DE1492047C

DE1492047C - Verfahren zur Gewinnung eines Poly peptids mit immunisierender Wirkung

Info

Publication number: DE1492047C
Authority: DE
Inventors: Per Jensen Hovik Laland Soren Gustav Moe Blommenholm Dedichen Jens Dr med Voksenha Thorsdalen Nils Arvoll Laland, (Norwegen)
Original assignee: Nyegaard & Co A/S, Oslo
Publication date: 1971-10-07

Description

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Die Erfindung betrifft die Herstellung eines neuen Wie oben bereits angeführt, ist das Produkt im Produkts zur medizinischen Verwendung bei der wesentlichen nicht pyrogen und zeigt praktisch keine Induzierung von unspezifischer Immunität. Antigenwirkung. Bei der Injektion induziert es Immuni-■ Es wurde gefunden, daß aus Extrakten tierischer tat gegen vaccinia virus, E. coli und eine beträchtliche Organe ein Produkt isoliert werden kann, das die 5 Anzahl anderer Bakterien und Viren, und induziert Eigenschaft aufweist, eine unspezifische Immunität zu auch eine wirksame Widerstandsfähigkeit gegen den induzieren und das im wesentlichen pyrogenfrei ist gewöhnlichen Erkältungsvirus, z. B. indem man es und keine Antigenwirkung besitzt und das beispiels- direkt in die Nasenschleimhaut sprüht,
weise durch Injektion verabreicht werden kann, ohne Das erfindungsgemäß erhältliche neue Produkt daß eine merkbare Gewebsreaktion eintritt. Die Be- io kann zur Verabreichung in Verbindung mit einem zeichnung unspezifische Immunität wird hier in dem oder mehreren pharmazeutischen Exzipienten formuallgemein akzeptierten Sinn verstanden, daß sie nicht liert werden. Die Art des oder der verwendeten nur die Widerstandsfähigkeit sowohl gegen bakterielle Exzipienten wird von der Art der beabsichtigten Präais auch Virusinfektion umfaßt, sondern auch die paration abhängen. Die Zusammensetzungen können Immunität gegen Stress, z.B. Kaltstress, trauma- 15 bequem in Form von Dosierungseinheiten gebracht tischen Schock, endtoxischen Stress usw. Weiter werden, von denen jede vorteilhaft 5 bis 20 mg des wurde gefunden, daß das Produkt antimitotische aktiven Polypeptids enthält. Allgemein ausgedrückt Eigenschaften gegen verschiedene Zellen, z. B. Heia kann man sagen, daß Präparationen zur parenteralen und Chang-Zellen, besitzt. Verabreichung formuliert werden können, und in

Chemisch gesehen ist das Produkt ein Polypeptid 20 diesem Fall wird der Exzipient eine parenteral ver-

oder eine Mischung von Polypeptiden, wobei diese wendbare Flüssigkeit, wie steriles pyrogenfreies Wasser,

Bezeichnung in einem weiten Sinne hier verwendet sein, oder zur oralen Verabreichung, wo Wasser zu

wird, um Substanzen zu definieren, die eine zugrunde den Exzipienten gehören kann, gemeinsam mit einem

liegende Polypeptidstruktur aufweisen, ohne Berück- oder mehreren Geschmackstoffen, Konservierungs-

sichtigung, ob andere Gruppen, wie z. B. Kohlen- 25 mitteln, Dispersionsmitteln, Farbstoffen, Süßstoffen

hydrate, ebenfalls vorhanden sind. Bei der Hydrolyse u. dgl. Die Präparationen können auch in fester Form,

erhält man eine Anzahl von Aminosäuren und Sub- ζ. B. als Tabletten, die den aktiven Faktor enthalten,

stanzen, die Sacharidreaktionen geben. Die identifi- hergestellt werden. Bei einem bevorzugten Verfahren

zierbaren Aminosäuren sind Glutamin- und Aspara- wird eine schließlich erhaltene Lösung lyophilisiert, in

ginsäure, Arginin, Lysin, Alanin, Serin, Valin, Leucin, 30 sterilen pyrcgtnfreiem Wasser wieder aufgelöst und

Isoleucin, Glycin, Phenylalanin, Histidin, Prolin, mittels Durchlaufen durch geeignete gesinterte Glas-

Tyrosin und Threonin. Das Produkt gibt eine positive filter sterilisiert.

Biuretreaktion, eine positive Anthronreaktion, die das Der aktive Faktor kann auch zur lokalen Verab-

Vorliegen von Hexosen anzeigt und eine positive An- reichung formuliert werden, z. B. aus wäßriger Lösung

zeige auf Hexosamine nach einer modifizierten Elson- 35 als Spray, der ebenfalls ein Konservierungsmittel, wie

Morgan-Reaktion (L. Svennerholm, Uppsala Äthanol oder p-Hydroxybenzoesäuremethyl- oder

Lakare-forenings Forhandlungar, 61 [1956], S. 287. -äthylester, enthalten kann.

Reagens ist p-Dimethylamino-benzaldehyd in Acetyl- Die Spraylösung kann z. B. 0,01 bis 10 Gewichts-

aceton). prozent, vorzugsweise 0,05 bis 0,5 °/o des aktiven

Das Produkt zeigt normalerweise eine saure Reak- 4° Materials enthalten.

tion mit einem isoelektrischen Punkt im Bereich von Das erfindungsgemäEe Verfahren zur Gewinnung

pH 4 bis 5. Die Aminosäuren Glutaminsäure und eines Wirkstoffes von Polypeptidnatur mit unspezifi-

Asparaginsäure liegen im Molekül in beträchtlichen scher Immunisierungswirkung besteht darin, daß aus

Mengen vor und sind wahrscheinlich für diese Agidität einem Säugetierorgan, insbesondere Leber, Niere,

verantwortlich. Neutrale aktive Polypeptide können 45 Milz oder Blut oder aus dessen wäßrigem Extrakt nach

auch vorhanden sein. üblichen biochemischen Fraktionierungs-, Adsorp-

Das Molekulargewicht des aktiven Faktors beträgt tions-, Eluierungs- und Molekularsiebmethoden das

mindestens 10³, und es werden Produkte bevorzugt, grünfluoreszierende Polypeptid isoliert wird. Dabei

in denen praktisch kein Material aus dem tierischen wird der Organextrakt vorteilhaft vor der weiteren

Organextrakt'mehr enthalten ist, das ein Molekular- 50 Verarbeitung auf 1CO°C erhitzt. Weiterhin ist es vor-

gewicht unter 8000 aufweist. Im allgemeinen enthalten teilhaft, bei der Durchführung des erfindungsgemäßen

die bevorzugten Produkte kein Material mit einem Verfahrens mit oder ohne der erwähnten vorherigen

Molekulargewicht unter 10⁴. Erhitzung eine Fraktionierung durch Zusatz von

Das Produkt enthält im wesentlichen keinen Phos- Ammonsulfat, Ammonchlorid oder Phosphorwolfphor, was anzeigt, daß praktisch keine Nucleinsäure- 55 ramsäure als Proteinfällungsmittel zu dem wäßrigen verunreinigungen vorliegen, und enthält 13 bis 15% Organextrakt oder eine Absorption an Asbest, vorStickstoff. Es wird durch Phosphorwolframsäure aus- zugsweise bei pH 4 bis 7, gefolgt von Elution, vorgefällt, aber nicht durch Sulfosalicylsäure, und ist in zugsweise zuerst mit wasserfreiem Phenol und dann Wasser, Säuren und Basen löslich, z. B. in flüssigem mit verdünntem Ammoniak, durchzuführen.
Phenol, 10°/₀iger Natronlauge usw., ist in 70%ig 60 Bei der erwähnten Absorption an Asbest und anwäßrigem Äthanol löslich, in 96°/_oigem Äthanol schließenden Elution wird das Material vorteilhaft schwach löslich und in Äther, Chloroform und Petrol- vor der Isolierung mit einem Molekularsiebmaterial äther unlöslich. behandelt oder dialysiert. Bei dieser Arbeitsweise wird

Das Produkt ist bis mindestens 100°C hitzestabil vorteilhaft als Molekularsiebmaterial ein vernetztes

und hält ein halbstündiges Erhitzen auf 100°C im 65 Dextran verwendet.

Wasser aus. In Lösung im wäßrigen Medium zeigt Wird eine Fraktionierung durch Zusatz von Ammon-

das Produkt eine gründliche Fluoreszenz, die von sulfat als Proteinfällungsmittel durchgeführt, dann

Gelbgrün bis Blaugrün variiert, je nach der Reinheit. arbeitet man vorteilhaft in Gegenwart von Äthanol

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und extrahiert das Polypeptid in die dabei gebildete erfindungsgemäßen Fraktionierung angewendet wer-

alkoholische Phase. den.

. Die Isolierung des gesuchten Polypeptids wird Ein besonders günstiges Verfahren zur erfindungs-

durch seine Grünfluoreszenz stark erleichtert, die bei gemäßen Fraktionierung besteht im Zusammen-

jedem Anreicherungsschritt ohne weiteres das Auf- 5 bringen des Extraktes mit einem Adsorbens, das zum

finden der Fraktion gestattet, welche das Polypeptid Adsorbieren von hochmolekularen Stoffen dient, um

enthält. Daher können die üblichen biochemischen das aktive Polypeptid zu adsorbieren, gefolgt von einer

Anreicherungsschritte in beliebiger Zusammenstellung Elution mit basischen oder anderen Flüssigkeiten

und Reihenfolge verwendet werden, wobei stets durch oder Lösungen mit hoher Elektrolytkonzentration,

einen einfachen Vorversuch festgestellt werden kann, io Absorbentien, die dazu neigen, vorzugsweise hoch-

ob eine gute Trennwirkung bzw. Anreicherung er- molekulare Stoffe zu absorbieren, sind bekannt. Diese

halten wird und wo sich die gesuchte Substanz findet. Stoffe sind im allgemeinen anorganische Substanzen,

Zur Anreicherung läßt sich ferner auch das hohe wie komplexe Silikate, z. B. Bentonit, Montmorillonit,

Molekulargewicht des gesuchten Materials vorteilhaft Celit usw. Es wurde jedoch gefunden, daß Asbest ein

ausnützen. 15 besonders wirksames Adsorbens darstellt und aus

Der beim vorliegenden Verfahren zu verwendende diesem Grund bevorzugt wird. Der pH-Wert des wäßrige Organextrakt kann z. B. lediglich ein wäßriger Extrakts während der Adsorption liegt vorzugsweise

Extrakt dieses Organs, z. B. frischer Ochsenleber, dar- zwischen 4 und 7, günstigerweise bei etwa 5 bis 6. Die

stellen, aber vorteilhaft ist es, den Extrakt einer Adsorption kann bei Zimmertemperatur oder höheren

weiteren Behandlung zu unterziehen, hauptsächlich, 20 oder geringeren Temperaturen eintreten. Das aktive

um unerwünschtes Protein zu entfernen. Besonders Polypeptid scheint mindestens bis 100° C hinauf stabil

günstig ist ein Erhitzen des Extrakts, weshalb z. B. im zu sein.

Fall von Leber diese zerkleinert und dann unter Eine Elution des aktiven Polypeptids kann mit einer Rühren mit Wasser auf 100⁰C erhitzt werden kann, basischen oder sauren Flüssigkeit oder einer Lösung worauf die überstehende Flüssigkeit abgetrennt und 25 von hoher Elektrolytkonzentration bewirkt werden, konzentriert wird, um Feststoffe auszufällen, die den Falls eine saure Flüssigkeit verwendet wird, kann aktiven Faktor enthalten. Die so erhaltene Paste diese eine schwache flüssige Säure, z.B. flüssiges kann auch gegebenenfalls mit Alkohol extrahiert und Phenol sein. Wäßrige Säuren lassen sich ebenfalls verdas Lösungsmittel anschließend entfernt werden, z. B. wenden, vorzugsweise wäßrige Lösungen von schwadurch Vakuumdestillation. Es ist auch möglich, uner- 30 chen Säuren, wie Essigsäure oder Ameisensäure mit wünschtes Material mit Alkohol zu fällen oder die einem pH-Wert unter 4. Zu den für die Elution geeignewäßrige Lösung mit Phenol zu extrahieren, gefolgt ten basischen Flüssigkeiten gehören wäßrige Alkalien, von einer Gewinnung des aktiven Materials, z. B. wie wäßrige Sodalösung, die beispielsweise zehnnormal durch Ausfällen mit Äther. ist, und ein normaler wäßriger Ammoniak. Oft ist es

Wäßrige Extrakte anderer fester Organe können in 35 vorteilhaft, das Absorbat mit Phenol zu waschen und

ähnlicher Weise hergestellt werden. dann nach dem Auswaschen des Phenols die Elution

Im Fall von Blut kann dieses zum Koagulieren des mit wäßrigem Alkali auszuführen. Falls die Eluier-

vorhandenen Proteins erhitzt und filtriert werden. Ein flüssigkeit wasserfrei sein soll, z. B. 100°/₀iger Phenol,

Mittel zur selektiven Fällung von Protein, z. B. Sulfo- wird der Asbest vor der Elution vorzugsweise ge-

salicylsäure, kann dem Filtrat zugesetzt werden, um 40 trocknet, z. B. über P₂O₅. Zu den Lösungen mit hoher

restliches Protein zu entfernen, worauf die Mischung Elektrolytkonzentration, die zur Elution verwendet

erneut gefiltert wird. Die verbleibende Flüssigkeit ist werden können, gehören wäßrige Salzlösungen, z. B.

zur Verwendung im vorliegenden Verfahren geeignet. molare wäßrige NaCl-Lösung.

Weiter ist es möglich, den Organextrakt noch einer Das wäßrige Organpräparat befindet sich vorteilhaft

weiteren Vorbehandlung zu unterwerfen, indem das 45 in verhältnismäßig konzentriertem Zustand, wenn es

aktive Material bei pH 5 bis 10 mit einem wasser- mit dem Adsorbens erfindungsgemäß zusammenge-

löslichen mehrwertigen Metallsalz in Gegenwart eines bracht wird, z. B. in einer Konzentration von etwa

mit Wasser mischbaren Alkohols ausgefällt wird. So 25 g Feststoffe/100 ml.

kann z. B. der wäßrige Organextrakt nach den oben Weiter wurde gefunden, daß das gewünschte PoIy-

beschriebenen Reinigungsschritten falls gewünscht mit 50 peptid ein Molekulargewicht von mindestens 8000

Calcium-, Barium- oder Bleiacetat, Zink- oder Magne- aufweist und daher nicht durch oder in Molekular-

siumchlorid usw. in Gegenwart von Äthanol zur Aus- siebstoffe laufen kann, die für Moleküle dieser Größe

fällung des aktiven Polypeptids behandelt werden, oder noch größere undurchlässig sind, z. B. ein ver-

worauf die Metallionen wieder entfernt werden können, netztes Dextranderivat, z. B. mit Äthylenoxyd ver-

z. B. durch Abtrennen des Niederschlags, beispiels- 55 netztes Dextran (z. B. das unter dem geschützten

weise durch Filtrieren, Zentrifugieren usw., Wieder- Namen »Sephadex G 50« vertriebene Produkt), das für

auflösen in Wasser und Durchlaufenlassen der erhal- Moleküle mit einem größeren Molekulargewicht als

tenen Lösung durch ein saures Ionenaustauscherharz. 8000 bis 10 000 undurchlässig ist. Es ist möglich,

Andererseits kann auch ein unlösliches Salz des Verunreinigungen mit niederem Molekulargewicht aus

Metalls ausgefällt werden. Beispielsweise kann Barium 60 dem den aktiven Faktor enthaltenden Material durch

als Bariumsulfat mit Schwefelsäure gefällt werden. die Molekularsiebtechnik zu entfernen, z. B. indem

Der Behandlung mit mehrwertigem Metallsalz und eine wäßrige Lösung des Materials durch eine Säule

dem Alkohol kann vorteilhaft nach Entfernen der mit einem vernetzten Dextran geschickt wird, oder

Metallionen eine Behandlung mit einem basischen durch Dialyse, Elektrodialyse oder Ultrafiltration

Ionenaustauscherharz folgen, um das aktive Polypeptid 65 durch Membranen geeigneterStruktur. Die Verwendung

zu adsorbieren. Dessen Elution kann dann wieder mit von Dextranprodukten oder Molekularsiebstoffen

schwach alkalischen Lösungen erfolgen. Dieses Ver- wird durch Per Flodin in »Dextran gels and their

fahren kann also gegebenenfalls vor oder nach der application in gel filtration«, Uppsala, 1962, beschrie-

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ben. Zu den anderen Molekularsiebstoffen gehören Konzentration des Elektrolyten kann zwischen 0,05

bestimmte vernetzte Galacto-Mannan-Produkte und 0,5 η liegen, z. B. 0,In-NaCl oder 0,0In-NaOH.

(D e u e 1 et al, Advances in Chemistry Series, 1954, Der aktive Faktor kann auch vorteilhaft statt mit

11, S. 51) und Mischpolymerisate von Acrylamid und Wasser mit einer 0,05 bis 0,5η alkalischen Lösung,

Methylen-bis-acrylamid (Canadian Journal of Che- 5 z.B. einer Ο,ΐη-Natronlauge, sshr zufriedenstellend

mistry, 1962, 40, S. 159). durch die vernetzte Dextransäule gewaschen werden.

Unter der hier verwendeten Bezeichnung »Material Die erhaltene Lösung kann durch Behandlung mit

mit hohem Molekulargewicht« wird ein Material mit einem Kationenaustauscherharz in Wasserstofform,

einem Molekulargewicht über 8000 verstanden. Mit neutralisiert werden.

der Bezeichnung »Material mit niederem Molekular- io Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zur Fraktio-

gewicht«, wie sie hier verwendet wird, versteht man ein nierung besteht in der Ausfällung des gewünschten

Material mit einem Molekulargewicht unter 8000. Die Polypeptids mit einem inerten Protein-Fällungsmittel,

Entfernung alles unerwünschten Materials mit niede- das das Protein oder die Polypeptidstoffe nicht zer-

rem Molekulargewicht, das vorhanden ist, ist natürlich stört oder denaturiert, sondern lediglich aus ihrer

vorteilhaft, und eine brauchbare Wirkung erhält man 15 Lösung fällt.

auch mit Molekularsieben, die für Moleküle von be- Das Proteinfällmittel kann als feste Substanz wie

trächtlich niedrigerem Molekulargewicht, z. B. 10³, als wasserlösliche anorganische Substanz zugesetzt

undurchlässig sind. Um jedoch eine möglichst wirk- werden, z. B. ein Salz, wie Ammonsulfat, Ammon-

same Trennung zu erzielen, sollte das Molekularsieb- chlorid usw., oder Phosphorwolframsäure, oder kann

material vorzugsweise für Moleküle mit einem Mole- 20 eine Flüssigkeit sein, z. B. eine konzentrierte Lösung

kulargewicht von etwa 8000 durchlässig sein, wobei von diesen Stoffen.

das aktive Material noch ausgeschlossen bleibt, und Das Material mit hohem Molekulargewicht, welches

besonders wirksam sind hierbei die vernetzten Dex- das aktive Polypeptid enthält, kann aus dem wäßrigen

träne, auf die oben Bezug genommen wurde. Extrakt gefällt und abgetrennt werden, z. B. durch

Ein weiteres günstiges Verfahren zur erfindungs- 25 Filtrieren, Zentrifugieren usw., oder kann in einer

gemäßen Fraktionierung besteht daher im Zusammen- getrennten organischen Phase gelöst werden. Die

bringen des wäßrigen Extrakts mit einem Molekular- organische Phase kann eine mit Wasser unmischbare

siebmaterial, das für Moleküle mit einem Molekular- Füssigkeit oder vorzugsweise eine polare Flüssigkeit,

gewicht über 1000 undurchlässig ist, um diese Moleküle die gewöhnlich mit Wasser mischbar ist, aber eine

von den Substanzen mit geringerem Molekulargewicht 30 gstrennte Phase bildet, wenn die wäßrige Phase große

zu trennen. Mengen des gelösten Stoffes enthält, darstellen, wie im

Vernetzte Dextrane und verwandte' Molekular- Falle der Verwendung eines anorganischen Salzes als siebstoffe, die in feinteiliger Form durch Absorption Fällmittel. Derartige polare Lösungsmittel haben eine von niedermolekularen Stoffen in ihre Teilchen wirken, höhere Löslichkeit für den Faktor als unpolare Lösungswerden vorzugsweise in Säulen unter Verwendung der 35 mittel.

Chromatographieverfahren angewendet. In derartigen Bei einem bequemen Weg zur Ausführung der

Säulen bleibt das aktive Polypeptid in der Flüssigkeit, Erfindung kann das Protein-Fällmittel einer wäßrigen

die sich im Raum zwischen den Partikeln bewegt und Lösung zugesetzt werden, die das aktive Polypsptid

rasch durch die Säule läuft. Die Kolonne kann mit ■ und ein wassermischbares Lösungsmittel enthält,

Wasser gewaschen werden, um das aktive Polypeptid 40 wobei sich zwei Phasen bilden, wovon die organische

durchzuwaschen, und obwohl das niedermolekulare Phase abgetrennt und das aktive Polypeptid daraus

Material bei diesem Verfahren langsam eluiert wird, gewonnen wird.

läßt sich das aktive Material gewöhnlich entfernen, Im allgemeinen wird der pH-Wert des wäßrigen bevor das unerwünschte Material aus der Kolonne Extrakts die Trennung beeinflussen, und die Menge auszutreten beginnt. Das aktive Polypeptid kann im 45 des verwendeten Fällmittels muß auf den pH-Wert allgemeinen durch die geeigneten biologischen Tests abgestimmt werden. Das Vorliegen anderer gelöster auf Fraktionen, die aus der Säule eluiert werden, fest- Stoffe, z. B. wassermischbarer organischer Flüssiggestellt werden. Die niedermolekularen Verunreini- keiten, wie Äthanol, Aceton usw., beeinflußt ebenfalls gungen werden im allgemeinen von braunen oder die Konzentration des Fällmittels, die die besten Ergebgelben Stoffen begleitet, deren Fortbewegung visuell 50 nisse liefert,
verfolgt werden kann. ' Im allgemeinen liegt, wenn Ammoniumsulfat als

Die Molekularsiebfraktionierung gemäß der Erfin- Fällmittel verwendet wird, die optimale Salzkonzen-

dung kann bei einer niederen Temperatur, z. B.+4⁰C, tration zwischen 25 und 60% Sättigung, wobei der

ausgeführt werden, um ein Bakterienwachstum zu pH-Wert vorzugsweise im Bereich von 5 bis 8 liegt,

vermeiden. Bei höheren Temperaturen ist es empfehlens- 55 Wird auch eine organische mit Wasser mischbare

wert, eine bakterizide Substanz, wie Phenol, Cresol Flüssigkeit verwendet, z. B. Äthanol, dessen Menge

usw., zuzusetzen. günstig zwischen 30 und 60 °/₀ der wäßrigen Phase

Bei der Herstellung der mit vernetztem Dextran ausmacht, so werden die genauen Mengen von Ammon-

gefüllten Säule wird das feinteilige Material Vorzugs- sulfat und wassermischbarer Flüssigkeit so gewählt,

weise ein- oder mehrmals mit wäßrigem Natrium- 60 daß man zwei Phasen erhält. Wird z. B. eine 46°/„ige

chlorid, das z.B. 0,05 η ist, gerührt und schließlich Äthanolkonzentration verwendet, so kann die Ammon-

zur Entfernung der Chloridionen mit Wasser ge- Sulfatkonzentration 25 °/₀ Gewichtsprozent ausmachen,

waschen. Die Menge der zugesetzten organischen Flüssig-

Der wäßrige organische Extrakt, der auf die Säule keit wird vorzugsweise so berechnet, daß man ein

gegeben wird, enthält vorzugsweise einen Elektrolyten, 65 verhältnismäßig kleines Volumen in der abgetrennten

z. B. ein Neutralsalz, wie Natriumchlorid. Da das Phase erhält, so daß eine Konzentration des aktiven

aktive Material gelegentlich sauer ist, kann der Elek- Polypeptids dabei erfolgt. Hierbei muß darauf hinge-

trolyt auch alkalisch sein, z. B. Natronlauge. Die wiesen werden, daß im Falle des Zusatzes von Äthanol

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etwas unerwünschtes Material gewöhnlich ausgefällt die 1 η bzw. n/5 konzentriert ist, zufriedenstellend ist.

wird und vor der Fraktionierung mit einem anorga- Vorzugsweise wird jedoch ein Phosphatpuffer bei

nischen Salz verworfen werden kann. einem pH-Wert von etwa 7,5 oder ein Alkalihalogenid,

Die erfindungsgemäße Fraktionierung wird Vorzugs- wie Natriumchlorid, verwendet, vorzugsweise in höheweise bei Zimmertemperatur ausgeführt, und die oben 5 ren Konzentrationen.

angegebenen bevorzugten Konzentrationen des Fäll- Die im Eluat vorhandenen unerwünschten anormittels sind bei höheren Temperaturen nicht immer ganischen Ionen können durch Behandlung mit einem anwendbar. Der aktive Faktor ist jedoch bis zu 9O⁰C Molekularsiebmaterial oder durch Dialyse entfernt stabil, und auch höhere Temperaturen könnten ver- werden. Desgleichen können Kationen durch Behandwendet werden, ohne daß eine Inaktivierung auftritt. io lung mit einem vernetzten Kationenaustauscherharz

Die erfindungsgemäße Fraktionierung kann direkt entfernt werden.

auf den wäßrigen Tierorganextrakt oder auf wäßrige Zur weiteren Erläuterung der Erfindung werden die

Lösungen, die aus anderen Reinigungsverfahren er- folgenden Beispiele angegeben,
halten wurden, angewendet werden. Außerdem können

auch andere Reinigungsverfahren auf das Material 15 Beispiell

angewendet werden, das nach dem vorliegenden Ver- . Herstelluns einer Leberoaste

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fahren erhalten wird, und im allgemeinen kann die ' ° ^v

Fraktionierung auf jeder Stufe der gesamten Reinigung 8 kg frische Ochsenleber wurden zerkleinert, 16 I

des aktiven Faktors erfolgen. Wasser und 108 g Phenol (zur Verhütung von Bak-

Weiter wurde gefunden, daß das aktive Polypeptid 20 terienbefall) zugegeben. Die Mischung wurde 2 Stunauf besonders vorteilhafte Weise weitergereinigt wer- den gerührt, dann unter Rühren V₂ Stunde auf 100⁰C den kann, indem man es an ein schwach basisches erhitzt und dann bis zum nächsten Tag bei Zimmer-Ionenaustauschermaterial auf Cellulosebasis adsor- temperatur stehengelassen. Dann wurde sie auf 7O⁰C biert und anschließend davon mit einem wäßrigen erhitzt und filtriert. Der Rückstand wurde mit Wasser, Elektrolyten, z. B. einer neutralen, sauren oder schwach 25 das 0,5 °/₀ Phenol enthielt, gewaschen. Die vereinigten alkalischen Lösung eluiert. Filtrate (17,8 1) enthielten 2,8 g trockene Feststoffe

Dieses Verfahren wird günstigerweise in Kombi- pro 100 ml. Die Lösung wurde bei 60 bis 7O⁰C im nation mit einem der oben beschriebenen erfindungs- Vakuum zu einer gelben Paste mit einem Gewicht von gemäßen Verfahren ausgeführt, und zwar entweder 760 g konzentriert, die 65% trockene Feststoffe entvor oder nach der Fraktionierung. 30 hielt. Der Paste wurden dann 3,4 1 75°/_oiger Äthanol

Das beim vorliegenden Verfahren verwendete (Volumen/Volumen) zugesetzt und die Mischung Ionenaustauscherharz auf Cellulosebasis kann bei- 6 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Am folgenspielsweise zu den von Peterson und Sobers, den Tag wurde der Niederschlag abfiltriert und mit J. A. C. S., 78, S. 751 (1956), beschriebenen Arten 70%igem Äthanol (v/v) gewaschen. Die vereinigten gehören. Zu diesen Stoffen gehört chemisch so modi- 35 Äthanolfiltrate (4,6 1) enthielten 266 g trockene Festfizierte Cellulose, daß sie sehr schwach basische Grup- stoffe. Sie wurden bei 30 bis 4O⁰C im Vakuum zu pen, wie Aminogruppen, Dialkylammogruppen, Dial- 375 g einer braunschwarzen Paste mit 71 °/₀ Feststoffkylaminoalkylgruppen usw., enthält. Besonders geeig- gehalt konzentriert,
net ist ein Ionenaustauscher, der das Reaktionsprodukt ,.

von Epichlorhydrin, Triäthanolamin und Natrium- 4° ^b) Adsorption an Asbest

cellulose darstellt, bekannt unter der Kurzbezeichnung 800 g Leberpaste wurden in 2,8 1 frisch destilliertem

ECTEOLA-Cellulose. DEAE-Cellulose oder DEAE- Wasser, das 0,3 °/₀ Tricresol enthielt, gelöst. Die Sephädex können ebenfalls verwendet werden. Lösung hatte einen pH-Wert von 4,9 und wurde auf

Der Ionenaustauscher auf Cellulosebasis wird vor- 11,2 g Asbestpulver gegeben. Diese Mischung wurde zugsweise in feinteiliger Form in einer Säule verwendet 45 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann und wird vorzugsweise auf einen pH-Wert zwischen 6 weitere 24 Stunden ohne Rühren stehengelassen. Der und 10, vorteilhaft etwa 6,5 bis 8,5 gepuffert. Eine Asbest wurde dann mit Wasser, das 0,3% Tricresol bequeme Pufferlösung ist eine Ammoniumbicarbonat- enthielt, gewaschen. Die vereinigten Überstände wurden lösung oder ein 0,005-Natriumbicarbonat-Kohlen- auf gleiche Weise mit weiteren 11,2 g Asbest behandelt, dioxydpuffer bei pH 6,8. Der wäßrige Organextrakt 5° Die gewaschenen Asbeste wurden im Vakuum über wird ebenfalls vorteilhaft auf etwa den gleichen pH- P₂O₅ getrocknet und wogen dann 25,2 g. Dann wurde Wert gepuffert, bevor er auf die Kolonne gegeben wird, der Asbest in einem Ansatz mit flüssigem 100%igem und es ist vorteilhaft, zum Auswaschen der uner- Phenol bei 50 bis 60° C eluiert, und zwar zuerst mit wünschten Verunreinigungen eine gepufferte Lösung 200 g, dann mit 100 g und schließlich nochmals mit zu verwenden. Der wäßrige Organextrakt ist Vorzugs- 55 200 g. Die vereinigten Eluate wurden dem Fünffachen weise verhältnismäßig verdünnt und enthält vorteilhaft ihres Gewichtes an Äther zugesetzt, der Niederschlag 1 bis 2 Gewichtsprozent trockene Feststoffe. abfiltriert und mit Äther gewaschen. Der erhaltene

Nach dem Waschen kann das aktive Polypeptid von braune Stoff war in Wasser nicht vollkommen löslich, der Säule mit der schwach alkalischen Lösung eluiert aber auf Zusatz von 0,In-NaOH auf pH 7,5 ging der werden. Als Elutionsmittel sind verdünnte, wäßrige 60 ungelöste Rest in Lösung. Dann wurde der Asbest Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxydlösun- zur Entfernung von Phenol mit Äther gewaschen und gen, die eine Konzentration von z. B. 0,05 bis 2η auf- anschließend mit 200 ml In-NH₄OH eluiert. Das weisen, oder Kaliumcarbonat oder eine verhältnis- Eluat wurde nun im Vakuum konzentriert, wobei ein mäßig konzentrierte Lösung von Ammoniumbicarbo- Niederschlag auftrat. Der Überstand wurde zur Weinat, z. B. eine ungefähr molare Lösung geeignet. Die 65 terverarbeitung verwendet.

Eluierung kann auch mit einer sauren Lösung erfolgen, Sowohl die Phenoleluatfraktion als auch die Ammo-

die vorzugsweise ebenfalls ein lösliches Salz enthält, niakeluatfraktion wurde auf Kolonnen (2,8 cm Durchwobei eine Lösung von Essigsäure und Natriumacetat, messer · 32,5 cm Höhe) mit vernetztem Dextran, das

unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, weitergereinigt und in jedem Fall die hochmolekulare Fraktion gesammelt. Die beiden gereinigten Fraktionen (12 mg aus der Phenolfraktion und 18 mg aus der Ammoniakfraktion) waren weder pyrogen beim Kaninchen noch antigen beim Menschen, schützten Mäuse gegen E. coli-Infektion und Hühnerembryo gegen vaccinia virus.

Die biologische Aktivität wird also sowohl mit 100%igem Phenol als auch mit 1 n-Ammoniak eluiert. Weiter wurde festgestellt, daß die biologische Aktivität vom Asbest mit 0,In-NaOH eluiert wird. Die aktiven Fraktionen zeigten in Wasser eine blaugründe Fluoreszenz und ergaben mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag.

Beispiel 2

0,51 menschliches Blut wurden 30 Minuten auf 100° C erhitzt und dann 500 ml einer 0,3gewichtsprozentigen Lösung von Tricresol in Wasser zugesetzt. Die Mischung wurde filtriert, 20 ml einer Lösung von 20 gewichtsprozentiger Sulfosalicylsäure in Wasser dem Filtrat zugesetzt und das ganze erneut filtriert. Dann wurden 1,84 g Asbest dem Filtrat zugesetzt und dann bei Zimmertemperatur zwei Tage stehengelassen.

Der Asbest wurde aus der flüssigen Phase abzentrifugiert und mit 90 g 100⁰/oigem Phenol bei 60° C eluiert, dann wurden dem Phenoleluat 450 ml Äther zugesetzt und der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Die erhaltenen Feststoffe wurden in Wasser wieder aufgelöst und der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 7 eingestellt. Die erhaltene Lösung hatte ähnliche Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 1.

Beispiel 3

a) Herstellung der Säule, die mit vernetztem-Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, gefüllt ist

Vernetztes Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, wurde in 0,05m-Natriumchlorid suspendiert und die Mischung 30 Minuten gerührt. Dann wurde 10 bis 15 Minuten absitzen gelassen und der Überstand mit den feineren Teilchen abdekantiert. Nach dem Ersatz des Überstands mit frischem 0,05m-Natriumchlorid wurde das ganze Verfahren weitere viermal wiederholt. Dann wurde das Sephadex unter Rühren in eine Säule von 45 cm Durchmesser und 30 cm Höhe eingefüllt und der Schwerkraft überlassen. Dann wurde die Säule bei +4⁰C mit frisch destilliertem Wasser chloridionenfrei gewaschen.

b) Fraktionierung der hochmolekularen Fraktion aus einer wäßrigen Leberpräparation

Ein Leberextrakt aus 6 kg frischer Leber wurde in der üblichen Weise aus frischer Rindsleber durch Proteolyse mit Papain, Fällung des Proteolysats mit Alkohol, Einengen des Filtrats und Extraktion der konzentrierten Lösung mit wassergesättigtem Phenol, Verdünnen des Phenolextrakts mit Äther und Extraktion der Phenol-Äthermischung mit Wasser hergestellt. Zu 600 ml des wäßrigen Extrakts wurde eine 5°/₀'ge Kaliumhydroxydlösung zugesetzt bis auf pH 8,2. Dann wurden 7,32 g Bariumacetat Ba(CH₁CO₂)., · H₂O zugesetzt und die Lösung über Nacht bei 0⁰C stehengelassen. Ein geringer Niederschlag wurde abzentrifugiert. Der überstehenden Flüssigkeit wurden 2,8 1 96%iger Alkohol zugesetzt und der gebildete Niederschlag am nächsten Tag aus der Lösung abzentrifugiert, mit Alkohol und dann mit Äther gewaschen und getrocknet. Der Niederschlag wog 10,95 g.
Dann wurde der Niederschlag in 500 ml Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule, die 140 ml eines sauren Ionenaustauscherharzes enthielt, langsam durchlaufen gelasssen. Dann wurde die Säule mitWasser gewaschen, bis die austropfende Lösung pH 5,5 bis 6

ίο zeigte und farblos war. Dann wurde die Lösung mit 2n-NaOH auf pH 6,5 eingestellt, im Vakuum konzentriert und schließlich gefriergetrocknet. Das trockene Produkt wog 2,9 g.
0,5 g des Produkts (Äquivalent 1 kg frischer Leber) wurde in 50 ml Wasser gelöst. Dieser Lösung, die einen pH-Wert von 6,6 hatte, wurden 1,5 g Aktivkohle zugesetzt, die vorher mit Wasser und dann mit Alkohol gewaschen worden war. Nach 19stündigem Stehen wurde die Aktivkohle aus der Lösung abfiltriert und mit Wasser gewaschen, bis das Filtrat farblos war. Die gesammelten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert und wogen nach dem Gefriertrocknen 0,250 g. 10 g dieses gefriergetrockneten Materials wurden in 40 ml Wasser gelöst und durch eine Säule, die 140 ml eines sauren Ionenaustauscherharzes enthielt, geschickt, die anschließend mit Wasser gewaschen wurde. Das Leervolumen (70 ml) wurde verworfen, die folgenden 200 ml von leichtbräunlicher Farbe, die hochmolekulare Stoffe enthielten, wurden gesammelt und gefriergetrocknet.

Das Gewicht der Fraktion betrug 150 mg. Die Hauptmenge des dunkelgefärbten Materials des Leberpräparats lief sehr langsam durch die Kolonne und besaß daher ein niederes Molekulargewicht. Die aktive Fraktion zeigt in Wasser eine blaugrüne Fluoreszenz und bildete mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag.

c) Antigenwirkung

Die hochmolekulare aktive Fraktion zeigte im Hauttest keine antigene Reaktion, wenn einem Menschen 0,1 mg injiziert wurde.

d) Schutz gegen E. coli-Infektion bei Mäusen

Die hochmolekulare aktive Fraktion zeigte eine Schutzwirkung, wie die folgenden Angaben zeigen.

Die Infektionsdosis an Bakterien betrug 1,25 · 10⁸ Organismen pro Maus. Jeder Maus wurden 0,1 mg (gelöst in O,3°/o'g&m wäßrigem Tricresol) der hochmolekularen Fraktion intramuskulär injiziert. Einer Gruppe von sechs Mäusen wurde die hochmolukulare Fraktion 3 Stunden vor der Bakterieninfektion gegeben und einer anderen Gruppe 6 Stunden vorher. Sechs Mäuse, die nur infiziert wurden, dienten als Kontrolle.

Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse:

	vor vor	der der	Infektion Infektion	Überlebende/Gesamt zahl der Mäuse
⁶⁰ Kontrolle 3 Stunden 6 Stunden			0/6 3/6 2/6

In einem zweiten Experiment betrug die Infektionsdosis 3,5 · 10^s Organismen pro Maus. Die Dosis der intramuskulär injizierten hochmolekularen Fraktion betrug 0,2 mg (gelöst in 0,1 ml Salzlösung). Im übrigen

wurde das Experiment wie oben angegeben ausgeführt. Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse:

	vor vor	der der	Infektion Infektion	Überlebende/Gesamt zahl der Mäuse
Kontrolle 3 Stunden 6 Stunden			0/6 4/6 3/6

e) Schutz gegen vaccinia virus

Die hochmolukulare Fraktion schützt Hühnerembryos gegen vaccinia Infektion (bei einer Dosierung von 2,55,Mg). Die in Wasser gelöste hochmolekulare Fraktion wurde auf die chorioallantoische Membran von 10 bis 11 Tage alten Hühnerembryos eingeführt. 24 Stunden danach wurden die Embryos mit dem vaccinia virus infiziert. Dann wurden die Embryos ίο 5 Tage inkubiert. Die nachstehende Tabelle zeigt die Ergebnisse:

Verdünnung der Vaccine	Mit hochmolekularer Fraktion behandelt	Kontrolle
ίο-⁶ 10-' ίο-⁸	einige getrennte Kolonien; fünf Embryos lebend, eines tot weniger getrennte Kolonien; sechs lebende Embryos wenige Kolonien; sechs lebende Embryos	zahlreiche Kolonien; alle Embryos tot zahlreiche Kolonien; vier Embryos tot, eines lebend weniger zahlreiche Kolonien; sechs Embryos lebend

Beispiel4

Zur Verhinderung der Koagulation wurden 61 Ochsenblut gerührt, 0,3% Tricresol zugegeben und das Ganze 1 Stunde auf 100⁰C erhitzt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Mischung wurde filtriert, und dem Filtrat (41) wurden 25,5 ml 20%ige Sulfosalicylsäure zugesetzt. Der erhaltene Niederschlag wurde entfernt. Das Filtrat wurde konzentriert und der pH-Wert auf 8 eingestellt. Dann wurde das Material über eine Säule (4 · 32 cm) vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, in 0,01 n-NaOH fraktioniert und die hochmolekulare Fraktion gesammelt. Überschüssige NaOH wurde mit einem Kationsaustauscherharz in Wasserstofform, das unter dem geschützten Warenzeichen »Amberlite IR120« erhältlich ist, bis pH 7,0 entfernt und die erhaltene Lösung gefriergetrocknet. Ausbeute 481 mg.

Beispiel 5 Fraktionierung auf Ecteola-Cellulose

Soviel Leberpaste, als 0,4 g Trockensubstanz entsprach, wurden in 25 ml 0,01 m · NH₄HCO₃ gelöst. Der pH-Wert wurde durch Zusatz von starkem Ammoniak auf 8,5 eingestellt. Dann wurde die Lösung durch eine Ecteola-Säule (1,5 cm Durchmesser, 5 cm Höhe) geschickt, die vorher mit 0,01 ITi-NH₄HCO₃-Puffer von pH 8,5 äquilibriert worden war. Nicht absorbiertes Material wurde mit 30 ml 0,01m-NH₄HCO₃-Puffer von pH 8,5 ausgewaschen. Anschließend wurde die biologische Aktivität von der Säule mit m-NH₄HCO₃ eluiert. Von einer derartigen Säule konnte die Aktivität auch mit NaOH oder wäßrigem Ammoniak eluiert weiden. Bei der NaOH-Elution wurde der pH-Wert durch HCl-Zusatz auf 7 gebracht. NaCl und NH₄HCO₃ konnten durch Behandlung mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, entfernt werden.

Beispiel 6

Fiaktionierung über Ecteola-Cellulose

a) Behandlung von Ecteola-Cellulose vor der
Verwendung

5 g Ecteola-Cellulose wurden bei Zimmertemperatur 2 bis 3 Stunden mit 100 ml In-NaOH stehengelassen. Drr Überstand wurde abdekantiert, weitere 100 ml Natronlauge zugesetzt und die Mischung 1 Stunde stehengelassen. Dieses Material wurde in eine Säule (1,5 · 7 cm) gegossen und die Natronlauge mit Wasser herausgewaschen. Dann wurde die Säule mit 0,005 m-NaHCO₃-CO₂-Puffer von pH 6,8 äquilibriert.

b) 25 mg der hochmolekularen Fraktion von der Säule mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist, die nach Beispiel 3 aus einer gefällten Leberfraktion hergestellt worden war, wurden in 10 ml 0,005 m-NaHCO₃-CO₂-Puffer von pH 6,8 gelöst und durch die Kolonne geschickt. Dann wurde die Kolonne mit Puffer gewaschen. Die Elution der Kolonne erfolgte mit 2n-NH₄OH und anschließend mit 0,5n-NaOH, wobei die aktive Fraktion heruntergeholt wurde. Die Lösung wurde mit einem Kationenaustauscherharz in Wasserstofform, das unter dem geschützten Warenzeichen »Amberlite IR 120« erhältlich ist, bis pH 6,0 behandelt. Die Lösung wurde gefriergetrocknet und lieferte 24 mg, die noch etwas Natriumbicarbonat enthielten, das durch weitere Behandlung mit vernetztem Dextran entfernt werden konnte.

Beispiel 7

Eine wie im Beispiel 6, a) hergestellte Ecteola-Säule (5 · 1 cm) wurde verwendet. 12,5 mg eines Materials, das durch Behandlung von Leberpaste mit Asbest, Elution mit NaOH, Neutralisation mit HCl und Entfernung des NaCl auf vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex« erhältlich ist, erhalten worden war, wurde in 10 ml 0,005 m-NaHCO₃-CO₂-Puffer von pH 6,7 gelöst und durch die

Säule geschickt. Dann wurde die Säule mit dem Puffer gewaschen und anschließend mit 40 ml 0,1In-NaOH eluiert. Man erhielt so eine Fraktion, die eine gelbe Fluoreszenz zeigte. NaOH wurde durch Zusatz eines Kationenaustauscherharzes in Wasserstofform, das unter dem geschützten Warenzeichen »Amberlite IR 120« erhältlich ist, entfernt bis auf pH 7,0 und die erhaltene Lösung gefriergetrocknet. Das Gewicht des Trockenproduktes, das noch etwas NaHCO₃ enthielt, betrug 10 mg.

Beispiel 8

50 1 gerührtes Ochsenblut wurden mit 150 ml Tricresol versetzt und 2V₂ Stunden unter Rückfluß auf 9O⁰C erhitzt. Dann wurden der heißen Lösung 82 1 96%iger *5 Äthanol zugesetzt und ohne weiteres Erhitzen 1 Stunde gerührt. Dann wuide die Mischung über Nacht auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen und filtriert, wobei man 80 1 Filtrat erhielt. Nun wurden 43 1 Wasser zugesetzt und dieser Mischung eine 20°/₀ige Sulfosalicylsäurelösung in Wasser bis pH 1 zugegeben. Der Niederschlag wurde verworfen und das pH des Filtrats mit 30°/_oiger Natronlauge auf 8 bis 8,3 eingestellt. Unter Rühren wurden dieser LösungO,25 kg(NH₄)₂SO₄ pro Liter zugesetzt. Beim Stehen trennte sich die Mischung in zwei Schichten. Die obere Schicht (alkoholische Phase) wurde entfernt, im Vakuum auf 5 1 eingeengt und dann über Nacht dialysiert. Dann wurde der pH-Wert durch Zusatz von Natronlauge auf 7,5 bis 8 eingestellt und die Lösung filtriert und im Vakuum auf 450 ml eingeengt.

Eine Säule mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist (9,2 cm Durchmesser, 95 cm Höhe) wurde mit 0,0In-NaOH äquilibriert und dann 250 ml des oben erhaltenen Konzentrats, die mit 30 %iger Natronlauge auf pH 11 bis 12 eingestellt worden waren, auf die Säule gegeben. Als Elutionsmittel wurde 0,01 n-NaOH verwendet. 11 des Eluats (Leervolumen, d. h. das vom Träger aufgenommene Lösungsmittelvolumen) wurden verworfen und die folgenden 1,46 1 gesammelt. Diese Lösung enthielt das hochmolekulare Material und lieferte mit Phosphorwolframsäure einen Niederschlag. Die Lösung wurde durch Zusatz eines Kationenaustauscherharzes in Wasserstofform, das unter dem geschützten Warenzeichen »Amberlite IR 120« erhältlich ist, neutralisiert, das Harz abfiltriert und das Filtrat gefriergetrocknet. Die Ausbeute schwankte von 0,05 bis 0,1 g pro 1 Blut.

B e i s ρ i e 1 9

20 kg zerkleinerte Ochsenleber wurden unter Rühren mit 50 ml Wasser auf 90°C erhitzt. Phenol wurde auf eine Endkonzentration von 0,5% zugesetzt. Diese Mischung wurde über Nacht stehengelassen und das Filtrat im Vakuum auf 3 1 konzentriert. Nun wurden

5.3 1 96%iger Äthanol zugesetzt und die Mischung bei Zimmertemperatur über Nacht stehengelassen. Das Filtrat wurde im Vakuum auf 2,6 1 konzentriert und

8.4 ml Tricresol zugesetzt, um eine Verunreinigung mit Bakterien zu verhüten.

Zu 500 ml dieser Lösung wurden 750 ml gesättigte Ammonsulfatlösung gegeben und der Niederschlag über Nacht bei Zimmertemperatur absitzen gelassen. Der Niederschlag wurde mit gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und in Wasser gelöst, wobei der pH-Wert mit Natronlauge auf 7,0 eingestellt wurde. Die Lösung wurde dialysiert, wobei etwas gefärbte Stoffe entfernt wurden. Die dialysierte Lösung wurde gefriergetrocknet und lieferte 1,53 g.

Biologische Aktivität

Die in diesen Beispielen beschriebenen Produkte zeigen gegen vaccinia virus in Kaninchenhaut Aktivität und inhibieren Mitosis in Heia-Zellen in Pucks medium.

Beispiel 10

Fraktionierung von gemäß Beispiel 9

gewonnenem Material auf vernetztem Dextran,

das unter dem geschützten Warenzeichen

»Sephadex G 50«
erhältlich ist, in 0,1 m-NaCl

Die Lösung enthielt 0,3% Tricresol, um eine Infektion zu verhindern.

0,22 g des gemäß Beispiel 9 gewonnenen Materials wurden in 10 ml Wasser gelöst und 4 ml 20 %ig^e Sulfosalicylsäure zugesetzt. Das Filtrat wurde mit Natronlauge auf pH 7,5 neutralisiert, auf eine Säule mit vernetztem Dextran, das unter dem geschützten Warenzeichen »Sephadex G 50« erhältlich ist (35 cm Höhe, 3,5 cm Durchmesser), gegeben und mit 0,1m-NaCl, die 0,3% Tricresol enthielt, äquilibriert. Die Säule wurde mit der letzteren Lösung eluiert. Die ersten 95 ml Eluat wurden verworfen. Die folgenden 130 ml, die das hochmolekulare Material enthielten, wurden gesammelt, dialysiert und gefriergetrocknet. Ausbeute 80 mg.

Beispiel 11

Eine Diäthylaminoäthylcellulosesäule (DEAE) von 7 cm Höhe und 2,8 cm Durchmesser wurde mit 0,005m-Phosphatpuffer vom pH 7,5 äquilibriert. 200 mg des gemäß Beispiel 8 aus Blut gewonnenen Produktes wurden in 40 ml dieses Puffers gelöst und auf die Kolonne gegeben. —· Die Kolonne wurde anschließend mit 0,005 m-Phosphatpuffer vom pH 7,5 gewaschen. Dann wurde die Kolonne mit 0,005 m-Phosphatpuffer vom pH 7,5, die 0,08m-NaCl waren, dann mit O,05m-Phosphatpuffer, die 0,Im-NaCl waren, und dann mit 0,1 m-Phosphatpuffer pH 7,5, die 0,5m-NaCl waren, eluiert. Die drei Fraktionen wurden dialysiert und gefriergetrocknet. Aus der ersten Fraktion wurden 22 mg, aus der zweiten 55 mg und aus der dritten 55 mg erhalten. Alle Fraktionen zeigten biologische Aktivität.

Beispiel 12
Spray-Lösung für die Nase

1 g gefriergetrocknetes Material, das nach dem Beispiel 4 hergestellt worden war, wurde in 400 ml einer wäßrigen Lösung von Natriumchlorid (0,9 Gewichtsprozent) gelöst, die 0,1 Gewichtsprozent einer Mischung von p-Hydroxybenzoesäure, Methyl- und Äthylester enthielten.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines Wirkstoffes von Polypeptidnatur mit unspezifischer Immunisierungswirkung, dadurch gekennzeichnet, daß aus einem Säugetierorgan, insbesondeie Leber, Niere, Milz oder Blut oder aus dessen wäßrigem Extrakt nach üblichen biochemischen Fraktionierungs-, Adsoiptions-, Eluierungs- und

Molekularsiebmethoden das grünfluoreszierende Polypeptid isoliert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Organextrakt vor der weiteren Verarbeitung auf 100° C erhitzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktionierung durch Zusatz von Ammonsulfat, Ammonchlorid oder Phosphorwolframsäure als Proteinfällungsmittel zu dem wäßrigen Organextrakt durchgeführt wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Absorption an Asbest, vorzugsweise bei pH 4 bis 7, gefolgt von Elution, vorzugsweise zuerst mit wasserfreiem Phenol und dann mit verdünntem Ammoniak, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Material vor der Isolierung mit einem Molekularsiebmaterial behandelt oder dialysiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Molekularsiebmaterial ein vernetztes Dextran verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei Verwendung von Ammonsulfat als Fällungsmittel in Gegenwart von Äthanol gearbeitet wird und das Polypeptid in die dabei gebildete alkoholische Phase extrahiert wird.

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