DE69004429T2

DE69004429T2 - Verfahren zur rückgewinnung rekombinanter proteine.

Info

Publication number: DE69004429T2
Application number: DE90907861T
Authority: DE
Inventors: Ray Barker; Vikram Mehrotra
Original assignee: Pitman Moore Inc
Current assignee: Mallinckrodt Veterinary Inc
Priority date: 1989-06-12
Filing date: 1990-05-10
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2010-05-11
Also published as: US5101018A; AU634547B2; JP2957695B2; HUT61053A; WO1990015876A1; CA2060505A1; ATE96805T1; EP0477198A1; AU5644290A; BR9007433A; HU904388D0; HU209651B; DE69004429D1; EP0477198B1; KR0178274B1; DK0477198T3; RU2075509C1; CA2060505C; JPH04505706A; ES2046782T3

Description

Diese Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur Gewinnung rekombinanter Proteine und insbesondere ein Verfahren zur Isolierung rekombinanter Proteine aus Proteinlösungen, die kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht enthalten.

Hintergrund der Erfindung

Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine gehören zum Stand der Technik; heterologe DNA-Segmente, die für ein bestimmtes Protein codieren, werden unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie in einen Wirts-Mikroorganismus eingebracht. Indem man den transformierten Mikroorganismus unter Bedingungen wachsen läßt, bei denen die Expression von Proteinen induziert wird, können heterologe Proteine, wie Insulin, Somatotropine, Interleukine, Interferone, Somatomedine und ähnliche hergestellt werden.
Bedauerlicherweise sind von transformierten Mikroorganismen produzierte, heterologe Proteine häufig nicht biologisch aktiv, weil sie sich nicht in die richtige Tertiärstruktur falten, wenn sie im Mikroorganismus transkribiert werden. Die heterologen Proteine neigen dazu, Aggregate zu bilden, die innerhalb der Zelle als Einschlußkörper ("inclusion bodies") erkennbar sind. Diese Einschlußkörper können weiterhin durch die Bildung von kovalenten, intermolekularen Disulfidbindungen verursacht werden, die mehrere Proteinmoleküle verbinden können, wodurch sich unlösliche Komplexe bilden. Die Einschlußkörper enthalten allgemein größtenteils heterologe Proteine und einen kleinen Anteil kontaminierender Wirts- Mikroorganismus-Proteine.
Mehrere Verfahren sind entwickelt worden, um die Einschlußkörper aus den Mikroorganismen zu extrahieren und die darin enthaltenen heterologen Proteine in Proteine mit nativer Bioaktivität umzuwandeln, die mit derjenigen der natürlichen Stamm- oder nicht-rekombinanten Proteine übereinstimmt. Diese Verfahren beinhalten allgemein das Aufbrechen der Mikroorganismen-Zelle, die Trennung der Einschlußkörper von den Zelltrümmern, das Auflösen der Einschlußkörper-Proteine in einem Denaturierungsmittel/Detergens, das das Protein entfaltet, die Trennung der heterologen Einschlußkörper- Proteine von unlöslichen Kontaminationen, die Entfernung des Denaturierungsmittels/Detergenzes, wobei man die heterologen Proteine sich in eine bioaktive, tertiäre Konformation rückfalten läßt, und die Trennung der Proteine von den in Lösung verbleibenden, kontaminierenden Proteinen.
Mehrere Reinigungsschemata für rekombinante Proteine, welche diesem allgemeinen Verfahren folgen, gehören zum Stand der Technik: Die US-Patente Nr. 4 511 503 und 4 518 526 von Olson et al. sowie die US-Patente Nr. 4 511 502 und 4 620 948 von Builder et al. offenbaren mehrstufige Verfahren, wobei man (1) Einschlußkörper in einem starken Denaturierungsmittel und einem reduzierenden Agens auflöst, (2) unlösliche Kontaminationen aus der Lösung der gelösten Proteine entfernt, (3) das starke Denaturierungsmittel durch ein schwaches Denaturierungsmittel ersetzt, (4) das Protein sich rückfalten läßt, unterstützt durch Oxidation der Sulfhydrylgruppen zu Disulfid-Bindungen unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und einem Katalysator, typischerweise Metallkationen oder Natriumtetrathionat, und (5) das Protein von anderen kontaminierenden Proteinen durch Membran-Separationstechniken oder Chromatographieverfahren abtrennt.
Rausch et al., US-Patent Nr. 4 677 196, auf das hiermit Bezug genommen wird, offenbart ein spezielles Verfahren zur Reinigung und zur Aktivierung von Proteinen, das eine Variation des oben beschriebenen allgemeinen Schemas darstellt. Das Verfahren umfaßt die Auflösung der Einschlußkörper in SDS, die Entfernung von überschüssigem SDS aus der Lösung durch Dialyse oder eine andere, geeignete Technik, die Chromatographie der SDSProteinlösung an einem Ionen-Retardationsharz, und die Chromatographie der resultierenden Lösung an einem Anionenaustauscherharz, um das Protein zu isolieren.
Alle diese bekannten Verfahren teilen ein gemeinsames Problem. Die Protein-Lösung, die man erhält, wenn das Denaturierungsmittel/Detergens entfernt wird, enthält das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, Nicht-Proteinkontaminanten, und kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht; die Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht sind größtenteils Dimere, Oligomere und Aggregate des rekombinanten Proteins, und enthalten aber auch nicht-rekombinante Proteine aus dem Zellaufschluß. Es ist häufig schwierig, zeitaufwendig und teuer, die rekombinanten Proteine von diesen Kontaminanten, insbesondere von den rekombinanten Protein-Dimeren, Oligomeren und Aggregaten, abzutrennen.
Chromatographische und Membran-Separationstechniken können zur Trennung der rekombinanten Proteine von den Kontaminanten wirksam sein, sind aber beschwerlich, langwierig, teuer und ergeben häufig eine niedrige prozentuale Ausbeute an Protein.
Daher sind neue und bessere Verfahren zur leichten, schnellen und billigen Isolierung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Lösungen, die Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht enthalten, nötig.

Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine graphische Darstellung, die den Effekt der DUOMAC-T-Konzentration auf die Ausbeute an Schweine- Somatotropin und auf das Polymer-zu-Monomer(P/M)-Verhältnis, das durch Gel-Permeationschromatographie (GPC) bestimmt wurde, zeigt.

Kurzfassung der Erfindung

Es ist daher eine erfindungsgemäße Aufgabe, ein neues Verfahren zur leichten, schnellen und billigen Isolierung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Protein- Lösungen, die kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht enthalten, bereitzustellen.
Es ist eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe, ein Verfahren zur Entfernung von kontaminierenden Proteinen mit einem hohen Molekulargewicht aus einer Lösung mit rekombinanten Proteinen bereitzustellen, das die leichte, schnelle und billige Isolierung der rekombinanten Proteine erlaubt.
Diese und andere Aufgaben werden gelöst durch die direkte Zugabe von Amin- oder quaternären Ammoniumverbindungen zu Lösungen, die kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht und ein rekombinantes Protein enthalten, in Mengen, die zur selektiven Präzipitation der Protein- Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht ausreichen. Die Verbindungen induzieren eine bevorzugte Präzipitation von Proteinen mit einem Molekulargewicht, das mehr als das 1,5- fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins beträgt, und insbesondere von Dimeren, Oligomeren und Aggregaten des rekombinanten Proteins mit einem Molekulargewicht, das größer ist als das 1,5-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins. Die Präzipitate werden aus der Lösung abgetrennt, wobei das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein-Kontaminanten in Lösung bleiben. Das rekombinante Protein wird aus der Lösung unter Verwendung bekannter Techniken zurückgewonnen und weiterverarbeitet, um das gewünschte Proteinprodukt herzustellen.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird die Amin- oder die quaternäre Ammoniumverbindung direkt in einer Menge zu der Lösung gegeben, die ausreicht, um eine 0,01 bis 2 Volumen-%-ige Lösung herzustellen. Die kontaminierenden Proteine mit einem hohen Molekulargewicht präzipitieren und werden aus der Lösung durch bekannte Verfahren, wie Filtration, Zentrifugation und ähnliche, entfernt. Die resultierende Protein-Lösung, enthaltend das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein- Kontaminanten, wird unter Verwendung von bekannten Techniken wie Chromatographie weiterbehandelt, um das rekombinante Protein zu isolieren.
Weitere Aufgaben, Vorteile und neue Eigenschaften der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden, detaillierten Beschreibung der Erfindung.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der hier verwendete Ausdruck "rekombinantes Protein" bezeichnet ein Protein, das man in einer relativ reinen Form gewinnen möchte, und beinhaltet Proteine mit der Aminosäuresequenz von nativen Proteinen und ihre Analoga und Muteine mit substituierten, deletierten, ausgetauschten oder anderweitig modifizierten Sequenzen.
Der hier verwendete Ausdruck "rekombinantes Somatotropin" (rST) beinhaltet rekombinante Proteine mit der Aminosäuresequenz des nativen Somatotropins, Aminosäuresequenzen, die dazu im wesentlichen ähnlich sind, oder eine gekürzte Sequenzform davon und ihre Analoga und Muteine mit substituierten, deletierten, ausgetauschten oder anderweitig modifizierten Sequenzen. Insbesondere beinhaltet rST, wie hier verwendet, ein Protein mit der gleichen Sequenz wie pST, von dessen aminoterminalem Ende aber Aminosäuren deletiert sind. Beispiele für solche Proteine sind, ohne darauf beschränkt zu sein, delta-7- rekombinantes Schweine-Somatotropin, delta-4-rekombinantes Rinder-Somatotropin und ähnliches.
Der hier verwendete Ausdruck "kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht" oder "Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht" betrifft Proteine, die ein Molekulargewicht besitzen, das größer ist als das etwa 1,5- fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins, insbesondere Dimere, Oligomere und Aggregate des rekombinanten Proteins mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 2- fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteines ist.
Der hier verwendete Ausdruck "kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht" oder "Protein-Kontaminanten mit einem niedrigen Molekulargewicht" betrifft Proteine mit einem Molekulargewicht, das weniger als das 1,5-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins beträgt.
Der hier verwendete Ausdruck "Nicht-Protein-Kontaminanten" betrifft Substanzen mit einem relativ niedrigen Molekulargewicht, wie präzipitierende Agenzien, lösende Agenzien, oxidierende Agenzien, reduzierende Agenzien und ähnliche, die sich typischerweise in einer Protein-Lösung befinden.
Erfindungsgemäß wird ein Verfahren bereitgestellt zur Gewinnung eines gewünschten Proteins mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5000 aus einer Proteinlösung, welche das gewünschte Protein und kontaminierende Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als dem etwa 1,5-fachen des Molekulargewichtes des gewünschten Proteins enthält, wobei man:
Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindungen der folgenden Struktur:
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; ein gegebenenfalls substituierter, geradkettiger oder verzweigter C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylrest ist; und X für ein Anion steht; oder
worin R&sub1; ausgewählt ist unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten; R&sub2;-R&sub6; ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, oder einem Wasserstoffatom; R' eine Alkylen- oder Arylengruppe bedeutet; und X für ein Anion steht; oder
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppen, oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für einen gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylrest steht; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und X für ein Anion steht; oder
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für eine gegebenenfalls substituierte, geradkettige oder verzweigte C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppe steht; R' für eine Arylen- oder Alkylengruppe steht; und x für ein Anion steht; oder
wobei R&sub1; eine von Talg abgeleitete Gruppe bedeutet, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppen, oder einem Wasserstoffatom; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und X für ein Anion steht;
zu der Lösung direkt in einer Menge zugibt, die ausreicht, die kontaminierenden Proteine mit einem hohen Molekulargewicht selektiv zu präzipitieren; den Niederschlag von der Lösung abtrennt; und das rekombinante Protein aus der Lösung isoliert.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren verwendet, um selektiv Dimere, Oligomere und Aggregate des rekombinanten Proteins mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 2-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Proteins ist, zu präzipitieren. Das Verfahren liefert eine bessere Methode zur leichten, schnellen und billigen Gewinnung von rekombinanten Proteinen in hohen Ausbeuten aus Lösungen, die Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Gewinnung von rekombinanten Somatotropinen (Molekulargewicht etwa 20.000) bereitgestellt, wobei man direkt Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindungen zu Lösungen, die kontaminierende Proteine mit einem hohen Molekulargewicht und rekombinante Somatotropine enthalten, in Mengen gibt, die ausreichen, um die Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht selektiv zu präzipitieren. Die Amin- oder die quaternären Ammoniumverbindungen induzieren vorzugsweise die Präzipitation von Proteinen mit einem Molekulargewicht, das größer als das etwa 1,5-fache des Molekulargewichtes des rekombinanten Somatotropins ist (Molekulargewicht größer als etwa 30.000), insbesondere von Dimeren, Oligomeren und Aggregaten des rekombinanten Somatotropins mit einem Molekulargewicht, das etwa das 2-fache des Molekulargewichts des rekombinanten Somatotropins beträgt (Molekulargewicht etwa 40.000 und größer). Das vorliegende Verfahren stellt daher eine Methode zur Abtrennung des rekombinanten Somatotropins von seinen bioinaktiven Dimeren, Oligomeren und Aggregaten dar.
Erfindungsgemäß brauchbare Lösungen, die ein rekombinantes Protein, Nicht-Protein-Kontaminanten, Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht und Protein-Kontaminanten mit einem niedrigen Molekulargewicht enthalten, werden durch bekannte Verfahren erhalten. Repräsentativ werden Protein- Einschlußkörper, die von rekombinanten Mikroorganismen produziert worden sind, behandelt, um Lipide und Zelltrümmer zu entfernen, und die resultierenden, relativ reinen Einschlußkörper, die rekombinantes Protein und kontaminierende Proteine, insbesondere Dimere, Oligomere und Aggregate des rekombinanten Proteins mit einem hohen Molekulargewicht, enthalten, werden in einem starken Denaturierungsmittel oder Detergens, wie Guanidinhydrochlorid, Natriumdodecylsulfat (SDS), Triton und ähnlichem, gelöst.
Die resultierende Proteinlösung wird von unlöslichen Stoffen abgetrennt, und das starke Denaturierungsmittel oder Detergens wird entfernt, um eine Proteinlösung herzustellen, welche das in seine native, bioaktive Konfiguration rückgefaltete, rekombinante Protein, Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein-Kontaminanten enthält. Solche Lösungen enthalten typischerweise etwa 1 bis 50 mg/ml Gesamt-Protein und etwa 0,05 bis 4 mg/ml rekombinantes Protein.
Die Amin- oder quaternären Ammoniumverbindungen werden erfindungsgemäß zu dieser Lösung gegeben, um die kontaminierenden Proteine mit einem hohen Molekulargewicht zu präzipitieren.
Die kontaminierenden Proteine mit einem hohen Molekulargewicht, die nach Zugabe der Amin- oder quaternären Ammoniumverbindungen präzipitieren, werden aus der Lösung durch konventionelle Methoden, wie Filtration, Zentrifugation und ähnlichem, entfernt. Die resultierende Proteinlösung, die das rekombinante Protein, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein-Kontaminanten, wenn vorhanden, enthält, wird, soweit notwendig, weiterbehandelt, um kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein-Kontaminanten, wie präzipitierende Agenzien, lösende Agenzien, oxidierende Agenzien, reduzierende Agenzien und ähnliche, zu entfernen. Typischerweise werden solche Nicht-Protein-Kontaminanten durch Dialyse, Chromatographie oder andere geeignete Mittel entfernt, während die kontaminierenden Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht von dem Protein durch Ionenaustausch oder andere Chromatographiearten abgetrennt werden.
Die Proteinlösung wird weiterbehandelt, um ein Protein oder eine Proteinzusammensetzung herzustellen, die geeignet für die beabsichtigte Verwendung ist, typischerweise durch Lyophilisation. Diese Verfahren gehören zum Stand der Technik.
Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindungen, die erfindungsgemäß brauchbar sind, werden ausgewählt unter Verbindungen mit der Struktur:
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten und Wasserstoff, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht Wasserstoff ist; und X für ein Anion, wie Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat, Acetat und ähnliches, steht; oder
worin R&sub1; ausgewählt ist unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten; R&sub2;-R&sub6; ausgewählt sind unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;- Alkylresten und Wasserstoff; R' eine Alkylen- oder Arylengruppe bedeutet; und X für ein Anion, wie Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat, Acetat und ähnliches, steht; oder
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten und Wasserstoff, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht Wasserstoff bedeutet; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und X für ein Anion, wie Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat, Acetat und ähnlichem, steht; oder
worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C2-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten oder Wasserstoff, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; nicht für Wasserstoff steht; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht und X für ein Anion, wie Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat, Acetat und ähnlichem, steht; oder
worin R&sub1; eine von Talg abgeleitete Gruppe bedeutet; R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten, substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;- Alkylresten oder Wasserstoff; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und X für ein Anion, wie Chlorid, Bromid, Iodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat, Acetat und ähnlichem, steht.
Bevorzugte Verbindungen beinhalten Dodecylaminhydrochlorid, Trimethyloctadecylammoniumchlorid, Trimethylhexadecylammoniumchlorid, Trimethyldodecylammoniumchlorid, Dimethyldiammoniumchlorid und DUOMAC-T (N-Talg-1,3- Diaminopropandiacetat). Zu den bevorzugtesten Verbindungen gehören DUOMAC-T (N-Talg-1,3-Diaminopropandiacetat) und Trimethyldodecylammoniumchlorid.
Obwohl die zur Induktion der Präzipitation benötigten Mengen an Amin- oder quaternären Ammoniumverbindungen von der Proteinkonzentration, den Proteineigenschaften, zugegebenen Verbindungen und ähnlichem abhängt, werden die Amin- oder quaternären Ammoniumverbindungen typischerweise zur Lösung in Mengen zugegeben, die ausreichend sind, um eine etwa 0,01 bis 2 Volumen-%-ige Lösung der Verbindung, vorzugsweise eine etwa 0,01 bis 0,5 Volumen-%-ige Lösung, herzustellen.
Rekombinante Proteine, die man unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewinnen kann, können alle Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5000 sein, die von einem rekombinanten Mikroorganismus produziert werden, typischerweise in Einschlußkörpern. Sie beinhalten Somatotropine, Insuline, Somatomedine, Somatostatine, Prolactine, plazentale Lactogene und ähnliche.
Am meisten bevorzugt werden rekombinante Somatotropine (Molekulargewicht etwa 20.000) unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gewonnen. Das rekombinante Somatotropin kann ein rekombinantes Somatotropin von irgendeiner Spezies sein, wobei aber rekombinantes Rinder-, Schweine-, Vogel-, Schaf- oder menschliches Somatotropin bevorzugt sind, und am meisten rekombinantes Schweine- oder Rinder-Somatotropin bevorzugt ist.
Verfahren zur Herstellung dieser rekombinanten Proteine gehören zum Stand der Technik: z. B. offenbaren die US-Patente Nr. 4 604 359 und 4 332 717 Verfahren zur Herstellung von menschlichem, rekombinantem Somatotropin; das US-Patent Nr. 4 431 739 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Somatotropinen; die EPA 0 104 920 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Schweine- Somatotropin; das US-Patent Nr. 4 443 359 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Rinder- Somatotropin; Schoner, Biotechnology, 3(2):151-54, offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Somatotropin, und Buell, Nucleic Acid Res., 13, 1923-38 (1985) offenbart ein Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Somatomedin C.
Weiterhin beschreibt die Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0 103 395 die Herstellung eines transformierten E. coli-Stammes, der ein erstes Plasmid enthält, das für delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropin (Somatotropin, dem die 9 N-terminalen Aminosäuren fehlen und das einen zusätzlichen Serin-Rest am N-Terminus besitzt) unter der Kontrolle des lambda-P-L-Promotor-Operators, und das eine vom Bakteriophagen mu stammende Shine-Dalgarno-Region besitzt. Der Transformant enthält weiterhin ein zweites Plasmid, pcI857, das für das pcI857-temperatursensitive Repressorprotein codiert. Das Repressorprotein kann durch Erhöhung der Temperatur auf etwa 42ºC inaktiviert werden, wobei die Expression des delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropins induziert wird. Ein transformierter Stamm dieses Typs, E. coli HB101 (P L-mu-delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropin und pcI857), ist bei The American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt worden und mit der Hinterlegungsnummer 53030 bezeichnet worden.
Die Konstruktion eines ähnlichen transformierten Stammes, der für delta-7 Schweine-Somatotropin (Schweine-Somatotropin, dem die ersten 7 N-terminalen Aminosäuren fehlen) codiert, ist in der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 0 104 920 beschrieben. Ein transformierter Stamm dieses Typs, E. coli HB101 (P L-mu-delta-7 Schweine-Somatotropin und pcI857) ist bei ATCC hinterlegt worden und mit der Hinterlegungsnummer 53031 bezeichnet worden.
Die Stämme 53030 und 53031 sind proliferierende Produzenten von delta 9 (Ser) Rinder-Somatotropin bzw. von delta-7 Schweine- Somatotropin. In beiden Fällen wird das exprimierte Protein in der Zelle in Form von unlöslichen, biologisch inaktiven Einschlußkörpern abgelagert, die unter einem Mikroskop sichtbar sind. Andere Verfahren für viele ähnliche Proteine gehören zum Stand der Technik.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Lösung mit rekombinantem Somatotropin, die etwa 1 bis 50 mg/ml Gesamt- protein und etwa 0,05 bis 2 mg/ml rekombinantes Somatotropin enthält, mit etwa 0,08 bis 0,12 % DUOMAC-T behandelt, um die Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht zu präzipitieren. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt, und das rekombinante Somatotropin wird aus der resultierenden Lösung unter Verwendung von konventionellen Mitteln wie oben beschrieben gewonnen.
Obwohl das obige Isolierungsverfahren auf die Isolierung von rekombinanten Proteinen bezogen ist, ist das Verfahren gleichermaßen auf die Trennung und Isolierung nichtrekombinanter Proteine anwendbar. Zum Beispiel wird eine Lösung, die ein Gemisch von (1) einem "brauchbaren oder gewünschten Protein", (2) Proteinen mit einem hohen Molekulargewicht (Molekulargewicht größer als das etwa 1,5- fache des Molekulargewichtes des brauchbaren Proteins) und (3) Proteinen mit einem niedrigen Molekulargewicht (Molekulargewicht weniger als das etwa 1,5-fache des Molekulargewichtes des brauchbaren Proteins) erfindungsgemäß behandelt, um die Proteine mit hohem Molekulargewicht zu präzipitieren und somit die Proteine mit hohem Molekulargewicht von den brauchbaren Proteinen und den Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht abzutrennen. Die Proteine mit hohem Molekulargewicht werden aus der Lösung abgetrennt und wie gewünscht verworfen oder weiterbehandelt; die Proteine mit hohem Molekulargewicht können aus dem Präzipitat gewonnen werden, indem man das Präzipitat auflöst und die Proteine aus der Lösung gewinnt.
Das brauchbare Protein wird durch konventionelle Mittel von den Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht abgetrennt und, falls gewünscht, weiterbehandelt, um ein Proteinprodukt herzustellen. Die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht, die von den brauchbaren Proteinen abgetrennt wurden, werden gewünschtenfalls verworfen oder weiterbehandelt. Typischerweise können die Proteine mit niedrigem Molekulargewicht von den brauchbaren Proteinen durch Chromatographie oder andere Techniken, die geeignet sind zur Trennung von Proteinen mit einem ähnlichen Molekulargewicht, getrennt werden. Viele solcher Protein-Trennungstechniken sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und gleichermaßen bei der vorliegenden Erfindung anwendbar.
Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, werden die folgenden Beispiele als bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gegeben, und um die Technik und die Vorteile davon zu zeigen. Es wird betont, daß die Beispiele zur Illustrierung gegeben werden, und daß es nicht beabsichtigt ist, die Beschreibung oder die nachfolgenden Ansprüche in irgendeiner Art und Weise einzuschränken. Insbesondere werden die in den Experimenten verwendeten Einschlußkörper aus transformierten E. coli-Stämmen hergestellt, die delta-7 Schweine-Somatotropin produzieren. Die Einschlußkörper wurden aus dem E. coli- Wirtsstamm HB101 isoliert, der mit einem ersten Plasmid (pL-mu- delta-7 pST), codierend für delta-7 pST, und mit einem zweiten Plasmid (pcI857), codierend für das temperatursensitive lambda- Phagen-Repressor-Protein, transformiert ist. Viele andere Mikroorganismen-Stämme produzieren Einschlußkörper, die viele Typen von rekombinanten Proteinen beinhalten, die erfindungsgemäß bearbeitet werden können. Ähnlich gehören Verfahren zur Vermehrung dieser Mikroorganismen, um Einschlußkörper herzustellen, zum Stand der Technik.

Beispiel 1

Rekombinantes Schweine-Somatotropin (rpST) wurde aus Mikroorganismen-Einschlußkörpern isoliert, durch (1) Lösen der Einschlußkörper in Natriumdodecylsulfat (SDS), (2) Entfernung von unlöslichen Kontaminanten aus der Lösung, und (3) Entfernung des SDS aus der Lösung, um rpST sich in seine bioaktive Konfiguration rückfalten zu lassen. Die erhaltene Proteinlösung enthielt rpST, Protein-Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht-Protein- Kontaminanten. Diese Lösung wurde zur Reinigung einem Membran- Separationsverfahren unterworfen. Die Membran-Separation entfernte einige Verunreinigungen mit einem hohen Molekulargewicht, aber es verblieb eine signifikante Menge von Verunreinigungen mit einem hohen Molekulargewicht; eine weitere Reinigung wurde benötigt.
20 ml-Portionen der Proteinlösung, die rpST, Protein- Kontaminanten mit einem hohen Molekulargewicht, kontaminierende Proteine mit einem niedrigen Molekulargewicht und andere Nicht- Protein-Kontaminanten enthielten, wurden in 50 ml Bechergläser gegeben, die in eisgefüllte Behälter gestellt wurden, um die Temperatur zwischen 5-10ºC zu halten. Eine vorbestimmte Menge einer 0,5 bis 1,0 %-igen Lösung des Aminreagenzes (Dodecylaminhydro-chlorid und kommerziell erhältliche A-1 und A36A Amin-verbindungen) wurden unter Verwendung einer 1 ml oder 3 ml Spritze zur Probe zugegeben. Die Reaktionspartner in jedem Becherglas wurden unter Verwendung eines Teflon-beschichteten Rührstabes für etwa 1-3 Minuten vorsichtig vermischt.
Die Präzipitate bildeten sich fast sofort; eine langsamere Additionsrate (tropfenweise) des Präzipitationsmittels ergab ein reineres Produkt (niedrigeres P/M-Verhältnis). Ebenso ergab eine höhere Temperatur (25ºC) eine höhere Ausbeute. (Jedoch kann in der Praxis ein Arbeiten bei höheren Temperaturen wegen der Auswirkungen auf das mikrobielle Wachstum nicht möglich sein.) Der Inhalt jedes Becherglases wurde zentrifugiert, und der Überstand wurde durch ein 0,2 Mikron-Filter filtriert, um die Probe für die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) herzustellen.
Die Lagerung des zentrifugierten Überstandes über Nacht zeigte keine Präzipitation, was anzeigte, daß die Reaktion vollständig war. Der Überstand wurde unter Verwendung von GPC analysiert, und die Daten wurden dann verwendet, um die rpST-Ausbeute und das Polymer-zu-Monomer(P/M)-Verhältnis des Produktes des Überstandes zu berechnen.
Die Resultate zeigen, daß pST-Ausbeuten von etwa 90 % mit einem P/M-Verhältnis, das fast 0 betrug, mit etwa 0,05 % (des Flüssigkeitsvolumens)-Konzentration des Amin-Reagenzes erhalten wurden. Die kommerziellen Aminverbindungen P-14B und 52-267 wurden auch getestet, aber zugunsten von Dodecylaminhydrochlorid und A-1 verworfen, entweder wegen der niedrigeren Ausbeute, des höheren P/M-Verhältnisses oder der erforderlichen Dosierung. Die getesteten Verbindungen sind in Tabelle 1 dargestellt.

Beispiel 2

Die ausgewählten Aminverbindungen A-1 und Dodecylaminhydrochlorid aus Beispiel 1 und mehrere andere, einschließlich Trimethyldodecyl-, Hexadecyl- und Octadecylammoniumchloride, DUOMAC-T (N-Talg-1,3-diaminopropandiacetat), ARQUAD-2C-75 (Dimethyldicocoammoniumchlorid) und Hexylamin, wurden in verschiedenen Konzentrationen bei mehreren Proben aus Pilotanlagen, die nicht einer Membran-Reinigung unterworfen worden waren, getestet. Außer Hexylamin bewirkte jedes der obigen Reagenzien eine Protein-Präzipitation. Die Selektivität und die pST-Ausbeute variierten jedoch.
Bei Dodecyl-, Hexadecyl- und Octadecylammoniumchloriden war die Konzentration des Reagenzes, die zur selektiven Präzipitation des pST-Polymers notwendig war, eine Funktion der Kohlenstoffatomkettenlänge, da die 18 Kohlenstoffatome enthaltende Octadecyl-Verbindung nur 0,02 % (des Lösungsvolumens) benötigte, im Gegensatz zu 0,03 % der 16 Kohlenstoffatome enthaltenden Hexadecyl-Verbindung und etwa 0,04 bis 0,06 % der 12 Kohlenstoffatome enthaltenden Dodecyl- Verbindung. Bei demselben P/M-Verhältnis des Produktes war die pST-Ausbeute mit Trimethyldodecylammoniumchlorid (TDAC) am höchsten.
Von allen getesteten Aminverbindungen erwies sich DUOMAC-T in einem Konzentrationsbereich von 0,08 bis 0,12 % am vielversprechendsten in Hinsicht auf die Selektivität und die Ausbeute.
Tabelle 2 zeigt eine Zusammenfassung der Präzipitationstest- Daten, die unter Verwendung von DUOMAC-T und TDAC mit verschiedenen Chargen ("batches") von rekombinantem Protein erhalten wurden. Die Ausbeuten (75 bis 82 %) sind besser als die Ausbeuten bei der Membran-Reinigungstechnik. Weiterhin ist das erfindungsgemäße Präzipitations-Verfahren wesentlich einfacher und störungsfreier. Da die Produkte gewöhnlich sehr wertvoll sind, bedeuten kleine Verbesserungen der Ausbeute große ökonomische Vorteile.
Der Effekt der DUOMAC-T-Konzentration auf die pST-Ausbeute und das P/M-Verhältnis wurde im Detail mit mehreren anderen Chargen von rohem, rekombinantem Protein im Detail untersucht. Wie einige, in Figur 1 gezeigte, typische Ergebnisse zeigen, gibt es ein "trade off" zwischen der pST-Ausbeute und dem P/M- Verhältnis, d.h., eine höhere Ausbeute ist assoziiert mit einem höheren P/M-Verhältnis. Da das gewünschte P/M-Verhältnis des vorgereinigten Produktes etwa 0,5 oder weniger beträgt, sollte die DUOMAC-T-Konzentration so ausgewählt werden, um diese Bedingung mit der höchstmöglichen Ausbeute zu verbinden.
Der nach der DUOMAC-T-Präzipitation erhaltene pST-Überstand wurde mit dem Gewebe-Bindungsassay, isoelektrischer Fokussierung (IEF) und Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) analysiert. Der Gewebe-Bindungsassay zeigte, daß das pST zu 98 % aktiv im Vergleich zu einer Standard-pST-Probe war, was nahelegte, daß das pST nicht denaturiert war. Ebenso zeigten die IEF- und HPLC-Tests keinen Unterschied zwischen den mit DUOMAC-T behandelten und den unbehandelten pST-Proben, was eine unveränderte pST-Struktur anzeigte.
Es ist offensichtlich, daß viele Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die obige Lehre möglich sind. Tabelle 1 Liste der getesteten Reagenzien zur selektiven Präzipitation des pST-Polymers Reagens Lieferant Hexylamin Dodecylaminhydrochlorid Trimethyloctadecylammoniumchlorid Trimethylhexdecylammoniumchlorid Trimethyldodecylammoniumchlorid Dimethyldicocoammoniumchlorid Dimethyldiammoniumchlorid N-Talg-1,3-diaminopropandiacetat (DUOMAC-T) A-1 Amin, P-14B, A36A, 52-267 Aldrich Chemical Co., Inc., Milwaukee, WI Eastman Kodak, Rochester, NY ARMAC Chemicals, McCook, IL Sherex Polymer, Inc., Lakeland, FL A-1: Acetatsalz eines primären Amins. Sekundäre und tertiäre Amin-Verbindungen können als Verunreinigungen vorliegen. P-14B: C&sub1;&sub0;H&sub2;&sub1;-O-CH&sub2;-CH&sub2;-CH&sub2;-NH&sub2;: Etheraminacetat. A-36A: Fettsäureamidoaminacetatsalz 52-26F: 5%-ige wäßrige Dispersion des verwendeten Amins A-36A. Tabelle 2 Ausbeute und P/M-Verhältnis, erhalten bei der Behandlung von vorgereinigtem Schweine-Somatotropin aus verschiedenen Chargen aus einer Pilotanlage mittels des Amin-Verfahrens Futter Gew.-%Ausbeute P/M-Verhältnis Charge #263-6 (538 ppm, 2,3 P/M) Dodecylaminhydrochlorid (0,06 %) DUOMAC-T (0,1 %) Durchschnitt * Suspekt Interferenz eines verschleppten Peaks der vorherigen Probe

Claims

1. Verfahren zur Isolierung eines gewünschten Proteins mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 5000 aus einer Proteinlösung, welche das gewünschte Protein und kontaminierende Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa dem 1,5-fachen des Molekulargewichts des gewünschten Proteins enthält, wobei man:

Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindungen der folgenden Struktur:

worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; ein gegebenenfalls substituierter, geradkettiger oder verzweigter C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylrest ist; und X für ein Anion steht; oder

worin R&sub1; ausgewählt ist unter gegebenenfalls Substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten; R&sub2;-R&sub6; ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten oder einem Wasserstoffatom; R' eine Alkylen- oder Arylengruppe bedeutet; und X für ein Anion steht; oder

worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppen, oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für einen gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylrest steht; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und x für ein Anion steht; oder

worin R&sub1;, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylresten oder einem Wasserstoffatom, mit der Maßgabe, daß wenigstens einer der Reste R&sub1;, R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; für eine gegebenenfalls substituierte, geradkettige oder verzweigte C&sub8;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppe steht; R' für eine Arylen- oder Alkylengruppe steht; und X für ein Anion steht; oder

worin R&sub1; eine von Talg abgeleitete Gruppe bedeutet, R&sub2;, R&sub3;, R&sub4; und R&sub5;, die gleich oder verschieden sein können, ausgewählt sind unter gegebenenfalls substituierten, geradkettigen oder verzweigten C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylgruppen, oder einem Wasserstoffatom; R' für eine Alkylen- oder Arylengruppe steht; und X für ein Anion steht;

zu der Lösung direkt in einer Menge zugibt, die ausreicht, um die hochmolekularen, kontaminierenden Proteine selektiv auszufällen;

den Niederschlag von der Lösung abtrennt; und

das rekombinante Protein aus der Lösung entfernt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Gesamtproteinkonzentration der Lösung im Bereich von etwa 1-50 mg/ml liegt und die Konzentration an rekombinantem Protein der Lösung im Bereich von etwa 0,05-4 mg/ml liegt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindung direkt zu der Lösung in einer Menge zugegeben wird, die ausreicht, eine 0,01-2 volumen- %ige Lösung herzustellen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin X ausgewählt ist unter Chlorid, Bromid, Jodid, Sulfat, Sulfonat, Nitrat oder Acetat.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindung ausgewählt ist unter Dodecylamin-Hydrochlorid, Trimethyloctadecyl-Ammoniumchlorid, Trimethylhexadecyl-Ammoniumchlorid, Trimethyldodecyl- Ammoniumchlorid (TDAC), Dimethyl-di(hydrogenierter Talg)- Ammoniumchlorid, DUOMAC-T (N-Talg-1,3-diaminopropan-Diacetat) oder ARQUAD-2C-75 (Dimethyldicoco-Ammoniumchlorid).

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindung ausgewählt ist unter DUOMAC-T (N-Talg-1,3- diaminopropan-Diacetat) oder Trimethyldodecyl-Ammoniumchlorid.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin die hochmolekularen kontaminierenden Proteine ein Molekulargewicht von mehr als etwa 30000 besitzen und das zu isolierende Protein ein Molekulargewicht von etwa 20000 besitzt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das rekombinante Protein Somatotropin ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das rekombinante Somatotropin bovines, porcines, avianes, ovines oder humanes rekombinanten Somatotropin ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das rekombinante 10 Somatotropin procines oder bovines rekombinantes Somatotropin ist.

11. Verfahren nach Anspruch 1, worin das gewünschte Protein rekombinantes Somatotropin ist und die Amin- oder quarternäre Ammoniumverbindung ausgewählt ist unter Dodecylamin- Hydrochlorid, Trimethyloctadecyl-Ammoniumchlorid, Trimethylhexadecyl-Ammoniumchlorid, Trimethyldodecyl- Ammoniumchlorid (TDAC), Dimethyl-di(hydrogenierter Talg)- Ammoniumchlorid, DUOMAC-T (N-Talg-1,3-diaminopropan-Diacetat) oder ARQUAD-2C-75 (Dimethyldicoco-Ammoniumchlorid).

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Amin- oder quaternäre Ammoniumverbindung ausgewählt ist unter DUOMAC-T (N- Talg-1,3-diaminopropan-Diacetat) oder Trimethyldodecyl- Ammoniumchlorid.