ES2284539T3 - Un proceso de produccion de proteinas adhesivas polifenolicas. - Google Patents
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Abstract
Un proceso de producción proteínas adhesivas polifenólicas a partir del pie del mejillón, caracterizado por la extracción del pie del mejillón en una solución acuosa débilmente ácida que contiene de 1-10 % en peso de ácido acético y 0.5 - 3 por ciento en peso de ácido perclórico, la separación de las sustancias sólidas de las proteínas en dicha solución acuosa, la precipitación de las proteínas en dicha solución acuosa después de la eliminación de los sólidos adicionando su sales inorgánicas u orgánicas, y la separación de dichas proteínas.
Description
Un proceso de producción de proteínas adhesivas
polifenólicas.
La presente invención se relaciona con un
proceso de producción de proteínas adhesivas polifenólicas a partir
del pie del mejillón, tales proteínas que se refieren aquí como MAP.
La invención también se relaciona con los
productos-MAP producidos por el proceso.
El término MAP es una sigla del término en
Inglés Mussel Adhesive Protein. La designación se basa en la
producción de la proteína referida de una glándula en el pie del
mejillón. La proteína se adhiere fuertemente a todos los tipos de
superficies, por ejemplo a las células vivas y a otros materiales
tales como piedra, madera y materiales similares localizados bajo
agua. Los mejillones se adhieren así a un cierto objeto subacuático
apropiado y allí viven fuera sus vidas.
La proteína adhesiva del mejillón tiene un peso
molecular de aproximadamente 130,000 y consiste de
75-85 secuencias repetidas de hexapéptidos y
decapéptidos. La proteína contiene hasta 20% de lisina y una
inusualmente alta proporción, hasta el 50%, de aminoácidos que
contienen-hidroxi, tal como hidroxi prolinas,
serinas, treoninas, tirosinas, y (que es altamente inusual en un
polipéptido) 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA). Los
grupos DOPA constituyen el 10-15% de la proteína
adhesiva.
La fuerza adhesiva de la MAP por unidad de peso
es comparable con las del cianoacrilato sintético y las resinas
epoxi. La MAP también es resistente al agua y se une muy
efectivamente en agua y se adhiere muy efectivamente a muchas
superficies sólidas y semi-sólidas, tales como al
vidrio, metal, tejido biológico y plásticos, aún a superficies de
Teflon®.
La alta concentración de lisina de la proteína
adhesiva del mejillón probablemente contribuye a su buena adhesión,
particularmente vía enlaces iónicos a las superficies cargadas
negativamente, tales como a muchas proteínas y polisacáridos.
El contenido muy alto de hidroxilo y la
naturaleza ortodifenólica de los grupos DOPA probablemente son
responsables de la única propiedad repelente al agua de la proteína
adhesiva del mejillón y, por consiguiente, para su capacidad a la
adherencia a objetos debajo del agua y para curar en tales
medios.
Los hidroxiaminoácidos también contribuyen
significantemente hacia los enlaces de hidrógeno en la realización
de la fuerza adhesiva.
Los radicales-DOPA
ortodifenólicos forman quelatos fuertes con iones metálicos y óxidos
y semimetales tales como silicon. Esto es una parte esencial de la
capacidad de la proteína adhesiva del mejillón a adherirse a la
piedra, vidrio y superficies similares.
La DOPA se oxida a una quinona a través del
oxígeno molecular y se considera que reacciona con las aminas
biogénicas para formar enlaces covalentes fuertes. Los enlaces
intermoleculares para, inter alia, los radicales lisina son
contribuyentes a la adhesión "interior" y un enlace adhesivo
fuerte.
La proteína adhesiva del mejillón se tolera bien
en sistemas biológicos. Es no-tóxica y generalmente
es biocompatible y muestra una pequeña o ninguna antigenicidad.
Esto la hace potencialmente útil para muchos propósitos, tales como
con una biopelícula adhesiva para inmovilizar las células y enzimas,
como un adhesivo compatible con la humedad para el tratamiento
dental, como un aditivo a o un reemplazo para las suturas en el
tratamiento de heridas y llagas, para fracturas de hueso
complicadas de fijación y cicatrización, como una matriz para las
medicinas que tienen un efecto retrazado, y así sucesivamente. La
proteína adhesiva del mejillón también se puede utilizar como un
agente anti-corrosivo simplemente cubriendo, por
ejemplo, la superficie del acero con una delgada película de la
proteína adhesiva del mejillón que une a los átomos de hierro en el
acero.
Un proceso para la producción de una proteína
adhesiva del mejillón que contiene DOPA e hidroxi prolina (hyp) se
describe en la Especificación de la Patente U.S. 4,496,397. Este
proceso se basa en el pie del mejillón e involucra la formación de
un extracto acuoso de las proteínas a las cuales entonces se les
adiciona un borato a pH 7.0-9.0 para producir un
complejo borato soluble de la proteína que contiene DOPA mientras
que se precipitan completamente las impurezas. El complejo borato
luego se separa y trata de diferentes maneras, tales como con una
solución de ácido acético o liofilizado en una atmósfera inerte. Las
proteínas producidas de acuerdo con este proceso tienen un factor
de pureza de al menos 0.10, mientras que un producto de máxima
pureza debería tener un factor mayor del 0.16.
Otro proceso para la producción de la proteína
adhesiva del mejillón se describe en la publicación Protein
Expression y Purification 1 147 150 (1990). Esta publicación
describe la producción de una proteína adhesiva del mejillón (MAP)
en la base del pie del mejillón, cuando las proteínas se extraen en
una solución que contiene Tris-HCL (pH 7.5, el pH
de la solución reguladora) NaCl, EDTA (ácido
Etilendiaminatetraacético), EGTA (Etilenglicol bis (amino alil
éter) N, N, N, N, ácido tetraacético), PMSF
(Fenilmetilsulfonilfluoruro), KCN, NEM (N-Etil
maleamida) y tripsina-inhibidor de la soja. La
suspensión se separa en una capa sólida y una líquida y la capa
sólida se homogeniza en ácido acético diluido que contiene PMSF y
2-mercaptoetanol. Subsiguiente a la centrifugación,
se le adiciona gota a gota ácido perclórico concentrado a la capa
que luego se centrifuga y la capa líquida se colecta otra vez. La
capa líquida luego se mezcla con acetona fría que contiene Triton X
100, HCL y 2-mercaptoetanol. Las proteínas adhesivas
del mejillón entonces se precipitan y se recuperan para un proceso
posterior.
El proceso descrito anteriormente y también otro
proceso conocido para la producción de las proteínas adhesivas del
mejillón requiere el uso de un número de químicos auxiliares y
resulta en una baja producción y productos relativamente impuros
con respecto a ciertas especies del mejillón. También son poco
económicos y consumen
tiempo.
tiempo.
Se ha deseado mucho, producir proteínas
adhesivas del mejillón de una manera económica a una gran escala
mientras se obtienen productos de la pureza deseada. Por
consiguiente, se proporciona de acuerdo con la presente invención
un proceso de producción de productos de la proteína adhesiva del
mejillón a partir del pie del mejillón. El proceso se caracteriza
por la extracción del pie del mejillón en una solución acuosa
débilmente ácida que contiene, 1-10 por ciento en
peso de ácido acético y 0.5-3 por ciento en peso de
ácido perclórico, en lo sucesivo las sustancias sólidas se eliminan
de la solución y las proteínas se precipitan adicionando sales
orgánicas o inorgánicas y la proteína precipitada entonces se
separa de la solución.
De acuerdo con la invención, las sales de
precipitación convenientes son cloruro de sodio, cloruro de potasio,
sulfato de amonio, acetato de amonio, sulfato de sodio, sulfato de
potasio en una concentración del 5-15 por ciento en
peso de la solución.
De acuerdo con la invención, las proteínas
separadas se vuelven a disolver convenientemente en ácido acético
diluido y el material no-disuelto luego se separa
del sistema. De acuerdo con la invención, el ácido perclórico se
adiciona convenientemente para volver a disolver y separar la
solución de proteínas para una precipitación selectiva de las
proteínas indeseables, después de esto el precipitado se separa del
sistema.
De acuerdo con la invención, es benéfico someter
la solución separada a diálisis en una solución de acético diluido,
con el fin de eliminar el ácido perclórico y el material de bajo
peso molecular. De acuerdo con la invención, la proteína adhesiva
del mejillón en solución se puede precipitar completamente
adicionando etanol, propanol o acetona, y luego separar del sistema
y opcionalmente volver a disolver en ácido acético diluido.
La invención también se relaciona con las
proteínas adhesivas del mejillón producidas de acuerdo con el
proceso anterior.
El proceso inventivo se realiza en el pie del
mejillón, que puede ser ultra congelado, el cual se adiciona a una
mezcla acuosa que contiene ácido acético en una concentración del
1-10%, preferiblemente en la región del 5%, y ácido
perclórico en una concentración del 0.5-3%,
preferiblemente en la región del 1.5%. La mezcla de extracción
luego se homogeniza en un mezclador por algunos minutos, después de
esto la suspensión se centrifuga a alta velocidad, por ejemplo a
una velocidad que produce 15,000 G por ejemplo.
La solución acuosa que contiene las proteínas
adhesivas del mejillón se colecta y las
MAP-proteínas se precipitan adicionando sales
inorgánicas, preferiblemente cloruro de sodio, en una concentración
alta. Es necesario que la concentración de estas sales orgánicas
sea alta, en la región del 10 por ciento en peso. En esta alta
concentración de la sal, las proteínas adhesivas del mejillón se
precipitaran mientras que la mayor parte de las otras, proteínas
sin-interés permanecen en solución. Las proteínas
adhesivas del mejillón también se disolverán a bajas
concentraciones. La precipitación química no se restringe solamente
al cloruro de sodio. El cloruro de potasio, sulfato de amonio,
sulfato de sodio, etc., se pueden utilizar alternativamente con este
fin. Después de un par de horas en refrigerador, se habrá formado
un precipitado que luego se elimina del sistema, convenientemente
mediante centrifugación a 5,000 G por ejemplo.
Estas MAP-precipitadas pueden
ser utilizadas directamente sin una purificación adicional en
algunos casos. En tales casos se pueden mezclar opcionalmente con
otras sustancias, por ejemplo colágeno, como un refuerzo y se
utilizan en heridas o similares, con lo cual el agua se aplica y la
MAP-proteína se unirá a si misma y a su
alrededor.
Sin embargo, la MAP-precipitada
se puede disolver alternativamente en 5% de ácido acético por
ejemplo, con lo cual ciertas proteínas indeseadas se precipitarán.
La mezcla entonces se puede centrifugar de esta manera para separar
el material no disuelto de esta, el cual luego se elimina del
sistema.
Adicionalmente, la mezcla-MAP se
puede purificar adicionando ácido perclórico a esta, con lo cual el
material indeseable disuelto se precipitará. El ácido perclórico,
que tiene una concentración en la región del 15%, preferiblemente
se adiciona lentamente a la mezcla y en una cantidad correspondiente
al 5-15% del volumen de la solución. La mezcla
luego se enfría por media hora y el precipitado se elimina,
convenientemente por centrifugación.
Un producto de la proteína adhesiva del mejillón
altamente puro se puede obtener, dializando luego la solución,
preferiblemente de dos a tres veces, en grandes volúmenes en ácido
acético débil, por ejemplo ácido acético al 3%, con lo cual el
indeseable ácido perclórico emigra fuera a través de la membrana de
diálisis junto con el material de bajo peso molecular. Estos
procesos de diálisis generalmente se conocen y no necesitan por
consecuencia ser descritos en detalle aquí. La diálisis resulta en
un producto de MAP que tiene una pureza del 90-97%
y una producción de 1-2 mg de proteína adhesiva del
mejillón por gramo de la materia prima, pie del mejillón.
La solución MAP acuosa tratada con ácido
perclórico también se puede purificar por la precipitación de la
proteína adhesiva del mejillón con la ayuda de la acetona en unas
condiciones ácidas, convenientemente durante la noche. El
precipitado se separa, preferiblemente por centrifugación, y luego
se disuelve en un pequeño volumen de ácido acético al 5%. Entonces
la proteína tendrá una pureza del 95-100%, mientras
la producción cae ligeramente en relación a la producción obtenida
por diálisis, a saber a 0.5-1 mg de la proteína
adhesiva del mejillón por gramo de la materia prima, pie del
mejillón.
Se puede obtener una pureza extrema combinando
los dos procesos de purificación utilizando diálisis y precipitación
con acetona.
De esta manera, la invención proporciona un
proceso de producción de las proteínas adhesivas del mejillón que
tienen diversos grados de pureza y que se adaptan a diferentes usos,
de una manera particularmente simple sin el uso de un gran número
de químicos innecesarios y de una manera simple y económica.
Claims (6)
1. Un proceso de producción proteínas adhesivas
polifenólicas a partir del pie del mejillón, caracterizado
por la extracción del pie del mejillón en una solución acuosa
débilmente ácida que contiene de 1-10% en peso de
ácido acético y 0.5 - 3 por ciento en peso de ácido perclórico, la
separación de las sustancias sólidas de las proteínas en dicha
solución acuosa, la precipitación de las proteínas en dicha solución
acuosa después de la eliminación de los sólidos adicionando su
sales inorgánicas u orgánicas, y la separación de dichas
proteínas.
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado en que las sales inorgánicas comprenden
cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de amonio, sulfato de
sodio, sulfato de potasio en una concentración del 5 al 15 por
ciento en peso de dicha solución.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, caracterizado por la redisolución de las proteínas
separadas en ácido acético diluido y después de esto la eliminación
del material no disuelto del sistema.
4. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
3, caracterizado por la adición de un ácido perclórico a la
solución de proteínas separadas y re-disueltas de
esta manera para precipitar selectivamente las proteínas
indeseadas, y luego por la separación del precipitado del
sistema.
5. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
4, caracterizado por el sometimiento de la solución separada
a una diálisis en una solución de ácido acético diluido y de esta
manera eliminar el ácido perclórico y el material de bajo peso
molecular del sistema.
6. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 4-5, caracterizadas por la
adición de etanol, propanol o acetona a la solución para precipitar
las proteínas polifenólicas de esta, la separación de dichas
proteínas polifenólicas del sistema y opcionalmente la redisolución
de dichas proteínas en ácido acético diluido.
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