CN111778237B - 一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，其特征在于：所述的试剂体系包括体积份的裂解液480‑520份、蛋白酶K 0.008‑0.012份、除脂液0.4‑0.6份、去蛋白液0.4‑0.6份、磁珠缓冲液0.4‑0.6份、硅羟基磁珠0.02‑0.04份、洗涤缓冲液A 0.8‑1.2份，洗涤缓冲液B 0.8‑1.2份和洗脱缓冲液0.08‑0.12份组成的试剂体系；所述的提取方法包括样品前处理、裂解、去蛋白、去脂、核酸富集、洗脱等步骤。有效去除样品中脂类、盐类等杂质，大大提高了产物纯度和得量，具有安全、快捷、高效、所得产物符合下游试验要求的特点。

Description

一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系。
背景技术
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。
核酸提取为大量广泛研究和应用提供了信息与材料，比如克隆、Qrt-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术，获得的核酸材料可以多种方式进行应用。核酸提取主要为使细胞或组织样品裂解，首先保证核酸一级结构的完整性，其次要排除其它分子的污染，去除非核酸污染物，如蛋白质、脂类、盐类等杂质。提取核酸时要简化步骤，缩短提取时间，减少化学因素对核酸的降解，减少物理因素对核酸的降解，减少机械剪切力和高温的影响，以及生物降解。
传统提取方法在提取过程中需要用到氯仿、苯酚等有毒试剂，会对人体健康和环境造成危害。而且提取时间长，提取步骤繁琐，需要进行反复地离心操作，容易造成机械剪切，得率不稳定。
目前使用生物磁珠提取核酸，相比于传统的异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法，稳定快速，完整性好。磁珠法通用的操作流程：裂解、结合、洗涤、洗脱。随着磁珠法核酸提取技术的日益普及，基于磁珠法核酸提取开发的全自动核酸提取仪，因其高通量、自动化、减少操作者与试剂及样本的接触、减少人工操作引起的误差，结果稳定，重复性好等特点使得全自动核酸提取仪越来越被市场所接受。
动物深加工制品在加工过程中会加入大量油脂、调味品、防腐剂、添加剂等，干扰核酸提取中产物的洗涤纯化。而且一般会经过高温、油炸、脱水等处理，使得核酸片段较小，含量较低，不易提取。深加工制品消化较困难，杂质较多，对试剂体系及试剂盒的性能要求较高，大多数操作过程需要高温孵育，造成实验室气溶胶污染严重。同时市场上其他在售生物磁珠类试剂盒提取所得核酸产物浓度和纯度过低，不能很好符合下游试验如qPCR、测序等要求，在实际检测过程中容易出现假阴性。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，填补了动物深加工制品的高纯核酸提取的空白，通过增加样品前处理，加入除脂液和改良洗涤液的方式，有效去除样品中脂类、盐类等杂质，大大提高了产物纯度和浓度，通过常温裂解和洗脱，有效避免实验室气溶胶交叉污染，具有安全、快捷、所得产物符合下游试验要求的特点。
解决以上技术问题的本发明中的一种提取动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，其特征在于：包括体积份的裂解液400-800份、蛋白酶K 0.008-0.012份、除脂液0.4-0.6份、去蛋白液0.4-0.6份、磁珠缓冲液0.4-0.6份、硅羟基磁珠0.02-0.04份、洗涤缓冲液A 0.8-1.2份，洗涤缓冲液B 0.8-1.2份和洗脱缓冲液0.05-0.15份组成的试剂体系。
优化方案中，所述试剂体系中裂解液500份、蛋白酶K 0.01份、除脂液0.5份、去蛋白液0.5份、磁珠缓冲液0.5份、硅羟基磁珠0.03份、洗涤缓冲液A1份，洗涤缓冲液B1份和洗脱缓冲液0.1份。
所述裂解液包括0.1mol/L Tris-cl，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)质量分数为5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。
所述磁珠缓冲液为异丙醇。
所述磁珠悬浮液，质量浓度为50mg/mL。
所述洗涤缓冲液A包括0.8mol/L氯化锂，1mmol/L EDTA和0.01mol/L Tris-cl,使用前加入1.5倍体积的无水乙醇并混匀。
洗涤缓冲液A需要使用时现加入无水乙醇，即若洗涤缓冲液A有100mL，则氯化锂、EDTA和Tris-Cl的混合溶液仅有40mL，使用时需现场加入60mL无水乙醇。
所述洗涤缓冲液B为体积浓度为80％的乙醇。
所述洗脱缓冲液为TE溶液。(10mmol/L Tris·Cl(pH＝8.0),1mmol/L EDTA(pH＝8.0))
所述除脂液为正己烷。非极性溶剂，与水相互不相溶，溶解脂类能力强，低毒，廉价易得，常用溶剂。
蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。主要作用为酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中。蛋白酶K(20mg/mL)。
所述去蛋白液包括盐酸胍5mol/L，Tris-cl 0.1mol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl1.0mol/L和1％的Triton X-100。去蛋白液为可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来。
本发明中每种试剂的浓度、用量、体系不同，整体效果都会发生较大变化。
去蛋白液中还包括有1％Triton X-100，Triton X-100是一种非离子表面活性剂，与CTAB这种离子表面活性剂作用类似，可以裂解细胞，而且不会中和离子表面活性剂，影响其效果，没有加在裂解液里面是因为会导致溶液过于粘稠，影响裂解液与样品的结合。
本发明中一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，进行裂解和吸附核酸包括以下步骤：
(1)对样品进行清洗、去杂、浓缩等前处理。充分洗清深加工动物制品中的非目标物以及通过物理方式破坏胶体稳定性，并分离、浓缩。
取适量样品加入50mL离心管，加入约2倍体积的75％无水乙醇，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。然后加入约2倍体积的无菌双蒸水，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。悬乳浊或浊状的液体动物制品，如酱肉、牛板筋等，可通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2mL离心管，8000g离心5min并弃去上清液，再次加入适量样品，8000g离心5min并弃去上清液。采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。
(2)加入样品至装有裂解液离心管中，再加入蛋白酶K，室温孵育消化25-35min，期间颠倒混匀3次；常温裂解，不造成气溶胶扩散而导致实验室污染；
(3)加入除脂液，混匀、离心，吸取上层液体；加入正己烷除去脂类，通过离心分离。
(4)加入去蛋白液，70-80℃温浴12-18min，期间混匀1-3次，室温静置8-12min；
(5)加入磁珠缓冲液和磁珠悬浮液，混匀后静置，静置1-3min；
(6)将离心管放置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。
(7)加入洗涤液A混匀后磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。
(8)加入洗涤液B混匀，磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体，重复1次，共2次。
(9)将离心管开盖放置于磁力架上，室温晾干10-15min。
(10)加入洗脱液，混匀，室温放置8-12min；
(11)将离心管置于磁力架上静置1-3min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至新的离心管中，低温保存。所述低温为-20℃。
所述步骤(2)中室温裂解液，加入样品前所述裂解液常温裂解，不造成气溶胶扩散而导致实验室污染，同时保证裂解效果。
步骤(10)中所述洗脱液室温洗脱，不造成气溶胶扩散，避免气溶胶污染。
洗脱可进行2次，以促进磁珠表面核酸溶解到洗脱液中，提高得量。
所述步骤(3)中震荡混匀10min，12,000rpm离心5min。
震荡混匀与颠倒混匀相同，为了避免样品沉积于底部，影响裂解效果。震荡混匀1min，静置2min，重复2次，共3次，共9min。
本方法应用本试剂体系提取动物组织核酸不需要使用苯酚、氯仿等有毒试剂，具有安全、快捷、所得产物符合下游试验要求的特点。本试剂体系适用于从动物源性深加工制品中提取高纯核酸，也可用于肌肉、器官等动物组织的核酸提取。因为前处理、消化时间不同，对于不同样品所需提取时间不同，一般总体为两个小时。
用得率来衡量(产物质量与样品质量比值)，本发明中样品得率可达到(20-80μg)/100mg，纯度OD260/280为1.8-2.0，与市售同类型试剂及试剂盒相比，具有产物纯度高、得率高的特点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明：
实施例1
试剂体系由体积份的裂解液400份、蛋白酶K 0.008份、除脂液0.4份、去蛋白液0.4份、磁珠缓冲液0.4份、硅羟基磁珠0.02份、洗涤缓冲液A 0.8份，洗涤缓冲液B 0.8和洗脱缓冲液0.08份组成。
实施例2
试剂体系由裂解液500mL、蛋白酶K10μL、除脂液500μL、去蛋白液500μL、磁珠缓冲液500μL、硅羟基磁珠30μL、洗涤缓冲液A1mL，洗涤缓冲液B1mL，洗脱缓冲液100μL组成。
实施例3
试剂体系由以下体积份组份组成：裂解液800份、蛋白酶K 0.012份、除脂液0.6份、去蛋白液0.6份、磁珠缓冲液0.6份、硅羟基磁珠0.04份、洗涤缓冲液A1.2份，洗涤缓冲液B1.2份和洗脱缓冲液0.12份。
实施例4
试剂体系由以下体积份组份组成：裂解液600份、蛋白酶K 0.009份、除脂液0.55份、去蛋白液0.45份、磁珠缓冲液0.45份、硅羟基磁珠0.035份、洗涤缓冲液A 0.9份，洗涤缓冲液B 0.9份和洗脱缓冲液0.09份。
实施例5
(1)对样品进行清洗、去杂、浓缩等前处理。充分洗清深加工动物制品中的非目标物以及通过物理方式破坏胶体稳定性，并分离、浓缩。
取适量样品加入50mL离心管，加入约2倍体积的75％无水乙醇，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。然后加入约2倍体积的无菌双蒸水，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。悬乳浊或浊状的液体动物制品，如酱肉、牛板筋等，可通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2mL离心管，8000g离心5min并弃去上清液，再次加入适量样品，8000g离心5min并弃去上清液。采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。
(2)加入样品至装有裂解液离心管中，再加入蛋白酶K，室温孵育消化30min，期间颠倒混匀3次；常温裂解，不造成气溶胶扩散而导致实验室污染；
(3)加入除脂液，混匀、离心，吸取上层液体；加入正己烷除去脂类，通过离心分离。震荡混匀10min，12,000rpm离心5min。
(4)加入去蛋白液，75℃混匀15min，放置到室温；
(5)加入磁珠缓冲液和磁珠悬浮液，混匀后静置；
(6)将离心管放置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。
(7)加入洗涤液A混匀后磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。
(8)加入洗涤液B混匀，磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体，重复一次，共两次。
(9)将离心管开盖放置于磁力架上，室温晾干10min～15min。
(10)加入洗脱液，混匀，室温放置10min；洗脱液室温洗脱。
(11)将离心管置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至新的离心管中，低温保存。所述低温为-20℃。
实施例6
对动物深加工制品进行裂解和吸附核酸的步骤如下：
(1)加入20-50mg样品至装有65℃预热的500μL裂解液的1.5mL离心管中，加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)，室温孵育30min，期间颠倒混匀3次。
(2)加入500μL除脂液，震荡混匀10min，12,000rpm离心5min。吸取上层液体，弃去。
(3)加入500μL去蛋白液，75℃混匀15min，放置到室温。
(4)加入400μL磁珠缓冲液，30μL磁珠悬浮液，震荡混匀1min，静置2min，再重复2次，共3次，共9min。
混匀时间和次数对效果影响较大，如果需要提高得率，可以适当延长混匀时间或增加次数。
(6)加入1mL洗涤液A，震荡混匀1min，磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，除去液体。
(7)加入1mL洗涤液B，震荡混匀1min，磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，除去液体，重复一次，共两次。
如果需要提高产物纯度，需要增加(6)、(7)步骤的次数，或者延长时间。
(8)将离心管放置于磁力架上，室温晾干10min～15min。
(9)加入100μL洗脱液(如需增加得量建议分2次洗脱)，震荡混匀，室温放置10min。
(10)将离心管置于磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至新的离心管中，-20℃保存。
应用本发明中试剂进行鲜样组织提取，提取步骤如实施例4，(以下溶剂均为100μLTE溶液)，检测结果如下表1：
表1
样品名称 浓度(ng/μL) OD260/280 OD260/230
牛源性参考物质 611.0 1.98 1.80
生牛肉 394.4 1.96 1.90
生鸡肉 674.4 2.12 2.09
生猪肉 310.0 1.90 1.84
(注：一般来说OD260代表核酸的吸光度，OD280代表蛋白质的吸光度，OD230代表碳水化合物的吸光度。用OD260/280和OD260/230来表示产物的纯度。)
根据表1得出，本试剂体系能有效提取动物鲜样组织基因组核酸，产物浓度、纯度高。
应用本发明中试剂对牛源性深加工制品进行提取，提取步骤如实施例4，检测结果如下表2和表3，检测所用仪器为Thermo Fisher NanoDrop 2000紫外-可见光分光光度计。依据标准：GB/T 37874-2019核酸提取纯化方法评价通则。
表2
样品名称 浓度 OD260/280 OD260/230
牛成分参考物质 787.3 1.99 1.97
牛肉干 198.9 1.85 1.28
牛板筋 89.3 1.77 1.25
灯影牛肉 156.8 1.75 0.59
表3荧光PCR扩增Ct值
MGH BGH
牛成分参考物质 26.49 23.05
牛肉干 26.81 26.96
牛板筋 32.75 30.64
灯影牛肉 31.21 30.25
根据SN/T 2557-2010，阳性对照Ct≤30，MGH的Ct≤35，DNA提取有效，BGH的Ct≤35为阳性。可以得出对于以上几种类型的样品，本试剂盒均能有效检出。
试验一
本发明中与市场同类型产品在深加工制品中提取比较，提取内容如实施例中步骤，同类型产品按照相应的操作说明进行，结果如下表4：
表4
品牌 样品 浓度(ng/μL) OD260/280 OD260/230
天根试剂盒 牛成分参考物质 457.2 1.99 1.90
牛肉干 160.6 1.49 0.78
牛板筋 13.7 1.18 0.27
灯影牛肉 136.1 1.49 0.49
Omega试剂盒 牛成分参考物质 632.2 1.85 1.79
牛肉干 251.0 1.84 1.55
牛板筋 45.8 1.76 0.96
灯影牛肉 48.2 1.73 0.63
Promega试剂盒 牛成分参考物质 58.1 1.76 0.62
牛肉干 79.1 1.85 0.97
牛板筋 88.4 1.85 0.88
灯影牛肉 28.8 1.67 0.28
本发明试剂盒 牛成分参考物质 787.3 1.99 1.97
牛肉干 198.9 1.85 1.28
牛板筋 89.3 1.77 1.25
灯影牛肉 156.8 1.75 0.59
根据表3-1，本试剂盒与国内外几款试剂盒相比，在深加工制品提取方面具有优势，产物浓度、纯度较高，且适用范围更广，产物得率和纯度大大提高。
试验二完整性
采用琼脂糖凝胶平板电泳法进行核酸完整度的测定。分析不同相对分子大小核酸片段的荧光亮度，评估提取核酸的完整度。
酶切结果：根据GB/T 20190-2006饲料中牛羊源性成分的定性检测定性聚合酶链式反应(PCR)法，对产物进行酶切检测，酶切产物片段大小正确，确认含有牛源性成分。说明该发明所得产物完整性较好，适用于下游试验。
试验三重复性
在同一实验室，由同一操作员使用相同设备，采用同一批次的试剂盒，提取牛源性参考物质的核酸。在一天内重复提取不少于6个平行样品。以重复性条件下提取核酸的产量、纯度和完整度为指标评价重复性，计算相对标准偏差RSD。
准确称取20mg牛源性参考物质，按上述提取方法进行提取，用Thermo FisherNanoDrop 2000紫外-可见光分光光度计检测产物浓度和纯度，(产物溶剂均为100μL TE溶液)：
表5
样品 浓度(ng/uL) OD260/280 OD260/230
1 349.4 2.04 2.14
2 339.8 2.05 2.15
3 355.7 2.03 2.11
4 348.6 2.00 1.97
5 342.1 2.01 1.93
6 346.2 2.02 1.99
从以上看出，应用本发明中试剂体系提取核酸的产量等指标上重复性高。
试验四
设对照组，其它内容如实施例1-4，当试剂体系中没裂解液时的提取效果：无法提取。
试验五
分别设对照组与试验组，对照组中没有去蛋白液，试验组中添加去蛋白液，其它操作内容相同，如实施例1，如下表6：
表6
从以上可以看出，当试剂体系中没去蛋白液时的提取效果：产物纯度严重下降，蛋白质类和盐离子等杂质过多。
试验六
设对照组，其它操作内容如实施例1-4，当试剂中同时没去蛋白液、除脂液和裂解液时的提取效果：无法提取。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法，其特征在于：进行样品前处理、裂解、核酸富集和洗脱，具体包括以下步骤：
(1)样品前处理；
(2)加入处理好的样品至装有裂解液的离心管中，再加入蛋白酶K，室温放置25-35min；
(3)加入除脂液，充分混匀、离心，吸取上层液体；
(4)加入去蛋白液，70-80℃温浴12-18min，期间混匀1-3次，室温静置8-12min；
(5)加入磁珠缓冲液和磁珠悬浮液，充分混匀，静置1-3min；
(6)将离心管放置于磁力架上静置，待磁珠完全吸附后，除去上清液；
(7)加入洗涤液A混匀后磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去上清液；
(8)加入洗涤液B混匀，磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去上清液，重复1次，共2次；
(9)将离心管放置于磁力架上，室温晾干，干燥时间10-15min；
(10)加入洗脱液，混匀，室温静置8-12min；
(11)将离心管置于磁力架上静置1-3min，待磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至新的离心管中，低温保存；
其所采用的提取试剂体系包括体积份的裂解液400-800份、蛋白酶K 0.008-0.012份、除脂液0.4-0.6份、去蛋白液0.4-0.6份、磁珠缓冲液0.4-0.6份、硅羟基磁珠0.02-0.04份、洗涤缓冲液A 0.8-1.2份，洗涤缓冲液B 0.8-1.2份和洗脱缓冲液0.08-0.12份组成的试剂体系；
所述去蛋白液为盐酸胍5mol/L，Tris-cl 0.1mol/L，EDTA 20mmol/L，NaCl 1.0mol/L和体积浓度为1％的Triton X-100；
所述裂解液为0.1mol/L Tris-cl，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)和质量分数为5％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)；
所述磁珠缓冲液为异丙醇；
所述洗涤缓冲液A为0.8mol/L氯化锂，1mmol/L EDTA和0.01mol/L Tris-Cl,使用前加入1.5倍体积的无水乙醇；所述洗涤缓冲液B为体积浓度为80％的乙醇；所述洗脱缓冲液为TE溶液；所述除脂液为正己烷。
所述步骤(2)中加入样品前所述裂解液常温裂解；步骤(10)中所述洗脱液常温洗脱。
2.根据权利要求1所述的一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法，其特征在于：所述试剂体系中裂解液500份、蛋白酶K 0.01份、除脂液0.5份、去蛋白液0.5份、磁珠缓冲液0.5份、硅羟基磁珠0.03份、洗涤缓冲液A1份，洗涤缓冲液B1份和洗脱缓冲液0.1份。
3.根据权利要求1所述的一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法，其特征在于：所述步骤(3)中加入除脂液，震荡混匀10min，12,000rpm离心5min。
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