残留
物を使用すると、生物学的活性度は3,000倍も減少す
る。
このＣ−末端（アルファ）アミド化を行う薬剤は、ア
ミド化するアミノ酸のすぐ次の位置にあるグリシン残基
を認知する（Ｒ−Ｘ−gly、この式中、Ｒは蛋白の本体
部分であり、Ｘはアミド化されている残基であり、「gl
y」はグリシン残基である）。グリシンは開裂され、実
際アミノ成分を末位から二番目のアミノ酸に付与し、こ
れによりアミノ酸をアミド化する。
ペプチドおよび蛋白のカルボキシル末端基をアミド化
することのできる酵素製剤は、種々の文献に述べられて
いる。例えば、ブラドブリー・エイ・エフ（Bradbury
A.F.）等、ネイチャー（Nature）,298号,1982年,686〜6
88頁は、α−アミド化酵素活性がブタの下垂体に存在す
ると報告している。
フサイン・アイ（Husain I.）およびテート・エス・
エス（Tate S.S.）、FEBSレターズ（Letters）,152巻,2
号,1983年,277〜281頁は、α−アミド化活性がウシの下
垂体神経分泌性顆粒中に存在すると述べた。
エイパー（Eipper）等、PNAS,80巻、1983年、5144〜5
148頁は、α−アミド化酵素活性がラット下垂体の前
葉、中葉および後葉に存在すると報告した。
ゴメズ（Gomez）等、FEBSレターズ,167巻、１号、198
4年,160〜164頁は、ラットの視床下部もまたα−アミド
化酵素活性を含んでいると断定した。
ブラドブリー・エー・エフおよびスミス・デー・ジー
（Smythe D.G.）、ペプチドの構造および作用について
の第８回アメリカ・ペプチド・シンポジウムの会報、編
集者フルバイ・ブイ・ジェー（Hruby V.J.）およびリッ
チ・ディー・エッチ（Rich D.H.）は、ラットの甲状腺
におけるα−アミド化酵素活性の存在について述べてい
る。
マインズ・アール・イー（Mains R.E.）等、エンドク
リノロジー（Endocrinology）,114巻、1984年,1522〜15
30頁は、ネズミの下垂体前葉（ATT−20）から誘導され
た細胞系が培養中に経時的に見掛上減少するα−アミド
化酵素活性を含んでいることを報告した。
アミド化ペプチドを含有するものとして公知の腺また
は器官は、アミド化反応に触媒として作用することので
きる酵素を含む。例えば、ホシザメ（Squalus acanthia
s）のような下等動物は下垂体抽出物中にアミド化ペプ
チドを含むことが、オドノヒュー・ティー・エル（O'Do
nohue T.L.）等、ペプチド（Peptides）,3号,1982年,35
3〜395頁に報告された。シェラー・アール・エッチ（Sc
heller R.H.）等、セル（Cell）,32巻,1983年,7〜22頁
は、海洋に住むカタツムリ、アピルシア（Apylsia）中
にアミド化の認められるペプチドの存在を報告した。こ
の活性物質は自然界に明らかに遍在するけれども、その
物理学的および化学的な特徴については、殆んど公表さ
れていない。この理由はこれら神経内分泌器官内に存在
する酵素が非常にわずかであるためである。
今までにα−アミド化酵素の精製および特定決定につ
いては公表されていない。しかしながら、部分的に精製
した酵素製剤の物理的および化学的な性質は報告されて
いる。
α−アミド化酵素のおよその分子量を報告した最初の
著者は、ブラドブリー・エイ・エフ等であり、彼等はネ
イチャー,298号,1982年,686〜688頁に報告している。彼
等はセファデックス（Sephadex）Ｇ−100を用いて約60,
000ドルトンの最小見掛分子量を提示した。
その後の研究により、酵素の分子量が60,000〜70,000
ドルトンであることが提示された。これら研究に関する
文献としては、フサイン・アイおよびテート・エス・エ
ス、FEBSレターズ,152巻,2号,1983年,277〜281頁；エイ
パー・ビー・エイ,PNAS,167巻,1号,1984年,160〜164
頁；およびキザー・ジェー・エス（Kizer J.S.）等、PN
AS,81巻,1984年,3228〜3232頁がある。
エイパー等,PNAS,80巻,1983年,5144〜5148頁は、最大
酵素活性を得るために、分子酵素の外に２つの共同因
子、即ちアスコルビン酸と銅（II）イオンが必要である
ことを報告した。
ペプチドの炭素末端基をアミド化する化学反応には、
アミノ基の源が必要である。ブラドブリー・エイ・エフ
等，ネイチャー,298巻,1982年,686〜688頁においては、
グリシンが開裂され、アミノ成分を末位から二番目のア
ミノ酸に付与し、アミノ酸をアミド化することを明示し
ている。アミノ基供与体としてのグリシンの必要性は他
の著者によって実証された。
ランディモアー・エイ・イー・エヌ（Landymore A.E.
N.）等、BBRC,117巻,1号,1983年,289〜293頁は、Ｄ−ア
ラニンもまたアミド化反応においてアミノ供与体として
作用することを明示している。ギザー等によるその後の
研究、即ちPNAS,81巻,1984年,3228〜3232頁は、α−ア
ミド化反応に触媒として作用することのできるラットの
脳における２つの異なった酵素活性物質を示している。
高分子量の酵素（70,000ドルトン）は基質の炭素末端に
おけるグリシンに限定した特異性を有する。低分子量酵
素には、カルボキシル基を末端に有するアミノ酸として
β−アラニンを含む基質が用いられる。
ブタの下垂体から抽出され、部分的に精製されたα−
アミド化酵素に最適のpHは約7.0であり、このことはブ
ラドブリー・エイ・エフおよびスミス・ディー・ジー,B
BRC,112巻,2号,1983年,372〜377頁に報告されている。
エイパー・ビー・エイ等、PNAS,80巻,1983年,5144〜514
8頁は、ラットの下垂体から部分的に精製されたアミド
化酵素の最適pHが７であることを報告した上記結果を立
証した。彼等はまた6.5以下または7.5以上のpHで酵素活
性が急速に低下することを述べた。
上記文献のすべてにおいて、抽出物および部分的に精
製した酵素混合物は、α−アミド化酵素に加えて使用可
能な基質および生成物を減成する蛋白分解酵素を追加的
に含んでいた。
従って本発明の目的は、ペプチドまたはポリペプチド
基質を生成するために、酵素に特異な単クローン性抗体
を製造するために、かつ酵素を暗号化する異種DNAを含
む多細胞から隔離された原核生物または他の適切な単細
胞生物または宿主細胞を育成するために有効に用いられ
る精製α−アミド化酵素を提供することである。本発明
のこの目的および他の目的は、当業者にとって次の詳細
な記載から明らかになるであろう。
発明の要約 本発明は精製α−アミド化酵素、その用途、酵素に特
異な単クローン性抗体、および酵素を暗号化する異種遺
伝性物質を含む多細胞から隔離された原核生物または他
の単細胞生物または宿主細胞に関する。さらに詳しく述
べると、本発明は、骨髄甲状腺癌から抽出可能な酵素で
あり、約60,000〜65,000ドルトンの分子量を有し、SDS/
ポリアクリルアミドゲル上で行われる電気泳動法によっ
て単一で均質で明確なバンドを表すように精製され、か
つ蛋白1mg当り少なくとも50mUの特異な酵素活性度を有
する精製ペプチジル（peptidyl）−グリシンα−アミド
化モノオキシゲナーゼに関する（1Uは37℃およびpH7.0
で１分間で１マイクロモルのDansyl−Ｄ−Tyr−Val−Gl
y−COOHを１マイクロモルのDansyl−Ｄ−Tyr−Val−CON
H2に転化する指数である）。また本発明は、遊離または
固定の精製酵素、アスコルビン酸塩および銅の存在の下
において、この基質を酵素と反応させることにより、末
端グリシン残基を含むペプチドまたはポリペプチド基質
からα−アミド化ペプチドを製造する方法を提供する。
さらに本発明は、精製酵素に対する単クローン性抗体の
生成、およびペプチジル−グリシンα−アミド化モノオ
キシゲナーゼを暗号化する異種DNAを含む多細胞から隔
離された原核生物、他の単細胞生物または宿主細胞の発
育に関する技術を提供する。
発明の説明 ここに開示されるように、均質に精製されたα−アミ
ド化酵素は、固体腫瘍組織抽出物、腫瘍細胞系およびこ
のような細胞系の組織培地からサイズ排除クロマトグラ
フィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの組合せを
採用する多段工程により得られる。
ロース・ビー・エイ（Roos B.A.）等，エンドクリノ
ロジー,1979年,150巻,1号,27〜32頁に述べられているよ
うに、酵素がWAG/Rij wistarラット内において増殖した
骨髄甲状腺癌から抽出された。この組織はIVI−10028と
して寄託された。また酵素は他の源、即ちヒトおよびラ
ットの骨髄甲状腺癌の細胞系から抽出された。ラットの
細胞系77（74）は、ムジンスキー・エム（Muszynski
M.）等,JBC,1983年,258巻,11678〜11683頁に述べられて
いるように、連続継代によってラットの骨髄甲状腺癌か
ら誘導された。この細胞系はIVI−10029として寄託され
た。ヒトの細胞系HTT54（34）が、オハイオ州のリーブ
ランド市のブイ・エイ・メジカル・センター（V.A.Medi
cal Center）においてビー・エイ・ロース（B.A.Roos）
により主要培養のためにヒト骨髄甲状腺癌細胞を用いて
増殖された。このヒト細胞系HTT54（34）はIVI−10031
として寄託された。ヒトおよびラットの両方からの明確
な組織培地は、かなりな量のα−アミド化酵素活性を含
んでいることが立証され、このことは酵素の一部が細胞
から分泌されていることを示している。
酵素は最初に粗原料をアニオン交換クロマトグラフィ
ーで処理することにより得られ、精製される。例えば、
試料はファットマン・リミテッド（Whatman Limited）
から販売されているDE−52樹脂のような予備的アニオン
交換カラムに一度に装填される。次に、α−アミド化活
性含有生成物はサイズ排除クロマトグラフィーにおいて
適切な分解能を有する樹脂、例えばファーマシア・ファ
イン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals）から入
手できるセファクリル（Sephacryl）Ｓ−200超精密カラ
ムにより処理される。次に活性含有溶離留分は強力なア
ニオン交換マトリックスを用いるイオン交換クロマトグ
ラフィーにより処理される。使用される樹脂はファーマ
シア・ファイン・ケミカルズから入手できるモノ（Mon
o）QHR5/5の強力なアニオン交換樹脂であり、酵素を均
質に精製するためには、このクロマトグラフィーのカラ
ムを１回以上通過させることが必要である。各精製段階
においては、蛋白含有量およびα−アミノ化活性のレベ
ルの両方についてモニターすることができる。この情報
は酵素の相対純度の指示薬として働く酵素の特定の活性
を算出するために使用される。
得られた酵素は約60,000〜65,000ドルトンの分子量を
有するペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲ
ナーゼである（ラットからの場合IVI−10032;ヒトから
の場合IVI−10033）。酵素は蛋白1mg当り少なくとも約2
5mU、好ましくは少なくとも約50mUの特定の酵素活性
（蛋白1mg当りのα−アミド化活性の単位数）を表すよ
うに精製された。また酵素はドデシル硫酸ナトリウム／
ポリアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）上の電気泳動後
に単一で均質で明確なバンドを表すように精製された。
精製されたペプチジル−グリシンα−アミノ化モノオ
キシゲナーゼは、末端グリシン残基を有するポリペプチ
ドのアルファカルボキシル基をアミド化するために使用
され、この場合、グリシンはアミノ基供与体として作用
する。基質のペプチドまたはポリペプチドは、天然の源
から精製され、またはその構成アミノ酸から合成され、
または組換型DNA技術によって生成することができる。
グリシンを末端に有するポリペプチドは、有効量の酵素
の存在の下において酵素と結合される。必要な酵素の量
は、次に列挙したように、この技術分野において周知の
幾かの変数によって決まる。即ち、与えられた酵素製剤
の特定の活性度、転化される基質の量および化学的性
質、転化時間、反応混合物の温度およびpHである。な
お、これら変数は限定的なものではない。与えられた状
況において要求される正確な酵素の量に影響を及ぼす他
の変数については、当業者により選定される。通常、計
算量の酵素が用いられるが、過剰量の酵素は反応に影響
を与えない。銅イオンが存在することもまた必要であ
り、この銅イオンは銅塩から供給されるが、この銅塩の
アニオンは上記反応に悪影響を及ぼさないものである。
酵素が蛋白1mg当り約1mUの特定の酵素活性度を有する
時、最大α−アミド化は4.7uM銅イオンの濃度で起こ
る。酵素の純度が増加するにつれて、外因性銅イオンの
所要濃度が低くなる。また、酵素の活性度はアスコルビ
ン酸イオンの存在により高められ、このアスコルビン酸
イオンはその塩により供給することができ、この塩のカ
チオンが上記反応に悪影響を及ぼさない限り、どのよう
な塩も使用可能である。蛋白1mg当り約50mUの特定の酵
素活性度を有する精製酵素に対して、最大α−アミド化
が約5.5mMのアスコルビン酸塩濃度で起こる。α−アミ
ド化の活性度はカタラーゼの添加により増加される。α
−アミド化反応における最適pHは6.5〜7.5である。
ペプチジル−グリシンα−アミド化モノオキシゲナー
ゼは充分に精製されているので、標準的な方法によって
酵素に対する単クローン性抗体を得ることが可能であ
る。この単クローン性抗体により、骨髄甲状腺癌から酵
素を回収する方法が容易となり、またはこの回収方法の
代わりに免疫吸収精製法が全体的に取って代わる。また
酵素は充分に精製されているので、そのアミノ酸の配列
順序を決定することができる。この情報は酵素を暗号化
する遺伝物質を隔離するために、かつこの後、ペプチド
グリシンα−アミド化酵素を暗号化するDNAを含んでい
ない多細胞生物から隔離された適切な単細胞生物または
宿主細胞に上記遺伝物質を取込むために必要である。こ
のことは標準的な組換型DNA方法により行われ、このDNA
方法については、例えばマニアティス・イー・エフ（Ma
niatis E.F.）等，モレキュラー・クローニング（Molec
ular cloning）：エイ・ラボトリー・マニュアル（A La
boratory Manual），コールド・スプリング・ハーバー
（Cold Spring Harbor）,1982年、またはウ・アール・
エド（Wu R.ed.），メソッズ・イン・エンジモロジー
（Methods in Enzymology）,68巻，アカデミック・プレ
ス（Academic Press）,1979年に述べられている。ペプ
チジル−グリシンα−アミド化酵素を暗号化する異種DN
Aを含有する得られた細胞により、充分な量の酵素が生
成され、生体内において翻訳後のα−アミド化を行うこ
とができ、かつこれら細胞が生体内においてペプチドま
たはポリペプチドを変性することができる。
本発明の精製酵素のα−アミド化活性は放射性ヨウ素
化Ｄ−Tyr−Val−Glyの物質を用いて立証され、配列順
序がメラミン細胞のカルボキシル末端基に類似するペプ
チドはホルモン前駆物質を刺激した。効力検定は100mM
TES（Ｎ−トリス〔ヒドロキシメチル〕メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸）緩衝液中においてpH7.0で37℃
で３時間行われた。生成物（125I）Tyr−Val−NH2がカ
チオン交換クロマトグラフィーによって基質から分離さ
れた。またアミド化酵素活性は、カルシトニン、即ち 〔Tyr25Gly33〕カルシトニン（26〜32）のカルボキシ
ル末端基の配列順序に類似する合成基質を用いて立証さ
れた。
本発明はその好ましい具体例について述べられたが、
多くの変化および変更は当業者にとって明らかである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） 微生物の受託番号 ＡＴＣＣ ７５１４６ 審判番号 平5−18363 (72)発明者 ジヨーンズ、バリー・エヌ アメリカ合衆国 07403ニユージヤージ ー州ブルーミングデイル、ウオーターフ オール・ビレツジ52 (56)参考文献 Ｎａｔｕｒｅ，298（12）（1982）Ｐ. 686−688 ＴＨＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＢＩ ＯＬＯＧＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳＴＲ Ｙ，259（10），（1984）Ｐ．6385− 6392 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．，80，（1980）Ｐ．5144−5188 ＰＥＰＴＩＤＥＳ，４，（1983）Ｐ. 921−928

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】Ｃ−末端のアミノ酸位置にアミノ基を有す
    る対応アミド化ペプチドにペプチド基質を転化する生体
    外反応の触媒として機能するα−アミド化酵素からなる
    酵素組成物であって、該酵素組成物が十分に純粋なα−
    アミド化酵素からなり、酵素組成物中に存在する蛋白1m
    g当り少なくとも25mUの特定酵素活性度を示し、かつ該
    酵素組成物が天然原料から精製して得た基質または組換
    型DNA技術により得た基質と共に使用するのに好適であ
    るよう、測定可能な該酵素の分解を引き起こすプロテア
    ーゼ等の蛋白分解不純物が実質的に存在しない酵素組成
    物。
  2. 【請求項２】骨髄甲状腺癌組織、骨髄甲状腺癌細胞系お
    よび該細胞系からの組織培地からなる群から選択された
    少なくとも一種の原料から得られたα−アミド化酵素を
    含有する特許請求の範囲第１項に記載の酵素組成物。
  3. 【請求項３】該特定酵素活性度が、存在する蛋白1mg当
    り少なくとも50mUである特許請求の範囲第１項に記載の
    酵素組成物。
  4. 【請求項４】該基質がペプチド鎖のＣ−末端においてグ
    リシン残基を含有する特許請求の範囲第１項に記載の酵
    素組成物。
  5. 【請求項５】該α−アミド化酵素がSDS−PAGE上で単一
    な均一バンドを示す程度に十分な純度を有する特許請求
    の範囲第１項に記載の酵素組成物。
  6. 【請求項６】該α−アミド化酵素がペプチジル−グリシ
    ンα−アミド化モノオキシゲナーゼである特許請求の範
    囲第１項に記載の酵素組成物。
  7. 【請求項７】該α−アミド化酵素が60,000から65,000kD
    aの間の分子量であり、且つ哺乳類酵素である特許請求
    の範囲第１項に記載の酵素組成物。
  8. 【請求項８】該α−アミド化酵素が60,000から65,000kD
    aの間の分子量であり、且つラットあるいはヒト酵素で
    ある特許請求の範囲第１項に記載の酵素組成物。
  9. 【請求項９】Ｃ−末端のアミノ酸位置にアミノ基を有す
    る対応アミド化ペプチドにペプチド基質を転化する生体
    外反応の触媒として機能するα−アミド化酵素からなる
    酵素組成物であって、該酵素組成物が十分に純粋なα−
    アミド化酵素からなり、酵素組成物中に存在する蛋白1m
    g当り少なくとも25mUの特定酵素活性度を示し、かつ該
    酵素組成物が天然原料から精製して得た基質または組換
    型DNA技術により得た基質と共に使用するのに好適であ
    るよう測定可能な該酵素の分解を引き起こすプロテアー
    ゼ等の蛋白分解不純物が実質的に存在しない酵素組成物
    の有効量の存在下にペプチド基質を生体外で反応させる
    ことからなるα−アミド化生成物の製造方法。
  10. 【請求項１０】該生体外反応を、反応を促進できる程度
    の濃度のカタラーゼの存在下で実施する特許請求の範囲
    第９項に記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】該酵素組成物が、ペプチジル−グリシン
    α−アミド化モノオキシゲナーゼからなり、かつ該基質
    がペプチド鎖のＣ−末端においてグリシン残基を含有し
    てなる特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】該基質を、天然産ペプチド、組換型DNA
    技術により得た基質、および体外アミノ酸合成により得
    た基質からなる群から選択してなる特許請求の範囲第９
    項に記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】該α−アミド化生成物がカルシトニンで
    ある特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】該α−アミド化生成物がヒトのカルシト
    ニンである特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  15. 【請求項１５】該α−アミド化酵素が60,000から65,000
    kDaの間の分子量であり、且つ哺乳類酵素である特許請
    求の範囲第９項に記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】該α−アミド化酵素が60,000から65,000
    kDaの間の分子量であり、且つラットあるいはヒト酵素
    である特許請求の範囲第９項に記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】該生体外反応を、第２銅イオン、分子状
    酸素および還元剤からなる群から選択された少なくとも
    一種の物質の存在下で実施する特許請求の範囲第９項に
    記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】該還元剤としてアスコルビン酸塩を使用
    する特許請求の範囲第17項に記載の製造方法。
  19. 【請求項１９】Ｃ−末端のアミノ酸位置にアミノ基を有
    する対応アミド化ペプチドにペプチド化合物を転化する
    生体外反応の触媒として機能するα−アミド化酵素組成
    物の精製方法であって、動物組織あるいは細胞系からの
    粗製α−アミド化酵素含有抽出物をサイズ排除クロマト
    グラフィーおよび強力なアニオン交換クロマトグラフィ
    ーの両方で処理する工程、その後に該α−アミド化酵素
    活性を示す留分を集める工程からなる精製方法。
  20. 【請求項２０】該粗製α−アミド化酵素含有抽出物が、
    骨髄甲状腺癌組織、骨髄甲状腺癌細胞系およびこれらの
    いずれかからの組織培地からなる群から選択されてなる
    いずれかからの抽出物であることを特徴とする特許請求
    の範囲第19項に記載の精製方法。
  21. 【請求項２１】サイズ排除クロマトグラフィーに引続い
    て強力なアニオン交換クロマトグラフィーを実施し、か
    つ強力なアニオン交換クロマトグラフィーを該α−アミ
    ド化酵素の活性特徴を示すサイズ排除クロマトグラフィ
    ーの溶離留分の一部について実施する特許請求の範囲第
    19項に記載の精製方法。
  22. 【請求項２２】該サイズ排除クロマトグラフィーに先立
    ってアニオン交換クロマトグラフィー工程を挿入するこ
    とからなる特許請求の範囲第21項に記載の精製方法。
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