CN1086201C - 质粒dna快速提取试剂盒及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学研究领域，为一种简易快速提取质粒DNA的试剂盒及其应用方法。本试剂盒包括菌体重悬缓冲液、菌体裂解缓冲液、质粒沉淀缓冲液、异丙醇、蛋白沉淀缓冲液和DNA稀释液六种试剂。本发明与国内外相关的试剂盒相比，具有快速、简易、高效、高质、价廉和无害的优点，提取的质粒DNA(1A、2A、3A)与应用Qiagen柱式纯化试剂盒提取的相应质粒DNA(1B、2B、3B)的电泳图谱比较，电泳条带同样清晰，无RNA混杂。

Description

质粒DNA快速提取试剂盒及其应用方法

本发明涉及分子生物学研究领域，是一种简易快速提取质粒DNA的试剂盒及其应用方法。

质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最为广泛和最基本的技术。因此，国内外主要生物试剂公司都研制了与此技术有关的试剂盒，如Qiagen、Promega、华美、华顺、晶美等生物工程公司。国外的试剂盒都是以纯化柱为主体，因而成本高，价格昂贵。国内的试剂盒主要是在传统的碱裂解、酚-氯仿抽提的基础上所作的改良，其获取的质粒DNA得量低，质量不高，不能满足分子生物学实验中连接、序列测定和转染的要求，提取过程耗时长，且因酚和氯仿均为有毒物质，有异味，既污染环境，又危害实验操作人员健康。

本发明的目的是提供一种快速、简易、高效、高质、价廉、无害的提取质粒DNA的试剂盒及其应用方法。

在质粒DNA提取技术中，要获取质量好、纯度高的质粒DNA，关键技术在于菌体裂解、蛋白质和RNA的消除。本发明的核心部分是所用试剂采用不同pH和不同浓度的盐，用分步沉淀法取代酚-氯仿抽提法去除蛋白质和RNA，所提取的质粒DNA纯度能满足分子生物学有关实验的要求，包括克隆鉴定、酶切、连接、序列测定和转染等。本发明包括6种试剂，即菌体重悬缓冲液(R1)；菌体裂解缓冲液(R2)；蛋白沉淀缓冲液(R3)；异丙醇(R4)；蛋白沉淀缓冲液(R5)；DNA稀释液(R6)。它们的组成及配比分别为：

试剂R1：

组分：50mmol  葡萄糖

      25mmol  Tris-Hcl(pH8.0)

      10mmol  EDTA(pH8.0)

      5mg/ml  溶菌酶

配比：配制100ml R1

取葡萄糖(COH₁₂O₆.H₂O)0.991克

双蒸水                  80ml

0.5mol EDTA(pH8.0)      2ml

1mol Tris-Hcl(pH8.0)   2.5ml

用双蒸水定容至100ml，10Ibf/in²(6.895×10⁴Pa)高压灭菌15分钟，再加入500mg溶菌酶。按25次使用量分装5.6ml于不透光塑料瓶，4℃保存。

试剂R2：

组分：0.2mol NaOH

      1％SDS

配比：配制100ml R2

取10mol NaOH      2ml

双蒸水            80ml

10％SDS           10ml

用双蒸水定容至100ml，按25次使用量分装11.2ml于不透光塑料瓶，室温保存。

试剂R3：

组分：5.0～6.0mol醋酸铵(或醋酸钠)，最佳醋酸铵(或醋酸钠)浓度为5.5mol。

配比：配制100ml R3

取醋酸铵        42.4g

双蒸水          80ml

搅拌溶解后，调至pH7.4～7.6，其优选pH值7.5，用双蒸水定容到100ml，按25次使用量分装8.4ml于不透光塑料瓶，室温保存。

试剂R4：异丙醇(分析纯)为商品化试剂。

试剂R5：

组分：1.2～1.6mol醋酸铵(或醋酸钠)，最佳醋酸铵(或醋酸钠)浓度为1.4mol。

配比：配制100mlR5

取醋酸铵    10.8g

双蒸水      80ml

搅拌溶解后，调至pH7.2～7.3，其优选pH值为7.25。用双蒸水定容至100ml，按25次使用量分装2.8ml于不透光塑料瓶，室温保存。

试剂R6：

组分：TE缓冲液(pH7.6)     100ml

      RNase A             10mg

      RNase T             10000万单位

配比：配制100mlTE缓冲液

取Tris盐(分析纯)      1.58g

EDTA(分析纯)          0.372g

双蒸水                80ml

搅拌溶解后，调至pH7.6，用双蒸水定容至100ml，加入RNase A 10mg和RNase T 10000万单位，按25次使用量分装0.56ml于不透光塑料瓶，4℃保存。

本发明主要的优点为：操作简便，结果稳定；耗时短，80分钟左右可完成全部过程；得量高，对一高拷贝质粒，常规培养16小时，当细菌生长密度OD₆₀₀约为3.5时，1.5ml菌液可获得10μg～15μg DNA；纯度好，无蛋白质和RNA污染，提取的质粒DNA可供内切酶酶切、连接、序列测定、真核细胞转染等分子生物学实验用；价廉，与国内外同类产品比较，价格降低20％～40％；由于不需用酚和氯仿，既消除了环境污染之虑，又对实验操作人员身体无害。

应用本试剂盒提取质粒DNA可按下列方法操作：

1.按常规摇菌扩增质粒(详见《分子克隆实验指南》)；

2.取常规培养16小时，细菌生长密度OD₆₀₀约为3.5的菌液1.5ml于1.5ml离心管，

  室温以12000rpm离心30秒钟，弃上清；

3.沉淀中加200μl R1，充分振荡混匀；

4.加入400μl R2，轻轻颠倒5次后置冰浴2分钟；

5.加入预冷的300μl R3，轻轻颠倒5次后置冰浴2分钟；

6.室温以12000rpm离心5分钟；

7.收集上清，加入600μl R4混匀后置室温2分钟；

8.室温以12000rpm离心10分钟；

9.弃上清，立即加入100μl R5重悬沉淀后置冰浴2分钟；

10.室温以12000rpm离心5分钟；

11.收集上清，加入100μl R4混匀；

12.室温以12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6，

   37℃水浴15分钟；

13.加入10μl R3和30μl R4混匀，室温2分钟；

14.室温以12000rpm离心10分钟，弃上清；

15.沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE缓冲液，-20℃保存备用；

所得质粒DNA可用0.8％琼脂糖凝胶电泳加以验证。

图1显示对含同一质粒DNA的菌体应用本试剂盒和应用Qiagen柱式纯化试剂盒提取的质粒DNA电泳对照图谱。图中，M为λDNA/HindIII分子量标志物，1A、2A、3A为使用本试剂盒所提取的质粒DNA，1B、2B、3B为使用Qiagen柱式纯化盒所提取的相应质粒DNA。从图中看出用两种试剂盒所得的质粒DNA，电泳条带清晰，无RNA混杂。说明使用本发明提取的质粒DNA与使用Qiagen柱式纯化试剂盒提取的同一质粒DNA比较，在纯度和得量方面无明显区别。

Claims (6)

1.一种提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于包括菌体重悬缓冲液R1、菌体裂解缓冲液R2、蛋白沉淀缓冲液R3、异丙醇R4、蛋白沉淀缓冲液R5和DNA稀释液R6六种试剂，R1的组分为50mmol葡萄糖，25mmol Tris-Hcl，pH8.0，10mmol EDTA，pH8.0，5mg/ml溶菌酶；R2的组分为0.2mol NaOH，1％SDS；R3的组分为5.0～6.0mol醋酸铵或醋酸钠，pH7.4～7.6；R4为分析纯的异丙醇；R5的组分为1.2～1.6mol醋酸铵或醋酸钠，pH7.2～7.3；R6的组分为TE缓冲液中加入终浓度为0.1mg/ml RNase A和100单位/ml RNase T。

2.按权利要求1所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于所述的试剂R3的浓度为5.5mol醋酸铵或醋酸钠。

3.按权利要求1所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于试剂R3的pH值为7.5。

4.按权利要求1所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于试剂R5的浓度为1.4mol醋酸铵或醋酸钠。

5.按权利要求1所述的提取质粒DNA的试剂盒，其特征在于试剂R5pH值为7.25。

6.权利要求1所述的提取质粒DNA试剂盒的应用方法，其特征在于按如下步骤操作：

(1)按常规摇菌扩增质粒；

(2)取经常规培养16小时，细菌生长密度OD₆₀₀约3.5的菌液1.5ml于1.5ml离心管，

   室温以12000rpm离心30秒钟，弃上清；

(3)沉淀中加200μl R1，充分振荡混匀；

(4)加入400μl R2，轻轻颠倒5次后置冰浴2分钟；

(5)加入预冷的300μl R3，轻轻颠倒5次后置冰浴2分钟；

(6)室温以12000rpm离心5分钟；

(7)收集上清，加入600μl R4混匀后置室温2分钟；

(8)室温以12000rpm离心10分钟；

(9)弃上清，立即加入100μl R5重悬沉淀后置冰浴2分钟；

(10)室温以12000rpm离心5分钟；

(11)收集上清，加入100μl R4混匀；

(12)室温以12000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于20μl R6，

    37℃水浴15分钟；

(13)加入10μl R3和30μl R4混匀，室温2分钟；

(14)室温以12000rpm离心10分钟，弃上清；

(15)沉淀用75％乙醇洗，干燥后溶于15μl TE缓冲液，-20℃保存备用；