CN102309745B - 一种卵泡刺激素冻干针剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了几乎不含亚基的糖蛋白的组合物，所述的方法包括步骤：(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到溶液共晶点以下1-20℃的范围，并维持1-30小时；和(b)以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到不低于0℃，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的冻干粉末。

Description

一种卵泡刺激素冻干针剂

本申请为200810042989.7的分案申请，原申请的申请日为2008年9月17日，发明名称为“几乎不含亚基的糖蛋白的组合物及其制备方法”。 

技术领域

本发明涉及蛋白质药物的纯化领域。尤其涉及含有治疗不孕症的糖蛋白水溶液的冷冻干燥方法。 

背景技术

治疗不孕症的糖蛋白是一类结构接近的物质，包括绒毛膜促性腺激素(HCG)、绝经期促性腺素(HMG)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)，其中绝经期促性腺素是含有卵泡刺激素和黄体生成素且两者成一定比例(1∶0.1-1)的混合物。 

HCG、FSH、LH都是由α链和β链两个亚基通过非共价键的形式结合，其中它们的α亚基完全相同，具有92个氨基酸，分子量约为14500D，第52和78位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。HCG的β亚基有145-147个氨基酸，分子量22200-39000D，其中第13、30位置上的天冬酰胺以及第121、127、132、145位置是发生糖基化的地方。FSH的β亚基由111个氨基酸组成，分子量约为18000D，其中第7和24位置上的天冬酰胺是发生N-糖基化的氨基酸。而LH的β亚基由121个氨基酸组成，分子量约为14800D。 

临床上HCG、HMG、FSH、LH主要用于治疗不育症以及体外辅助生殖。它们可以从特定妇女(孕期或绝经期)的尿液中提取出来，也可通过DNA重组技术而制备。 

治疗不孕症的糖蛋白的第一代产品是上世纪60年代Serono公司的Profasi(HCG)、Pergonal(HMG)，它们的纯度都较低，含有大量杂质。上世纪80年代之后，Serono公司分别推出了Metrodin-HP，它是一种杂质含量很低的高纯度的FSH制剂；后来又推出利用DNA重组技术生产的Gonal-F(rFSH)、Luveris(rLH)等，另外，Ferring公司也推出了高纯度绝经期促性腺素- Menopur。 

由此可见，目前市场上都在致力于高纯度糖蛋白的开发和应用，来替代普通的低纯度产品，以克服普通低纯度产品中的杂蛋白造成的过敏反应。但是，通过各种纯化手段获得的高纯度糖蛋白都要经过两个阶段，即原料药阶段和制剂成品阶段。这两个阶段可以是固体形式，也可以是液体形式。一般应尽量采用固体形式而不采用液体形式，对于原料药来说，液体形式不容易保存和运输，因为液体形式必须保存在-20℃以下，否则糖蛋白容易失活；液体形式由于会遇到冻结-溶解过程，甚至是反复的冻结-溶解过程，更容易导致糖蛋白失活；液体形式还会遇到包装容器在低温下接近脆性点容易破裂的危险等。而对于制剂成品来说，液体形式除了不容易运输外，还遇到液体形式的糖蛋白药物的稳定性较差，而且必须要加防腐剂才能保证在有效期内微生物不会滋生，如公开号为CN1309567A的专利申请。 

而固体形式的获得主要是通过冷冻干燥的手段，但高纯度的糖蛋白在冷冻干燥的过程中很容易发生变性失活，其变性失活主要表现为完整分子降解成α链和β链两个亚基，而这些亚基也是杂质，它们是没有疗效或可能产生副作用的异构物，因此目前的高纯度糖蛋白的冻干制剂在投料时都要多加10-30％的量，以抵消冷冻干燥过程的失活情况，而且成品中还会产生一定量的亚基，降低了产品的纯度。造成降解失活的原因，一方面是原辅料的配方不合理，一方面是冷冻干燥的工艺需要完善。 

因此，本领域迫切需要开发出一种适合治疗不孕症的糖蛋白的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。 

发明内容

本发明旨在提供一种含有糖蛋白的水溶液的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。 

在本发明的第一方面，提供了一种亚基含量不超过10wt％的糖蛋白的组合物。 

在另一优选例中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、绝经期促性腺素、卵泡刺激素、黄体生成素、或其混合。 

在另一优选例中，所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和/或重组的人绒毛膜 促性腺激素、或其变体；所述绝经期促性腺素是人尿来源和/或重组的人绝经期促性腺素、或其变体；所述卵泡刺激素是人尿来源和/或重组的人卵泡刺激素、或其变体；所述黄体生成素是人尿来源和/或重组的人黄体生成素、或其变体。 

在另一优选例中，所述糖蛋白的组合物的亚基含量不超过5wt％。 

在另一优选例中，所述的组合物是冷冻干燥粉末。 

在本发明的第二方面，提供了一种含糖蛋白水溶液的冷冻干燥方法，所述的方法包括步骤： 

(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到溶液共晶点以下1-20℃，并维持1-30小时；和 

(b)以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到≥0℃，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的冻干粉末。 

在另一优选例中，步骤(a)中的升温速率为0.07-3℃/分钟；步骤(b)中的升温速率为0.06-1.5℃/分钟；更佳地，在步骤(a)前还包括下述步骤：将含有糖蛋白水溶液预冻0.5-5小时。 

在另一优选例中，所述的含有糖蛋白水溶液中糖蛋白的浓度为1μg/mL-80mg/mL；更佳地，浓度为500μg/mL-60mg/mL。 

在另一优选例中，步骤(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中的糖蛋白是高纯度糖蛋白。 

在另一优选例中，在步骤(b)中得到含有亚基含量≤10wt％的糖蛋白的冻干粉末；更佳地，亚基含量≤5wt％；最佳地，亚基含量≤3wt％。 

在另一优选例中，步骤(a)中所述的含有糖蛋白水溶液中还含有选自下述一种或多种糖类保护剂：乳糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、右旋糖酐；所述的糖类保护剂在含有糖蛋白水溶液中的浓度为2-60mg/ml。 

在另一优选例中，所述的糖蛋白选自绒毛膜促性腺激素、卵泡刺激素、黄体生成素、绝经期促性腺素、或其混合。 

在另一优选例中，所述绒毛膜促性腺激素是人尿来源和/或重组的人绒毛膜促性腺激素、或其变体；所述绝经期促性腺素是人尿来源和/或重组的人绝经期促性腺素、或其变体；所述卵泡刺激素是人尿来源和/或重组的人卵泡刺激素、或其变体；所述黄体生成素是人尿来源和/或重组的人黄体生成素、或其变体。 

在本发明的第三方面，提供了一种如上所述的本发明提供的组合物在用于制备治疗不育综合症的药物中的用途。 

在本发明的第四方面，提供了一种如上所述的本发明提供的方法制备得到的糖蛋白。 

在本发明的第五方面，提供了一种如上所述的本发明提供的方法制备得到的糖蛋白在用于制备治疗不育综合症的药物中的用途。 

据此，本发明提供了一种适合治疗不孕症的糖蛋白的冷冻干燥方法，并由此获得几乎不含亚基的糖蛋白药物。 

附图说明

图1显示了实施例1中冷冻干燥前的FSH的液相图谱。 

图2显示了实施例1中冷冻干燥后的FSH的液相图谱。 

具体实施方式

发明人在实验中发现，冷冻干燥过程中，同样的冻干工艺对于象胰蛋白酶抑制剂(UTI)等单链结构的蛋白质和象HCG、FSH、LH等双链结构的糖蛋白的影响是不同的，前者几乎没有任何失活现象，而后者很容易降解出亚基并表现出失活的结果。因此，本发明人经过广泛而深入的研究，惊奇地发现，在冷冻干燥过程中，过快的升温过程是导致糖蛋白的降解从而发生变性失活的主要原因。正如前所述，此类糖蛋白都由两条链以非共价键的形式结合，也就是以疏水作用、氢键等较弱的力来维系，它们与辅料等其它组成物在预冻过程均匀分布在水分子的冰晶中，然而在过快的升温过程中，搁板会以较大的热流速率传递给产品的冰晶结构，而且此时冻干机腔内的真空度非常高，因此就使得冰晶内的水分子在较短的时间内迅速升华变成水蒸气分子，在这个快速升华的过程中，水分子以很快的速率“飞”出冰晶结构，就会促使此类双链糖蛋白的亚基之间的氢键、疏水作用等较弱的维系力发生改变，从而导致亚基解离，产品发生失活。 

在探索过程中，本发明人注意到，通过在冷冻干燥过程中控制合理的升 温速率，可以降低或几乎不产生亚基的降解，从而保持了产品的活性，减少杂质的产生。 

定义 

如本文所用，“糖蛋白”选自下述的一种或多种混合：绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin，CG)、卵泡刺激素(follicule-stimulating hormone，FSH)、黄体生成素(luteotropic hormone，LH)、绝经期促性腺素(human menopausalgonadotropin，HMG)。 

如本文所用，“含糖蛋白水溶液”、“含有糖蛋白水溶液”、“含糖蛋白的水溶液”和“含有糖蛋白的水溶液”可以互换使用，都是指一种水溶液，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和药学上/食品学上可接受的载体。 

如本文所用，“糖蛋白的组合物”是指含有糖蛋白的组合物，是一种固体，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和药学上/食品学上可接受的载体；优选含有糖蛋白的冻干粉末。 

如本文所用，“含有糖蛋白的冻干粉末”是一种固体粉末，其中包括糖蛋白，或者包括糖蛋白和药学上/食品学上可接受的载体。 

如本文所用，“亚基”是指CG、FSH、LH、HMG的经过解离后产生的单独的α链亚基或β链亚基。 

如本文所用，“高纯度糖蛋白”是指纯度大于90％，优选大于95％的糖蛋白。在本发明的优选例中，将高纯度糖蛋白进行冷冻干燥，得到亚基含量≤10wt％的糖蛋白。 

如本文所用，术语“药学上可接受的”或“食品学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。 

如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。 

所述的“药学上可接受的载体”可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、 助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。 

术语“卵泡刺激素”和“FSH”可互换使用，都是指一类用于促进精子或卵泡产生、促进卵巢发育的激素或其变体。在天然情况下由垂体前叶分泌，也可从绝经期妇女的尿液中提取或可通过重组技术获得的。本发明中的FSH可采用本领域常用的任何方式获得，例如天然产生、通过重组技术获得或合成，其中的杂质包括LH或CG。在本发明的一个实施方式中，所述卵泡刺激素是人卵泡刺激素或其变体，优选人尿来源的卵泡刺激素或是重组的人卵泡刺激素。 

优选在采用本发明的方法纯化FSH前，采用本领域常规方法对原料FSH进行初步纯化，以分离除LH或CG以外的其它杂质。 

如本文所用，术语“黄体生成激素”和“LH”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然LH具有相同或相似结构和功能的激素。 

类似地，术语“绒毛膜促性腺激素”和“CG”可互换使用，指在含有FSH的原料制备或获取过程中掺杂于其中的与天然CG具有相同或相似结构和功能的激素。 

如本文所用，术语“搁板”是指一种冷冻干燥机的传热装置结构，每层搁板内都有导热介质如硅油进行循环传热。本领域技术人员所熟知的冷却/加热装置中一般都有这样的结构。 

如本文所用，术语“搁板温度”是指搁板内的导热介质所达到的温度。 

如本文所用，术语“冷肼”是指在冷却的表面上以凝结方式捕集气体的阱。置于真空容器和泵之间，用于吸附气体或捕集油蒸汽的装置。 

如本文所用，术语“升华干燥”是指在共晶点以下1-20℃的温度范围内进行真空干燥以使得冰直接转变为水蒸气的干燥过程。如本文所用，术语“解析干燥”是指将升华干燥后还不能完全去除的结构水通过加热蒸发去除的干燥过程。 

如本文所用，术语“预冻”是指真空冷冻干燥前先使被干燥的糖蛋白或其组合物形成冻结状态。在预冻阶段，要严格控制预冻温度(通常比样品的共晶点低10度以上)，较佳地为-30--50℃。 

冷冻干燥 

本发明提供的含糖蛋白水溶液的冷冻干燥方法，包括步骤： 

(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分钟的升温速率将搁板温度升到升华干燥温度，并维持1-30小时；和 

(b)以0.05-5℃/分钟的升温速率将温度升到解析干燥温度，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的冻干粉末。 

在本发明的一个优选例中，含糖蛋白的水溶液冷冻干燥方法包括步骤： 

(1)将含有糖蛋白的水溶液预冻0.5-5小时； 

(2)真空下以0.05-5℃/分钟的升温速率将温度升到升华干燥温度(最佳地升温速率为0.07-3℃/分钟)，并维持1-30小时(最佳地在升华干燥温度维持6-20小时)；和 

(3)以0.05-5℃/分钟的升温速率将温度升到解析干燥温度(最佳地升温速率为0.1-1.5℃/分钟)，并维持1-20小时(最佳地在解析干燥温度维持3-10小时)，得到含有糖蛋白的冻干粉末。 

更佳地，本发明用本发明提供的方法对含有高纯度糖蛋白的水溶液进行冷冻干燥，得到的含有糖蛋白的冻干粉末中，糖蛋白中亚基含量≤10％(最佳地≤5％)。 

本发明还提供糖蛋白的组合物的制备方法，所述的方法包括步骤： 

(a)真空下将经过预冻的含有糖蛋白水溶液以0.05-5℃/分钟的升温速率将温度升到升华干燥温度，并维持1-30小时；和 

(b)以0.05-5℃/分钟的升温速率将温度升到解析干燥温度，并维持1-20小时，得到含有糖蛋白的组合物，所述的组合物优选含有糖蛋白的冻干粉末。所述的组合物是亚基含量不超过10wt％的糖蛋白的组合物。 

本发明的优点在于： 

提供的冷冻干燥方法，可以降低或几乎不产生亚基的降解，从而保持了糖蛋白的活性，减少杂质的产生，可以获得几乎不含亚基的糖蛋白或其组合物。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

实施例中的亚基含量均由以下方法测定得到： 

液相色谱法： 

色谱柱：Superdex75 10×400mm或类似柱； 

流动相：0.2M Na₂HPO₄(pH6.5)∶乙腈＝10∶2 

流速：0.5ml/min 

进样浓度和体积：约60μg/ml×100μl 

检测波长：215nm 

亚基峰与主成分峰的保留时间比约为1.2，用面积归一法进行亚基含量的计算。 

实施例1 

FSH的冷冻干燥 

配制50mL 0.01M磷酸二氢钠溶液(用NaOH调pH约6.5)，加入2g乳糖，搅拌溶解后，用0.22μm过滤器过滤。取10mL滤过液，加入10.0mg上述高纯度FSH(购自上海天伟生物制药有限公司)(生物效价为8817国际单位/mg)，完全溶解后，此溶液的共晶点约为-2℃，装盘放入冻干机(购自Virtis)中，按如下程序进行冷冻干燥： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度以0.125℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持15小时； 

5.搁板温度以0.3℃/min的速率从-10℃升温至+20℃，搁板温度达到+20℃后维持5小时； 

6.出箱，得392mg冻干粉末。 

经测定，FSH的生物效价结果如下： 

对照例 

在本对照例中，除冻干工艺按如下进行外，其它步骤都与上述实施例1的方法一致。 

对照例的冷冻干燥程序： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度从-40℃直接升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持18小时； 

5.搁板温度从-10℃直接升温至+20℃，搁板温度达到+20℃后维持6小时； 

6.出箱，得398mg冻干粉末。 

经测定，FSH的生物效价结果如下： 

实施例1与对照例的结果表明，用本发明的冷冻干燥工艺可以明显降低亚基的产生，并提高冻干得率。 

实施例2 

FSH冻干针剂的制备 

用于制造10000瓶FSH冻干针剂，且每瓶含75IU FSH的生产的典型例子如下： 

计算出的一定量(以生物效价为单位)的FSH精品溶解于50mL注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，然后用0.22μm过滤器进行无菌过滤。 

将100g乳糖溶解于2L注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，用0.22μm过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用无热原水定容至7.5L，混匀。此溶液的共晶点约为-2℃。 

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，按如下程序进行冷冻干燥： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度以0.5℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持10小时； 

5.搁板温度以0.375℃/min的速率从-10℃升温至+35℃，搁板温度达到+35℃后维持10小时； 

6.压塞，出箱。 

所得到的安瓿瓶中，每瓶含75IU FSH和10mg乳糖。 

经HPLC测定，其亚基含量如下： 

实施例3 

高纯度绝经期促性腺素(hpHMG)的制备方法 

配制100mL 0.01M磷酸二氢钠溶液(用NaOH调pH约6.5)，加入4g乳糖，搅拌溶解后，用0.22μm过滤器过滤。取15mL滤过液，加入35mg高纯度绝经期促性腺素(购自上海天伟生物制药有限公司)(FSH生物效价为5131IU/mg，LH生物效价为4890IU/mg)，完全溶解后，此溶液的共晶点约为-2℃，按如下程序进行冷冻干燥： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度以0.125℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持15小时； 

5.搁板温度以0.3℃/mi n的速率从-10℃升温至+20℃，搁板温度达到+20℃后维持5小时； 

6.出箱，得570mg高纯度HMG粉末。测得其FSH生物效价为298IU/mg，LH生物效价为277IU/mg。经HPLC测定，其亚基含量如下： 

实施例4 

高纯度绝经期促性腺素(hpHMG)冻干针剂的制备 

用于制造10000瓶FSH冻干针剂，且每瓶含75IU FSH和75IU LH的生产的典型例子如下： 

计算出的一定量(以生物效价为单位)的hpHMG精品溶解于50mL注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，然后用0.22μm过滤器进行无菌过滤。 

将200g乳糖溶解于2L注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，用0.22μm过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用无热原水定容至7.5L，混匀。此溶液的共晶点约为-2℃。 

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，按如下程序进行冷冻干燥： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度以0.5℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持10小时； 

5.搁板温度以0.375℃/mi n的速率从-10℃升温至+35℃，搁板达到+35℃后维持10小时； 

6.压塞，出箱。 

所得到的安瓿瓶中，每瓶含75IU FSH和75IU LH以及20mg乳糖。 

经HPLC测定，其亚基含量如下： 

实施例5 

HCG冻干针剂的制备 

用于制造10000瓶HCG冻干针剂，且每瓶含5000IU的生产的典型例子如下： 

计算出的一定量(以生物效价为单位)的HCG精品溶解于50mL注射用无热原水中，如果需要的话，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，然后用0.22μm过滤器进行无菌过滤。 

将300g甘露醇和10.9g NaH₂PO₄·2H₂O溶解于3L注射用无热原水中，用NaOH调节pH 7.0±0.2，用0.22μm过滤器进行无菌过滤。然后加入到上述FSH溶液中，用注射用无热原水定容至7.5L，混匀。 

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，按如下程序进行冷冻干燥： 

1.搁板温度至-40℃预冻3小时； 

2.冷阱至-45℃； 

3.启动真空泵； 

4.搁板温度以0.5℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持10小时； 

5.搁板温度以0.375℃/min的速率从-10℃升温至+35℃，搁板温度达到+35℃后维持10小时； 

6.压塞，出箱。 

所得到的安瓿瓶中，每瓶含5000IU HCG以及20mg甘露醇。 

经HPLC测定，其亚基含量如下： 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (1)

1.一种卵泡刺激素冻干针剂，其特征在于其是由如下方法制备而成： 

制造10000瓶卵泡刺激素冻干针剂，且每瓶含75IU 卵泡刺激素；

计算出的一定量的以生物效价为单位的卵泡刺激素精品溶解于50mL注射用无热原水中，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，然后用0.22μm过滤器进行无菌过滤； 

将100g乳糖溶解于2L注射用无热原水中，用HCl或NaOH调节pH 6.5±0.2，用0.22μm过滤器进行无菌过滤；然后加入到卵泡刺激素溶液中，用注射用无热原水定容至7.5L，混匀；此溶液的共晶点为-2℃； 

将上述溶液分装入安瓿瓶中，每瓶0.75mL，按如下程序进行冷冻干燥： 

（1）搁板温度至-40℃预冻3小时； 

（2）冷阱至-45℃； 

（3）启动真空泵； 

（4）搁板温度以0.5℃/min的速率从-40℃升温至-10℃，搁板温度达到-10℃后维持10小时； 

（5）搁板温度以0.375℃/min的速率从-10℃升温至+35℃，搁板温度达到+35℃后维持10小时； 

（6）压塞，出箱。 

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