DE69012579T2

DE69012579T2 - Verfahren zur rückgewinnung rekombinanter proteine unter verwendung von flockungsmitteln.

Info

Publication number: DE69012579T2
Application number: DE69012579T
Authority: DE
Inventors: Vikram Mehrotra
Original assignee: Mallinckrodt Veterinary Inc
Current assignee: Intervet Inc
Priority date: 1989-08-28
Filing date: 1990-07-30
Publication date: 1995-02-23
Anticipated expiration: 2010-07-31
Also published as: NZ235040A; EP0494873A1; ATE111480T1; US5047511A; EP0494873B1; WO1991003486A1; AU643456B2; DE69012579D1; AU6171590A

Description

Die Erfindung betrifft im allgemeinen Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen und insbesondere ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Proteinen aus Proteinlösungen, die konterminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Proteinen gehören zum Stand der Technik; heterologe DNA-Segmente, die ein bestimmtes Protein kodieren, werden unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie in Wirtsmikroorganismen insertiert. Heterologe Proteine, wie Insulin, Somatotropine, Interleukine, Interferone, Somatomedine und ähnliche, können hergestellt werden, indem man den transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen wachsen läßt, bei denen die Expression der Proteine induziert wird.
Bedauerlicherweise sind heterologe Proteine, die von transformierten Mikroorganismen produziert werden, häufig nicht biologisch aktiv, weil sie sich nicht in die geeignete Tertiärstruktur falten, wenn sie in dem Mikroorganismus transkribiert werden. Die heterologen Proteine tendieren zur Bildung von Aggregaten die innerhalb der Zelle als "Einschlußkörper" ("inclusion bodies") zu erkennen sind. Diese Eischlußkörper können weiterhin durch die Bildung von kovalenten intermolekularen Disulfidbindungen verursacht werden, die mehrere Proteinmoleküle miteinander verbinden, wodurch unlösliche Komplexe gebildet werden. Die Einschlußkörper enthalten im allgemeinen hauptsächlich heterologe Proteine und eine kleine Fraktion von kontaminierenden Wirtsmikroorganismus-Proteinen.
Es sind mehrere Verfahren entwickelt worden, um die Einschlußkörper aus den Mikroorganismen zu extrahieren und um die darin enthaltenen heterologen Proteine in Proteine zu überführen, die eine native Bioaktivität besitzen, die mit denen der natürlichen, ursprünglichen oder nicht-rekombinanten Proteine übereinstimmt. Diese Verfahren beinhalten im allgemeinen den Aufschluß der Mikroorganismuszelle, das Abtrennen der Einschlußkörper von den Zelltrümmern, die Solubilisierung der Einschlußkörperproteine in einem Denaturierungsmittel/Detergens, wodurch das Protein entfaltet wird, die Abtrennung der heterologen Einschlußkörperproteine von unlöslichen Kontaminationen, die Entfernung des Denaturierungsmittels/Detergens, wobei man das heterologe Protein sich in eine bioaktive tertiäre Konformation rückfalten läßt, und die Abtrennung des Proteins von den kontaminierenden Proteinen, die in Lösung verbleiben.
Mehrere Reinigungsschemata für rekombinante Proteine, die diesem allgemeinen Verfahren folgen, gehören zum Stand der Technik: Die U.S.-Patente Nr. 4 511 503 und 4 518 526 und 4 511 502 von Olson et al. und die U.S.-Patente Nr. 4 511 502 und 4 620 948 von Builder et al. offenbaren mehrstufige Verfahren, wobei (1) Einschlußkörper in einem starken Denaturierungsmittel und einem Reduktionsmittel solubilisiert werden, (2) unlösliche Kontaminationen aus der solubilisierten Proteinlösung entfernt werden, (3) das starke Denaturierungsmittel durch ein schwaches Denaturierungsmittel ersetzt wird, (4) man das Protein, unterstützt durch Oxidation der Sulfhydrylgruppen zu Disulfidbindungen unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und einem Katalysator, typischerweise Metallkationen oder Natriumtetrathionat, sich rückfalten läßt, und (5) das Protein von anderen kontaminierenden Proteinen durch Membranseparationsverfahren oder chromatographische Verfahren abtrennt.
Rausch et al., U.S. Patent Nr. 4 677 196, offenbaren ein bestimmtes Verfahren zur Reinigung und Aktivierung von Proteinen, das eine Variante des oben beschriebenen allgemeinen Schemas darstellt. Das Verfahren umfaßt die Solubilisierung der Einschlußkörper in SDS, die Entfernung von überschüssigem SDS aus der Lösung durch Dialyse oder anderen geeigneten Verfahren, die Chromatographie der SDS-Proteinlösung auf einem Ionen retardierenden Harz, und die Chromatographie der resultierenden Lösung auf einem Anionenaustauscherharz, wodurch das Protein gewonnen wird.
Alle diese bekannten Verfahren besitzen ein gemeinsames Problem. Die Proteinlösung, die produziert wird, wenn das Denaturierungsmittel/Detergens entfernt wird, enthält das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, Nicht-Proteinkontaminationen, und kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht; die Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht sind häufig hauptsächlich Dimere, Oligomere und Aggregate des rekombinanten Proteins, aber beinhalten auch nicht-rekombinante Proteine des Zellverdaus. Es ist häufig schwierig, zeitaufwendig und teuer, rekombinate Proteine von diesen Kontaminationen, insbesondere von den rekombinanten Protein-Dimeren, -Oligomeren und -Aggregaten abzutrennen. Chromatographische und Membran- Separations-Verfahren können bei der Abtrennung der rekombinanten Proteine von den Kontaminationen wirksam sein, sind jedoch unbequem, zeitraubend, teuer und ergeben häufig niedrige prozentuale Ausbeuten für die Proteingewinnung.
Ho, U.S.-Patent Nr. 4 645 829 offenbart ein Verfahren zur Abtrennung von Polypeptiden, bei dem man ein geladenes Polymer, vorzugsweise in Gegenwart eines neutralen Polymers, zu der Lösung gibt. Das geladene Polymer ist typischerweise DEAE- Dextran (MW 500 000 Dalton) oder SANTOFLOC (MW etwa 100 000 Dalton). Entsprechend sind Flockungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht zur Abtrennung proteinartiger Substanzen aus wäßrigen Lösungen in verschiedenen Referenzen verwendet worden, z.B. in den U.S. Patenten Nr. 3 313 795, 3 719 655, 4 766 224 und 4 726 947.
Es werden daher neue und verbesserte Verfahren zur leichten, schnellen und billigen Gewinnung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Lösungen, die Protein- Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht enthalten, benötigt.

Kurzfassung der Erfindung

Es ist daher eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein neues Verfahren zur leichten, schnellen und billigen Gewinnung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Proteinlösungen, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht enthalten, bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Entfernung von kontaminierenden Proteinen mit hohem Molekulargwicht aus einer rekombinanten Proteinlösung bereitzustellen, das die leichte, schnelle und billige Gewinnung des rekombinanten Proteins erlaubt.
Diese und andere Aufgaben werden gelöst, indem man ein Flockungsmittel mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000 bis 12 Millionen Dalton direkt, in Mengen, die zur selektiven Präzipitation der Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht ausreichen, zu Lösungen gibt, die die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht und ein rekombinantes Protein enthalten. Das Flockungsmittel induziert vorzugsweise die Präzipitation von Proteinen mit einem Molekulargewicht, welches das des Proteins als um mehr als etwa das 1,5-fache übersteigt. Die Präzipitate werden aus der Lösung abgetrennt, wobei das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und andere Nicht- Protein-Kontaminationen in Lösung verbleiben. Das rekombinante Protein wird unter Verwendung von bekannten Verfahren aus der Lösung gewonnen und verarbeitet, wodurch das gewünschte Proteinprodukt hergestellt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein kationisches Flockungsmittel, das quaternäre Ammoniumgruppen enthält, direkt, in Mengen, die zur Herstellung einer 0,005-1 Vol.-%igen Lösung ausreichen, zu der Lösung gegeben. Die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht präzipitieren und werden mit üblichen Mitteln, wie Filtration, Zentrifugation und ähnliches, aus der Lösung entfernt. Die resultierende Proteinlösung, die das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und andere Nicht- Protein-Kontaminationen enthält, wird unter Verwendung üblicher Verfahren, wie Chromatographie, weiterverarbeitet, wodurch man das rekombinante Protein gewinnt. Weitere Aufgaben, Vorteile und neue Merkmale der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung ersichtlich.

Beschreibung der Zeichnungen

Die Figuren 1 und 2 sind graphische Darstellungen, und zeigen die Gel-Permeationschromatographie (GPC)-Muster des Ausgangsmaterials und des Produktes unter Verwendung des vorliegenden Verfahrens mit dem SUPERFLOC 340-Flockungsmittel.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der hier verwendendete Ausdruck "rekombinantes Protein" definiert ein Protein, das man in relativ reiner Form gewinnen möchte, und beinhaltet Proteine, die die Aminosäuresequenz von nativen Proteinen und deren Analoga und Mutanten mit substituierten, deletierten, ausgetauschten oder anderweitig modifizierten Sequenzen besitzen.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinantes Somatotropin" (rST) beinhaltet rekombinante Proteine mit der Aminosäuresequenz des nativen Somatotropins, Aminosäuresequenzen, die dieser im wesentlichen entsprechen, oder eine verkürzte Sequenzform davon, und deren Analoga und Mutanten mit substituierten, deletierten, ausgetauschten oder anderweitig modifizierten Sequenzen. Insbesondere beinhaltet das hier verwendete rST ein Protein mit der gleichen Aminosäuresequenz, wie pST, wobei aber Aminosäuren an dessen Amino-terminalem Ende deletiert sind. Beispiele für solche Proteine, ohne darauf beschränkt zu sein, sind rekombinantes delta-7 Schweine- Somatotropin, rekombinantes delta-4 Rinder-Somatotropin und ähnliches.
Der hier verwendete Ausdruck "kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht" oder "Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht" bezeichnet Proteine mit einem Molekulargewicht, das mehr als das 1,5-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins beträgt, insbesondere rekombinante Protein-Dimere, -Oligomere und -Aggregate mit einem Molekulargewicht, das mehr als das 2-fache des Molekulargewichts des rekombinanten Proteins beträgt.
Der hier verwendete Ausdruck "kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht" oder "Protein-Kontaminationen mit niedrigem Molekulargewicht" bezeichnete Proteine mit einem Molekulargewicht, das weniger als das etwa 1,5-fache des Molekulargewichts des rekombinanten Proteins beträgt.
Der hier verwendete Ausdruck "Nicht-Protein- Kontaminationen" bezeichnet Substanzen mit relativ niedrigem Molekulargewicht, wie Präzipitationsmittel, Solubilisierungsmittel, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel und dergleichen, die sich typischerweise in einer Proteinlösung befinden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Gewinnung eines rekombinanten Proteins aus einer Proteinlösung bereitgestellt, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht enthält. Das Verfahren umfaßt die direkte Zugabe eines Flockungsmittels mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000 bis 12 Millionen Dalton zu der Lösung, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht und das rekombinante Protein enthält, in Mengen, die zur selektiven Präzipitation der Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht ausreichen. Das Flockungsmittel induziert vorzugsweise die Präzipitatiton von Proteinen mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 1,5-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins ist, insbesondere von rekombinanten Protein-Dimeren, -Oligomeren und -Aggregaten mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 2-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins ist. Das Verfahren stellt ein verbessertes Verfahren zur leichten, schnellen und billigen Gewinnung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Lösungen, die Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht enthalten, dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein kationisches Flockungsmittel, das quaternäre Ammoniumgruppen enthält, direkt, in Mengen, die zur Herstellung einer 0,005-1 Vol-%igen Lösung ausreichen, zu der Lösung gegeben. Die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht präzipitieren und werden mit üblichen Mitteln, wie Filtration, Zentrifugation und dergleichen, aus der Lösung entfernt. Die resultierende Proteinlösung, die das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und andere Nicht- Protein-Kontaminationen enthält, wird unter Verwendung von üblichen Verfahren, wie Chromatographie, weiterverarbeitet, wodurch man das rekombinante Protein gewinnt.
In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Somatotropinen (Molekulargewicht etwa 20 000) bereitgestellt, bei dem man direkt ein kationisches Flockungsmittel, das quaternäre Ammoniumgruppen enthält, zu einer Lösung, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht und rekombinante Somatotropine enthält, in Mengen, die zur selektiven Präzipitation der Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht ausreichen, zugibt. Die kationischen Flockungsmittel induzieren vorzugsweise die Präzipitation von Proteinen mit einem Molekulargewicht, das größer als das 1,5- fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Somatotropins (Molekulargewicht größer als etwa 30 000) ist, insbesondere von rekombinanten Somatotropin-Dimeren, -Oligomeren und -Aggregaten mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 2-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Somatotropins (Molekulargewicht etwa 40 000 und mehr) ist. Das vorliegende Verfahren betrifft daher ein Verfahren zur Abtrennung des rekombinanten Somatotropins von dessen bioinaktiven Dimeren, Oligomeren und Aggregaten.
Erfindungsgemäß brauchbare Lösungen, die ein rekombinantes Protein, Nicht-Protein-Kontaminationen, Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht und Protein-Kontaminationen mit niedrigem Molekulargewicht enthalten, erhält man durch Verfahren des Standes der Technik. Typischerweise werden Protein-Einschlußkörper, die von rekombinanten Mikroorganismen produziert worden sind, behandelt, um Lipide und Zelltrümmer zu entfernen. Die resultierenden relativ reinen Einschlußkörper, die das rekombinante Protein und kontaminierende Proteine, insbesondere rekombinante Protein-Dimere, -Oligomere und -Aggregate mit hohem Molekulargewicht enthalten, werden in einem starken Denaturierungsmittel oder Detergens, wie Guanidin-Hydrochlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton und anderen starken Denaturierungsmitteln oder Detergentien, solubilisiert.
Die resultierende Proteinlösung wird von unlöslichen Substanzen abgetrennt; das starke Denaturierungsmittel oder Detergens wird entfernt, wodurch eine Proteinlösung hergestellt wird, die das in seine native, bioaktive Konfiguration rückgefaltete rekombinante Protein, Protein-Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und andere Nicht-Protein-Kontaminationen enthält. Solche Lösungen enthalten typischerweise etwa 1-50 mg/ml Gesamtprotein und etwa 0,05-5 mg/ml rekombinantes Protein.
Die Flockungsmittel werden erfindungsgemäß zu dieser Lösung gegeben, um die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht zu präzipitieren.
Die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht, die nach der Zugabe der Flockungsmittel präzipitieren, werden durch übliche Mittel, wie Filtration, Zentrifugation und dergleichen, aus der Lösung entfernt. Die resultierende Proteinlösung, die das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und gegebenenfalls andere, Nicht-Protein-Kontaminationen enthält, wird nach Bedarf weiterbehandelt, um die kontaminierenden Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und Nicht-Protein-Kontaminationen, wie Präzipitationsmittel, Solubilisierungsmittel, Oxidationsmittel, Reduktionsmittel und ähnlches, zu entfernen. Typischerweise werden solche Nicht-Protein-Kontaminationen durch Dialyse, Chromatographie oder andere geeignete Mittel entfernt, während die kontaminierenden Proteine mit niedrigem Molekulargewicht von dem Protein durch Ionenaustausch-Chromatogrpahie oder andere Chromatographie-formen abgetrennt werden.
Die Proteinlösung wird typischerweise durch Lyophilisierung weiterbehandelt, um ein Protein oder eine Proteinzusammensetzung herzustellen, die für die beabsichtigte Verwendung geeignet ist. Diese Verfahren gehören zum Stand der Technik.
Erfindungsgemäß brauchbare Flockungsmittel werden ausgewählt unter Polymerverbindungen, die (1) eine angefügte quaternäre Gruppe enthalten, wodurch dem Polymer eine positive Ladung verliehen wird (dieses Polymer kann ein Homopolymer von quaternären Verbindungen sein, wie CATFLOC-DL oder SUPERFLOC 340, oder ein Copolymer aus quaternären Verbindungen und Polyacrylamiden, wie HERCOFLOC 1137) sein, (2) löslich in Wasser sind, (3) über einen weiten pH-Bereich (4-12) stabil sind, (4) bei 0-60ºC stabil sind, und (5) ein Molekulargewicht (MW) von etwa 100 000 bis 12 Millionen besitzen. Diese Flockungsmittel können im allgemeinen in zwei Gruppen aufgeteilt werden, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt sind: Eine Gruppe mit einem Molekulargewicht von etwa 100 000 - 500 000, vorzugsweise von etwa 200 000-300 000, und eine Gruppe mit einem Molekulargewicht von etwa 1-11 Millionen, vorzugsweise von etwa 1-7 Millionen.
Die Flockungsmittel mit niedrigem Molekulargewicht werden in niedrigerer Konzentration benötigt, um wirksam die verunreinigenden Proteine zu entfernen, während die Flockungsmittel mit höherem Molekulargewicht im allgemeinen in höheren Konzentrationen zur Entfernung der Verunreinigungen benötigt werden. Die Flockungsmittel mit hohem Molekulargewicht stellen nicht nur selektive Präzipitationsmittel dar, sondern ergeben überraschenderweise ein Präzipitat, das sehr leicht von der Lösung abzutrennen ist. Das Präzipitat, das unter Verwendung der Flockungsmittel mit höherem Molekulargewicht gebildet wird, koaguliert, wodurch ein großer Klumpen gebildet wird, der leicht aus der Lösung abgeschöpft werden kann. Zu Beispielen für solche Flockungsmittel zählen HERCOFLOC 1137 von Hercules und MAGNIFLOC 1596C von American Cyanamid.
Zu bevorzugten Verbindungen zählen NALCO 3DC052, NALCO 8853 und NALCO 8856 (erhältlich von Nalco Chemicals, Naperville, IL); SUPERFLOC 340, MAGNIFLOC 1590C, MAGNIFLOC 1591C, MAGNIFLOC 1592C, MAGNIFLOC 1596C, MAGNIFLOC 1598C, MAGNIFLOC 1555C, MAGNIFLOC 1561C, MAGNIFLOC 1563C und MAGNIFLOC 581C (erhältlich von American Cyanamid, Wayne, NJ); HERCOFLOC 1137 (erhältlich von Hercules, Wilmington , DE); DATFLOC-DL, CATFLOC-T2 und CATFLOC-L (erhältlich von Calgon Corp., Hinsdale, IL); und POLYHALL 347, POLYHALL 351 und POLYHALL 361 (erhältlich von Celanese Corp., Jefferson Town, KY).
SUPERFLOC 315, 330, 340 sind stark kationische, flüssige, Flockungsmittel vom Polyamin-Typ, die bei Fest-Flüssig- Trennungen bei allen Arten von mineralischen Behandlungsvorgängen wirksam sind. Die Produkte dieser Serie unterscheiden sich nur in ihren Molekulargewichten, wobei SUPERFLOC 315 das niedrigste und SUPERFLOC 340 das höchste Molekulargewicht besitzt. Typische Eigenschaften dieser Flockungsmittel sind: SUPERFLOC Flockulierungsmittel Erscheinungsbild Spezifisches Gewicht, 25ºC (77ºF) Viskosität, 25ºC, cps Effektive Viskosität, 25ºC, cps Löslichkeit Chemische Reaktivität Haltbarkeit Gefrierpunkt stroh- bis bernsteinfarbige Flüssigkeiten unbegrenzt in Wasser löslich nicht reaktiv 12-24 Monate aBrookfield, #2 Spindel , @ 60 Upm bBrookfield, #2 Spindel, @ 30 Upm cBrookfield, #3 Spindel, @ 12 Upm dViskosität bei infiniter Schergeschwindigkeit
Die Flockungsmittel SUPERFLOC 315, 330 und 340 werden in der Industrie zur Verdickung und Entwässerung von mineralischen Konzentraten und Rückständen verwendet, entweder als primäre Flockungsmittel oder zusammen mit einem nicht-ionischen oder anionischen Polyelektrolyten mit hohem Molekulargewicht. Sie werden als besonders wirksam angesehen bei: (1) der Andickung und Filtration von Kohleabfall, (2) der Andickung und Filtration von Eisenerzkonzentrat, (3) der Andickung von Eisenerzrückständen, (4) der Entwässerung von mineralischen Sulfidkonzentraten, und (5) der Klärung von Minenabwasser.
Das Flockungsmittel MAGNIFLOC 581C ist ein flüssiges, kationisches Flockungsmittel mit einem hohen Molekulargewicht. Es gilt als besonders wirksam als Entwässerungshilfe bei der Zentrifugation, Filtration und Flotation von industriellen und städtischen Abfallschlämmen. Es wird weiterhin als brauchbar bei anderen Fest-Flüssig-Trennungen, wie bei der sekundären Klärung, der Wasserklärung und der Öl-Demulgierung, angesehen. Die Eigenschaften des Flockungsmittels sind: Erscheinungsbild Spezifisches Gewicht, 25ºC (88ºF) Viskosität bei 25ºC Löslichkeit Chemische Reaktivität Haltbarkeit, 50ºC-100ºF (10º-40ºC) Gefrierpunkt Flammpunkt, verschlossenes Gefäß bernsteinfarbige Flüssigkeit unbegrenzt in Wasser nicht reaktiv 12 bis 24 Monate *Brookfield Nr. 3 Spindel, 12 Upm
Das Flockungsmittel MAGNIFLOC 581C ist ein stark kationischer Polyelektrolyt, der besonders wirksam bei der Entwässerung einer großen Reihe von industriellen und städtischen Schlämmen ist. Das Flockungsmittel MAGNIFLOC 581C wird für Flüssig-Fest-Trennungsverfahren empfohlen, wie: (1) Absetzung - es verbessert die Flockenbildung aufgrund größerer Flockengröße und schnelleren Absetzungsgeschwindigkeiten (2) Filtration - es erhöht die Filtrationsgeschwindigkeit und produziert größere Filterkuchen, (3) Zentrifugation - es erhöht den Durchsatz, während es den Einfang von Feststoffen und die Klärung des Zentrifugates verbessert, (4) Luftflotation - es ergibt klareres Unterwasser, einen größeren Mengendurchsatz pro Square Foot der Oberfläche und einen Schwimmschlamm mit hohem Feststoffanteil, und (5) Wasserklärung - für eine verbesserte Qualität des gereinigten Abwassers, suspendierte Feststoffe und einer Verringerung der Trübung.
NALCO 3DC-052 ist ein flüssiges, kationisches Koagulans mit hoher Ladungsdichte und moderatem Molekulargewicht. Seine allgemeinen physikalischen Eigenschaften sind: Zustand Farbe Geruch Ladung in Lösung Dichte (@ 60ºF) Spezifisches Gewicht (@60ºF) Fließpunkt Gefrierpunkt Gefrier/Tau-Rückgewinnung Flammpunkt (PMCC) flüssig klar oder leicht bernsteinfarbig schwach kationisch vollständig
NALCO 3DC-052 wird als ein wirksames Flockungsmittel zur Mineralbehandlung angesehen, das (1) die Qualität von Recyclingwasser verbessert, indem die Verschleppung von Feststoffen reduziert wird, (2) die Dichte von Unterlauf- Feststoffen erhöht und deren Entwässerbarkeit verbessert und (3) den Einfang von Feststoffen bei der Filtration maximiert.
Obwohl die Menge an Feststoffen, die zur Induktion der Präzipitation benötigt wird, in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration, den Proteincharakteristika, zugesetzten Verbindungen und ähnlichem variiert, werden die Flockungsmittel typischerweise in Mengen, die zur Herstellung einer etwa 0,005- 1 Vol.-%igen Lösung der Verbindung, vorzugsweise einer etwa 0,01-0,5 Vol.-%igen Lösung, ausreichen, zu der Lösung gegeben.
Unter den bevorzugten Flockungsmitteln erweisen sich SUPERFLOC 340 und HERCOFLOC 1137 als am wirksamsten bei den vorliegenden Verfahren. Beide Flockungsmittel ergeben nahezu die gleiche pST-Ausbeute von etwa 90% mit einem P/M-Verhältnis von weniger als 0,2. Die erforderliche Konzentration von SUPERFLOC 340 (0,015 bis 0,03%), um eine gute Trennung zu bewirken, ist wesentlich geringer als die des HERCOFLOC 1137 (0,15 bis 0,25%), aber der Fest-Flüssig-Trennschritt erfolgt wesentlich leichter mit HERCOFLOC 1137.
Rekombinante Proteine, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewinnbar sind, können alle Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5000 Dalton sein, die von rekombinanten Mikroorganismen, typischerweise in Einschlußkörpern, produziert werden. Dazu zählen Somatotropine, Insuline, Somatomedine, Somatostatine, Prolactine, placentale Lactogene und ähnliche.
Am meisten bevorzugt ist die Gewinnung rekombinanter Somatotropine (Molekulargewicht etwa 20 000) unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das rekombinante Somatotropin kann ein rekombinantes Somatotropin von irgendeiner Spezies, aber vorzugsweise rekombinantes Rinder-, Schweine-, Vogel-, Schaf- oder Human-Somatotropin sein, wobei rekombinantes Schweine- oder Rinder-Somatotropin am meisten bevorzugt sind.
Verfahren zur Herstellung dieser rekombinanten Proteine gehören zum Stand der Technik: Zum Beispiel offenbaren die U.S.-Patente Nr. 4 604 359 und 4 332 717 Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Human-Somatotropin; das U.S.- Patent Nr. 4 431 739 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Somatotropinen; die Europäische Patentanmeldung 0 104 920 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Schweine-Somatotropin; das U.S.- Patent Nr. 4 443 359 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Rinder-Somatotropin; Schoner, Biotechnology, 3(2):151-54, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Somatotropin, und Buell, Nucleic Acid Res., 13, 1923-38 (1985) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Somatomedin C.
Weiterhin beschreibt die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 103 395 die Konstruktion eines transformierten E. coli-Stammes, der ein erstes Plasmid enthält, das für delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropin (Somatotropin, dem die 9 N-terminalen Aminosäuren fehlen und das einen zuätzlichen Serin-Rest am N-Terminus enthält) unter der Kontrolle des Lambda P L-Promotor-Operators kodiert, und das eine Shine-Dalgarno-Region besitzt, die vom Bakteriophagen mu stammt. Der Transformant enthält weiterhin ein zweites Plasmid, pcI857, das für die Produktion des Temperatursensitiven Repressorproteins pcI857 kodiert. Das Repressorprotein kann durch Erhöhung der Temperatur auf etwa 42ºC inaktiviert werden, wobei die Expression des delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropins induziert wird. Ein tranformierter Stamm dieses Typs, E. coli HB101 (P L-mu-delta 9 (Ser) Rinder- Somatotropin und pcI857) ist bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD unter der Hinterlegungs-Nr. 53030 hinterlegt worden.
Die Konstruktion eines ähnlichen transformierten Stammes, der für die Produktion des delta 7-Schweine-Somatotropins (Schweine-Somatotropin, dem die ersten 7 N-terminalen Aminosäuren fehlen) kodiert, ist in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. 0 104 920 beschrieben. Ein transformierter Stamm dieses Typs E coli HB101 (P L-mu-delta 7-Schweine-Somatotropin und pcI857) ist bei der ATCC unter der Hinterlegungs-Nr. 53031 hinterlegt worden.
Die Stämme 53030 und 53031 sind proliferierende Produzenten des delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropins bzw. des delta 7-Schweine-Somatotropins. In beiden Fällen wird das exprimierte Protein innerhalb der Zelle in Form von unlöslichen, biologisch inaktiven Einschlußkörpern, die unter einem Mikroskop sichtbar sind, abgesondert. Weitere Verfahren für viele ähnliche Proteine gehören zum Stand der Technik.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lösung von rekombinantem Somatotropin, die etwa 1-50 mg/ml Gesamtprotein und etwa 0,05-5 mg/ml rekombinantes Somatotropin enthält, mit etwa 0,01-0,5% Flockungsmittel behandelt, wodurch die Protein- Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht präzipitieren. Das Prazipitat wird durch Zentrifugation entfernt, und das rekombinante Somatotropin wird aus der resultierenden Lösung wie oben beschrieben unter Verwendung üblicher Mittel gewonnen.
Obwohl das obige Gewinnungsverfahren auf die Gewinnung rekombinanter Proteine gerichtet ist, ist das Verfahren gleichermaßen auf die Trennung und Gewinnung nicht- rekombinanter Proteine anwendbar. Zum Beispiel wird eine Lösung, die ein Gemisch aus (1) einem "brauchbaren oder gewünschten Protein", (2) Proteinen mit hohem Molekulargewicht (Molekulargewicht größer als etwa das 1,5-fache des Molekulargewichtes des brauchbaren Proteins) und (3) Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht (Molekulargewicht weniger als das etwa 1,5-fache des Molekulargewichts des brauchbaren Proteins) enthält, erfindungsgemäß behandelt, wodurch die Proteine mit hohem Molekulargewicht präzipitieren und somit die Proteine mit hohem Molekulargewicht von den brauchbaren Proteinen und den Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht abgetrennt werden. Die Proteine mit hohem Molekulargewicht werden aus der Lösung, wie gewünscht, abgetrennt oder weiterbehandelt; die Proteine mit hohem Molekulargewicht können aus dem Präzipitat durch Auflösen des Präzipitates und Isolierung der Proteine aus der Lösung gewonnen werden.
Das brauchbare Protein wird von den Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht durch übliche Mittel abgetrennt und, falls gewünscht, weiterbehandelt, wodurch ein Proteinprodukt hergestellt wird. Die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die von dem brauchbaren Protein abgetrennt worden sind, werden, wie gewünscht, verworfen oder weiterbehandelt. Typischerweise können die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht von dem brauchbaren Protein durch Chromatographie oder andere Verfahren, die zur Trennung von Proteinen mit ähnlichem Molekulargewicht geeignet sind, getrennt werden. Viele solcher Protein-Trennungsverfahren sind dem Fachmann bekannt und gleichermaßen auf die vorliegende Erfindung anwendbar.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, werden die folgenden Beispiele als besondere, erfindungsgemäße Ausführungsformen angegeben, um deren Praxis und Vorteile zu zeigen. Es ist klar, daß die Beispiele zu Illustrationszwecken angegeben werden, und daß es nicht beabsichtigt ist, die Beschreibung oder die nachfolgenden Ansprüche auf irgendeine Weise zu beschränken. Insbesondere wurden die bei den Versuchen verwendeten Einschlußkörper aus transformierten E. coli-Stämmen hergestellt, die delta-7 Schweine-Somatotropin produzieren. Die Einschlußkörper wurden aus dem E. coli-Wirtsstamm HB101 isoliert, der mit einem ersten Plasmid transformiert war (pL- mu-delta-7 pST), das für delta-7 pST kodierte, und mit einem zweiten Plasmid (pcI857), das für das Temperatur-sensitive lambda-Phagen Repressor-Protein kodierte. Viele andere Mikroorganismenstämme, die Einschlußkörper produzieren, die viele Arten von rekombinanten Proteinen enthalten, können erfindungsgemäß bearbeitet werden. Entsprechend gehören Verfahren zur Züchtung dieser Mikroorganismen, um Einschlußkörper zu produzieren, zum Stand der Technik.

Beispiel 1

Rekombinantes Schweine-Somatotropin wurde aus Einschlußkörpern von Mikroorganismen gewonnen, indem man (1) die Einschlußkörper in Natriumdodecylsulfat (SDS) löste, und (2) die unlöslichen Kontaminationen aus der Lösung entfernte, um das rpST sich in dessen bioaktive Konfiguration rückfallen zu lassen. Die resultierende Proteinlösung enthält das rpST, Proteine mit hohem Molekulargewicht und weitere Nicht-Protein- Kontaminationen.
Eine 20 ml-Probe der Proteinlösung, die das rpST, Protein- Kontaminationen mit hohem Molekulargewicht, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht und andere Nicht- Protein-Kontaminationen enthielt, wurde in einem 50 ml Becher gegeben, der in ein mit Eis gefülltes Gefäß gegeben wurde, um die Temperatur zwischen 5-10ºC zu halten.
Ein berechnetes Volumen einer 0,5%-Lösung von SUPERFLOC 340 wurde in den Becher gegeben, um eine Konzentraktion von SUPERFLOC 340 herzustellen, die 0,0375 Vol.-% des ursprünglichen Ausgangsmaterials betrug. Die Reaktanden im Becher wurden unter Verwendung eines Teflon-beschichteten Rührstabes etwa 1 bis 3 Minuten vermischt. Die Präzipitate bildeten sich beinahe sofort. (Eine niedrigere Zugabegeschwindigkeit des Präzipitationsmittels ergab ein reineres Produkt mit einem niedrigeren P/M-Verhältnis. Ähnlich ergab eine höhere Temperatur, z.B. 25ºC, eine höhere Ausbeute. In der gegenwärtigen Praxis wird jedoch eine Behandlung bei höheren Temperaturen aufgrund von Bedenken, die das mikrobielle Wachstum betreffen, nicht ausführbar sein). Der Inhalt des Bechers wurde zentrifugiert und der Überstand wurde durch einen 0,2 µ-Filter filtriert, um die Probe für eine Gel- Permeationschromatographie (GPC) vorzubereiten.
Figur 1 zeigt das Chromatogramm des Ausgangsmaterials des Produktes, von dem die Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht durch Präzipitation entfernt worden sind.
Peaks in dem GPC-Chromatogramm (Figur 1), das man erhielt, indem man die Probe über eine Pharinacia Superose 12 FPLC-Säule gab, charakterisieren Proteine mit unterschiedlichen Molekulargewichten. Zum Beispiel entspricht der Peak, der nach 27,5 Minuten erscheint, dem pST. Peaks, die vor dem pST erscheinen, entsprechen Proteinen mit hohem Molekulargewicht, von denen einige Polymere des pST darstellen. Die Zahlen in den Klammern links von dem Chromatogramm stellen die pST- Konzentration in parts per million und das Verhältnis von polymerem pST oder Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht zu monomerem pST dar. Dieses Verhältnis, als P/M-Verhältnis bezeichnet, wird als ein Maß für die Reinheit der Probe verwendet. Je kleiner das P/M-Verhältnis ist, desto reiner ist die Probe.
Figur 1 zeigt, daß man, wenn man ein Ausgangsmaterial, das 606 ppm pST und ein P/M-Verhältnis von 3,9 aufweist, mit SUPERFLOC 340 behandelt, ein hochreines Produkt mit einem P/M- Verhältnis von nur < 0,1 und eine pST-Ausbeute von 87,5 % erhält.

Beispiel 2

Unter Anwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens wurden die in der Tabelle 1 aufgeführten Flockungsmittel untersucht. Sie präzipitierten alle in selektiver Weise das polymere pST oder die Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht. Kationische Flockungsmittel, die quaternäre Ammoniumgruppen enthalten, sind die wirksamsten Flockungsmittel. Die kommerziellen Flockungsmittel, die von American Cyanamid (SUPERFLOC 340), Calgon (CATFLOC-DL) und Hercules (HERCOFLOC 1137) erhalten wurden, sind in dem vorliegenden Verfahren sehr wirksam. Viele der Flockungsmittel besitzen ein Molekulargewicht von etwa 200 000 bis 300 000. Einige kationische Flockungsmittel mit einem Molekulargewicht von mehr als 5-6 Millionen Dalton stellen nicht nur selektive Präzipitationsmittel dar, sondern ergeben überraschenderweise ein Präzipitat, das sich sehr leicht von der Lösung trennen läßt. In diesen Fällen koaguliert das gesamte Präzipitat, wodurch eine große Masse gebildet wird, die leicht aus der Lösung abgeschöpft werden kann. Zu Beispielen für solche kationischen Flockungsmittel, die Polyacrylamid-Copolymere sind, zählen HERCOFLOC 1137 von Hercules und MAGNIFLOC 1596C von American Cyanamid.
Ausgedrückt als pST-Ausbeute und P/M-Verhältnis (Tabelle 2), erweisen sich SUPERFLOC 340 und HERCOFLOC 1137 als vergleichbar leistungsfähig. Der Vorteil von SUPERFLOC 340 gegenüber 1137 besteht darin, daß SUPERFLOC in viel geringeren Konzentrationen benötigt wird. Die Flockungscharakteristika des mit HERCOFLOC präzipitierten pST-Polymers sind jedoch überlegen, was die nachfolgende Behandlung einfacher gestaltet. CATFLOC-DL, das ein Polymer von Dimethyldiallylammoniumchlorid darstellt, arbeitet wie SUPERFLOC. Wegen seiner nichttoxischen Eigenschaft und dem Fehlen irgendwelcher gefährlicher Bestandteile gemäß dem OSHA Hazard Communication Standard (29 CFR 1910.1200), kann jedoch CATFLOC-DL ein bevorzugtes Flockungsmittel darstellen.
Die Lagerung des zentrifugierten Überstandes über Nacht ergab keine Präzipitation, was darauf hinwies, daß die Reaktion vollständig war. Der Überstand wurde unter Anwendung von GPC analysiert und die Daten wurden sodann verwendet, um die pST- Ausbeute und das P/M-Verhältnis im hergestellten Überstand zu berechnen. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 2 dargestellt.
Unter Bezugnahme auf die Tabelle 2 zeigen die Ergebnisse, daß man pST-Ausbeuten von etwa 90 % bei einem P/M-Verhältnis von fast Null bei einer optimalen Dosierung des Flockungsmittels erhält.
Der nach der Präzipitation mit dem Flockungsmittel erhaltene pST-Überstand wurde mittels isoelektrischer Fokussierung (IEF) analysiert. Die Ergebnisse zeigten keinen Unterschied zwischen den Flockungsmitteln und entsprachen denjenigen, die man mit einer Standard-PST-Probe erhielt. Dies zeigt, daß sogar nach einer Flockungsmittel-Behandlung pST im wesentlichen unverändert vorliegt und so bioaktiv wie natives pST ist.

Beispiel 3

Unter Anwendung des im Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens wurden die Flockungsmittel SUPERFLOC 340, MAGNIFLOC 581C, HERCOFLOC 1137 und CATFLOC-DL bei verschiedenen Konzentrationen unter Verwendung mehrerer Pilot-Anlagen-Proben, die nicht einer Membranreinigung unterzogen worden waren, untersucht. Jedes der obigen Reagenzien ergab eine Protein- Präzipitation. Die Dosierung, um einen bestimmten Reinheitsgrad bei hoher pST-Ausbeute zu erreichen, variierte jedoch. Dies liegt an Schwankungen von Charge zu Charge und an Schwankungen in der Wirksamkeit verschiedener Flockungsmittel, eine Präzipitation zu bewirken. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in Tabelle 3 dargestellt, die die Daten für pST-Ausbeute und P/M-Verhältnis der untersuchten Flockungsmittel zusammenfaßt. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Diskrepanz zwischen der pST-Ausbeute und dem P/M-Verhältnis besteht. Je höher die Dosierung des Flockungsmittels ist, desto niedriger sind die pST-Ausbeute und das P/M-Verhältnis (ein niedriges P/M-Verhältnis bedeutet eine höhere Reinheit). Im allgemeinen ist es möglich, einfache Dosis-Titrationen, wie oben, durchzuführen, um die optimale Dosis für ein gegebenes Flockungsmittel so zu bestimmen, daß die gewünschte Reinheit bei hoher Ausbeute an pST erreicht wird.
Es ist einleuchtend, daß viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung unter Berücksichtigung der obigen Lehren möglich sind. Es ist daher klar, daß im Rahmen der beigefügten Ansprüche die Erfindung anders als spezifisch beschrieben durchgeführt werden kann. Tabelle 1 Liste der Flockungsmittel¹, die auf eine selektive Präzipitation des pST-Polymers untersucht wurden Reagens Vertreiber NALCO SUPERFLOC MAGNIFLOC HERCOFLOC CATFLOC-DL, CATFLOC-T2 CATFLOC-L CALGON POLYHALL Nalco Chemicals, Naperville, IL American Cyanamid, Wayne, NJ Hercules, Wilmington, DE Calgon Corp., Hinsdale, IL Cellanese Corp., Jefferson Town, KY ¹Allesamt Handelsprodukte Tabelle 2 Vergleich von Präzipitation und Pilot-Anlagen-Verfahren zur Vorreinigung von Schweine-Somatotropin Ausgangsmaterial Gew.-% Ausbeute P/M Verhältnis SUPERFLOC CHARGE DURCHSCHNITT HERCOFLOC CATFLOC-DL NALCO PILOTANLAGEN-VERFAHREN Tabelle 3 pST-Ausbeute und P/N-Verhältnis als Funktion der Flockungsmittel-Dosierung Flockungsmittel-Dosis (Vol.%) Gew.-% Ausbeute P/M-Verhältnis SUPERFLOC MAGNIFLOC HERCOFLOC CATFLOC-DL

Claims

1. Verfahren zur Gewinnung eines gewünschten Proteins aus einer Proteinlösung, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht und das gewünschte Protein, und, falls das gewünschte Protein ein nicht-rekombinantes Protein ist, zusammen mit Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht enthält, wobei man:

ein Flockungsmittel, das (1) eine anhängende quaternäre Gruppe enthält, die dem Polymer eine positive Ladung verleiht, (2) in Wasser löslich ist, (3) bei einem pH-Wert von etwa 4-12 stabil ist, (4) von etwa 0-60ºC stabil ist und (5) ein Molekulargewicht (MW) von etwa 100.000 bis 12 Millionen Dalton besitzt, direkt zu der Lösung in einer Menge gibt, die ausreicht, um selektiv die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht zur präzipitieren;

das Präzipitat von der Lösung trennt; und

das gewünschte Protein aus der Lösung gewinnt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Gesamtproteinkonzentration der Lösung etwa 1-50 mg/ml und die Konzentration des aus der Lösung zu gewinnenden Proteins etwa 0,05-5 mg/ml beträgt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Flockungsmittel direkt zu der Lösung in einer Menge gegeben wird, die ausreicht, um eine 0,005-1 Vol.-%ige Lösung herzustellen.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Flockungsmittel ein Molekulargewicht von etwa 100.000-500,000 besitzt.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Flockungsmittel ein Molekulargewicht von etwa 2-11 Millionen besitzt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Flockungsmittel ausgewählt ist unter

NALCO 3DC052, NALCO 8853, NALCO 8856, SUPERFLOC 340, MAGNIFLOC 1590C, MACNIFLOC 1591C, MAGNIFLOC 1592C, MAGNIFLOC 1596C, MAGNIFLOC 1598C, MAGNIFLOC 1555C, MAGNIFLOC 1561C, MAGNIFLOC 1653C, MAGNIFLOC 581C, HERCOFLOC 1137, CATFLOC-DL, CATFLOC-T2, CATFLOC-L, POLYHALL 347, POLYHALL 351 und POLYHALL 361.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Flockungsmittel ausgewählt ist unter SUPERFLOC 340, NALCO 8853, CATFLOC-DL und HERCOFLOC 1137.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Flockungsmittel ausgewählt ist unter SUPERFLOC 340 und HERCOFLOC 1137.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht ein höheres Molekulargewicht als etwa 30.000 und das zu gewinnende Protein ein Molekulargewicht von etwa 20.000 besitzen.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das zu gewinnende Protein ein rekombinantes Protein ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das rekombinante Protein ein Somatotropin ist.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei das rekombinante Somatotropin rekombinantes Rinder-, Schweine-, Vogel-, Schaf- oder Humansomatotropin ist.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei das rekombinante Somatotropin rekombinantes Schweine- oder Rinder-Somatotropin ist.

14. Verfahren zur Gewinnung von rekombinantem Somatotropin aus einer Proteinlösung, die kontaminierende Proteine mit hohem Molekulargewicht und das rekombinante Somatotropin enthält, wobei man:

ein Flockungsmittel, das ausgewählt ist unter NALCO 3DC052, NALCO 8853, NALCO 8856, SUPERFLOC 340, MAGNIFLOC 1590C, MAGNIFLOC 1591C, MAGNIFLOC 1592C, MAGNIFLOC 1596C, MAGNIFLOC 1598C, MAGNIFLOC 1555C, MAGNIFLOC 1561C, MAGNIFLOC 1653C, MAGNIFLOC 581C, HERCOFLOC 1137, CATFLOC-DL, CATFLOC-T2, CATFLOC-L; POLYHALL 347, POLYHALL 351 und POLYHALL 361, direkt zu der Lösung in einer Menge gibt, die ausreicht, um die kontaminierenden Proteine mit hohem Molekulargewicht selektiv zu präzipitieren;

das Präzipitat von der Lösung trennt; und das rekombinante somatotropin aus der Lösung gewinnt.