CN115487355B

CN115487355B - 一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法及应用

Info

Publication number: CN115487355B
Application number: CN202211209835.9A
Authority: CN
Inventors: 陈西广; 秦迪; 程晓杰; 孔明; 刘雅; 冯超
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2023-09-22
Anticipated expiration: 2042-09-30
Also published as: CN115487355A

Abstract

本发明涉及一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法及应用，属于生物医用材料和组织工程领域。本发明的鱼鳞基质骨修复材料的制备方法中，选用鱼鳞为原料，进行清洗除杂、脱细胞、碱处理剂和有机酸处理剂分别处理；在超声波辅助下进行脱胶原处理，得到保留鱼鳞天然各向异性微纳米结构的鱼鳞基质骨修复材料。本发明制备所得的鱼鳞基质骨修复材料保留了其天然各向异性微观结构，可用于引导细胞定向迁移生长和分化，不仅原料易得、理化性能和生物相容性优异，而且其表面具有微图案化的优势，可明显加速骨组织工程中的骨缺损修复再生，具有良好的临床应用前景。

Description

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医用材料和组织工程领域，具体涉及一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法及应用。

背景技术

天然细胞外基质(ECM)在骨、皮肤、血管及肌肉等组织中具有多种微纳米特性；其结构排列在纳米或微尺度上呈现高度各向异性的形貌。细胞外基质自组装形成的三维网络结构微环境，通过粘着斑的分布重组肌动蛋白丝来改变细胞的骨架和细胞核，为触发和调节细胞行为提供了关键的化学和物理线索。仿生ECM的三维微观结构化，能更好模拟细胞在机体内的生存环境，调控细胞行为并形成仿生结构。此外，通过调整微观结构特征可增强细胞沿沟槽方向的定向迁移，并可通过微观结构的密度、微纳米尺度以及机械信号调节干细胞或者成骨细胞的成骨分化，从而控制贴壁细胞的局部黏附行为和核形变化，利于骨祖细胞从缺损边缘沿着微观结构向骨损伤部位定向迁移，加速骨再生。因此，随着组织工程的不断发展，调控细胞微观结构化越来越受到重视，有望得以广泛应用。

目前，光蚀刻、软蚀刻、纳米压印、微接触印刷、静电纺丝或激光加工等微加工技术已被用于创建微/纳米图案来模拟天然ECM的结构特征，为模拟自然生理微环境、促进细胞间相互作用、组织工程和高通量药物筛选等研究提供了有力的工具。这些人工技术具有定位精度和微观结构一致性，确保了图案的微/纳米结构的保真度。尽管这些技术可构建更接近天然的ECM，但存在成本高、操作步骤复杂、设备昂贵和需要专业的操作人员等缺陷；此外，天然材料结构复杂、稳定性差、不易提纯以及人工合成材料的合成复杂耗时、反应条件苛刻或残留有毒有害试剂，极大限制了实际应用。因此，迫切需要寻找价格低廉、制备简便、来源广泛、生物相容性好的新材料。

鱼鳞是覆盖在表皮真皮层上的矿化板，主要由I型胶原和羟基磷灰石组成。目前，我国每年渔业加工中产生的鱼类垃圾高达720万吨，占鱼体总重的30％～50％，其中5％左右是鱼鳞，大部分作为废物丢弃，造成了严重的环境污染和极大的资源浪费。然而，鱼鳞作为一种天然新型生物材料，具有与人体硬组织相似的高度有序层次结构和组成，具有良好的生物相容性、降解性和优异的机械性能。鱼鳞表面分布着放射状鳞沟和环状磷脊结构类似于天然细胞外基质的微米拓扑结构，其通过调节细胞黏附并为胞内骨架组装提供重要的生物物理信号，明显影响细胞的粘附、增殖、迁移和分化等重要的细胞行为。这种天然的微观结构基质可以引导细胞沿着磷脊通道快速定向迁移，有利于快速修复组织缺损，促进受损组织或器官的修复。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法及应用，制备直接、简单、绿色、低成本且保留鱼鳞天然各向异性微纳米结构的鱼鳞基质，该鱼鳞基质以羟基磷灰石为主要成分，不但生物相容性良好、无免疫原性反应，而且其表面各向异性微纳米结构形貌通过引导细胞定向迁移生长促进软或硬组织修复再生，还解决了鱼鳞原料浪费和环境污染问题，有利于可持续发展和人类健康。

本发明的第一个目的在于，一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)新鲜鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂加入至反应器中，搅拌均匀，室温反应后，去离子水反复清洗鱼鳞至中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应后，去离子水反复清洗鱼鳞至中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；

5)将步骤4)所得混合物用双层纱布过滤，所得的滤渣置于烘箱中干燥；随后，酒精杀菌，紫外线辐照，浸泡于含胎牛血清的磷酸盐缓冲液，最后得到鱼鳞基质骨修复材料。

进一步，所述的步骤1)中，脱细胞处理包括如下步骤：将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为0.5-5％Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)和质量浓度为1-5％SDS(十二烷基硫酸钠)的混合Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)低渗溶液(pH 7.4，10-100mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为0.5-5％Triton X-100和质量浓度为1-5％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH 7.4，0.5-1M)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(脱氧核糖核酸酶5μg/mL)和RNase(核糖核酸酶5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗。

再进一步，所述的步骤1)中，所选用的鱼鳞为罗非鱼鱼鳞、鲫鱼鱼鳞、鲤鱼鱼鳞、草鱼鱼鳞、鲢鱼鱼鳞、鲈鱼鱼鳞、鳙鱼鱼鳞、脆皖鱼鱼鳞中的一种。

进一步，所述的步骤2)中，所用的碱处理剂为氢氧化钙、氢氧化镁、氢氧化锶中的一种或几种。

再进一步，所述的步骤2)中，步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂的质量比为1:10-1:20，碱处理剂的质量浓度为20-40％，室温反应3-5小时。

通过碱处理剂处理，有效去除杂蛋白。

进一步，所述的步骤3)中，所用的有机酸处理剂为柠檬酸、苹果酸、醋酸、乳酸中的一种或几种。

再进一步，所述的步骤3)中，步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂的质量比为1:10-1:20，有机酸处理剂的质量浓度为5-15％，室温下反应1-2小时。

通过有机酸处理剂处理，有效增加孔隙率。

进一步，所述的步骤4)中，超声设备功率为800-1200瓦，反应温度为80-95℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为1-3小时。

超声辅助热水法过程中，边用超声波处理、边加热抽提，进行脱胶原处理，可充分去除胶原蛋白。

进一步，所述的步骤5)中，于60℃烘箱中干燥48小时，使用75％酒精杀菌30分钟，紫外线辐照12小时，37℃环境中浸泡于含体积比为5-20％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)48小时，紫外线辐照12小时后的鱼鳞基质与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5。

本发明的第二个目的在于，提供一种鱼鳞基质骨修复材料，采用上述制备方法制备得到。

本发明的第三个目的在于，提供一种上述鱼鳞基质骨修复材料在组织工程中的骨、骨软骨、牙(颌)骨等口腔骨、颞下颌关节缺损修复领域的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供的制备方法中，对新鲜鱼鳞进行脱细胞和脱胶原处理，获得的鱼鳞基质保留了其天然各向异性微观结构及主要的I型胶原和羟基磷灰石成分，具有良好的机械性能、优异的生物相容性、细胞亲和性、引导细胞定向迁移生长和诱导成骨分化的能力；

(2)本发明提供的制备方法制备出了保留鱼鳞天然各向异性微图案形貌并通过引导细胞定向迁移促进骨再生的鱼鳞基质，由于其微米拓扑结构，可更好模拟细胞在机体内的三维生存微环境，通过微观结构特征提供的物理信号，增强细胞沿沟槽方向的定向迁移以及细胞的粘附、增殖、迁移和分化等细胞行为；

(3)本发明制备的鱼鳞基质所选用的原材料来源于非哺乳类动物，避免了跨物种病毒感染以及人畜共患病的风险；并将其作为骨填充材料应用于骨组织修复，显示出良好的生物相容性以及促进骨组织缺损再生和修复的能力，具有很好的医用价值；

(4)本发明也为水产加工废弃物的鱼鳞提供了一种充分利用的策略，减少了环境污染和资源浪费。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备鱼鳞基质骨修复材料微观结构的扫描电镜照片；

图2为本发明实施例4所制备的鱼鳞基质骨修复材料引导小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)定向迁移扫描电镜照片；

图3为本发明实施例2所制备的鱼鳞基质骨修复材料对大鼠股骨缺损修复的micro-CT分析结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围，具体实施方式中所述的份为重量份。

实施例1

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)取1份新鲜海鲈鱼鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理，将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为0.5％Triton X-100和质量浓度为5％SDS的混合Tris-HCl低渗溶液(pH 7.4，10mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为0.5％Triton X-100和质量浓度为5％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH7.4，1M)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(5μg/mL)和RNase(5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂按质量比1：10加入至反应器中，搅拌均匀，室温下搅拌反应3小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；其中，碱处理剂是质量浓度为40％的氢氧化钙溶液；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂按质量比1：10加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应1.5小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；其中，有机酸处理剂是质量浓度为15％的乳酸溶液；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；其中，超声设备功率为800瓦，反应温度为95℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为2小时；

5)将步骤4)所得混合物用双层纱布过滤，所得的滤渣置于60℃烘箱中干燥48小时；随后，75％酒精浸泡杀菌30分钟，并紫外线辐照12小时杀菌，37℃环境中浸泡于含体积比为20％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)48小时，其中，紫外线辐照12小时杀菌后的鱼鳞基质与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5，最后得到鱼鳞基质骨修复材料。

实施例2

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)取1份新鲜海鲈鱼鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理，将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为2％Triton X-100和质量浓度为3％SDS的混合Tris-HCl低渗溶液(pH 7.4，20mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为2％Triton X-100和质量浓度为3％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH 7.4，800mM)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(5μg/mL)和RNase(5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂按质量比1：20加入至反应器中，搅拌均匀，室温下搅拌反应5小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；其中，碱处理剂是质量浓度为20％的氢氧化镁溶液；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂按质量比1：15加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应2小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；其中，有机酸处理剂是质量浓度为10％的柠檬酸溶液；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；其中，超声设备功率为1200瓦，反应温度为80℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为1小时；

5)将步骤4)所得混合物用双层纱布过滤，所得的滤渣置于60℃烘箱中干燥48小时；随后，75％酒精浸泡杀菌30分钟，并紫外线辐照12小时杀菌，37℃环境中浸泡于含体积比为5％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)48小时，其中，紫外线辐照12小时杀菌后的鱼鳞基质与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5，最后得到鱼鳞基质骨修复材料。

实施例3

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)取1份新鲜海鲈鱼鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理，将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为5％Triton X-100和质量浓度为1％SDS的混合Tris-HCl低渗溶液(pH 7.4，100mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为1％Triton X-100和质量浓度为3％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH 7.4，500mM)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(5μg/mL)和RNase(5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂按质量比1：15加入至反应器中，搅拌均匀，室温下搅拌反应4小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；其中，碱处理剂是质量浓度为30％的氢氧化锶溶液；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂按质量比1：20加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应1小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；其中，有机酸处理剂是质量浓度为5％的醋酸溶液；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；其中，超声设备功率为1000瓦，反应温度为90℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为3小时；

5)将步骤4)所得混合物用双层纱布过滤，所得的滤渣置于60℃烘箱中干燥48小时；随后，75％酒精浸泡杀菌30分钟，并紫外线辐照12小时杀菌，37℃环境中浸泡于含体积比为10％胎牛血清的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH 7.4)48小时，其中，紫外线辐照12小时杀菌后的鱼鳞基质与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5，最后得到鱼鳞基质骨修复材料。

实施例4

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)取1份新鲜海鲈鱼鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理，将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为1％Triton X-100和质量浓度为2％SDS的混合Tris-HCl低渗溶液(pH 7.4，10mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为1％Triton X-100和质量浓度为2％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH 7.4，500mM)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(5μg/mL)和RNase(5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂按质量比1：15加入至反应器中，搅拌均匀，室温下搅拌反应5小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；其中，碱处理剂是质量浓度为20％的氢氧化钙溶液；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂按质量比1：15加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应2小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；其中，有机酸处理剂是质量浓度为10％的醋酸溶液；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；其中，超声设备功率为800瓦，反应温度为90℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为1小时；

实施例5

一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，包括如下步骤：

1)取1份新鲜海鲈鱼鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理，将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为2％Triton X-100和质量浓度为3％SDS的混合Tris-HCl低渗溶液(pH 7.4，50mM)中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为2％Triton X-100和质量浓度为3％SDS的混合Tris-HCl高渗溶液(pH 7.4，1M)继续搅拌24小时；清洗后，在磷酸盐缓冲溶液(0.01M，pH 7.4)中用DNase(5μg/mL)和RNase(5μg/mL)于37℃消化5小时，再进行清洗后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2)将步骤1)所得干燥鱼鳞与碱处理剂按质量比1：10加入至反应器中，搅拌均匀，室温下搅拌反应3小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；其中，碱处理剂是质量浓度为40％的氢氧化镁溶液；

3)将步骤2)所得中性鱼鳞与有机酸处理剂按质量比1：10加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应1小时后，去离子水反复清洗鱼鳞至pH值为中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；其中，有机酸处理剂是质量浓度为5％的柠檬酸溶液；

4)采用超声辅助热水法，将装有步骤3)所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；其中，超声设备功率为1200瓦，反应温度为95℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为2小时；

为了进一步说明本发明的技术方案，下面通过应用实验对本发明的有益效果作进一步的说明。

实验1材料微观结构表征

本实验对实施例1所制备的保留天然微观结构并引导细胞定向迁移生长的鱼鳞基质骨修复材料进行了微观结构表征。

图1为本发明实施例1所制备鱼鳞基质骨修复材料微观结构的扫描电镜照片。从图1中可以看出，所制备的鱼鳞基质骨修复材料表面的微图案结构形貌清晰、规则，且无明显的损坏。

实验2细胞相容性及引导细胞定向迁移评价

图2为本发明实施例4所制备的鱼鳞基质骨修复材料引导小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)定向迁移扫描电镜照片，其中，对照组是在实施例4所制备的、微图案结构形貌被破坏的鱼鳞基质骨修复材料接种的MC3T3-E1细胞。从图2中可以看出，细胞接种于实施例4所制备的鱼鳞基质骨修复材料表面3天，细胞沿着鱼鳞表面微图案鳞脊沟槽伸展生长，并形成伪足和胞间连丝，细胞形态呈现沿着沟槽生长的长梭形；此外，随着培养时间的延展，细胞沿着沟槽生长、增殖；第7天，细胞相互堆叠形成胞外基质，并填满鱼鳞基质骨修复材料表面微图案的沟槽。这表明制备的鱼鳞基质骨修复材料不但具有良好的生物相容性，并且其表面保留的天然微图案鳞脊沟槽可引导细胞定向迁移形成细胞外基质。

实验3大鼠股骨缺损修复功能评价

图3为本发明实施例2所制备的鱼鳞基质骨修复材料对大鼠股骨缺损修复的micro-CT分析结果图，其中，模型组为未覆盖实施例2所制备的鱼鳞基质骨修复材料的大鼠股骨缺损。micro-CT扫描三维重建结果显示，手术后3周，鱼鳞基质骨修复材料覆盖的大鼠股骨缺损区域出现新生骨，而模型组未见明显骨再生；在第6周鱼鳞基质骨修复材料覆盖组股骨缺损几乎完全修复，而模型组仍存在大面积缺损区域。

通过上述实施例和实验可以看到，本发明对新鲜鱼鳞进行除杂、脱细胞、碱/酸处理、脱胶原处理，得到一种鱼鳞基质骨修复材料。该鱼鳞基质骨修复材料不仅原料易得、理化性能和生物相容性优异，而且其表面具有微图案化的优势，能够明显促进骨组织工程中的骨缺损修复再生，具有很好的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种鱼鳞基质骨修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1) 新鲜鱼鳞去除油脂、鱼银杂质后，用蒸馏水反复彻底清洗，随后，将清洗后的鱼鳞进行脱细胞处理后，自然风干，得干燥鱼鳞；

2) 将步骤1）所得干燥鱼鳞与碱处理剂加入至反应器中，搅拌均匀，室温反应后，去离子水反复清洗鱼鳞至中性，沥干，得碱处理后的中性鱼鳞；

3) 将步骤2）所得中性鱼鳞与有机酸处理剂加入至反应器中，搅拌均匀，于室温下继续反应后，去离子水反复清洗鱼鳞至中性，沥干，得酸处理后的中性鱼鳞；

4) 采用超声辅助热水法，将装有步骤3）所得中性鱼鳞和去离子水的容器放置于预热至反应温度的超声辅助设备反应器内，边用超声波处理边加热，进行脱胶原处理；

5) 将步骤4）所得混合物用双层纱布过滤，所得的滤渣置于烘箱中干燥；随后，酒精杀菌，紫外线辐照，浸泡于含胎牛血清的磷酸盐缓冲液，最后得到鱼鳞基质骨修复材料；

其中，所述的步骤1) 中，脱细胞处理包括如下步骤：将清洗后的鱼鳞浸泡于含有质量浓度为0.5-5 % Triton X-100和质量浓度为1-5 % SDS的浓度为10-100 mM、pH 7.4的混合Tris-HCl低渗溶液中搅拌24小时，之后替换为含有质量浓度为0.5-5 % Triton X-100和质量浓度为1-5 % SDS的浓度为0.5-1 M、pH 7.4的混合Tris-HCl高渗溶液继续搅拌24小时；清洗后，在浓度为0.01 M、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中用5 μg/mL DNase和5 μg/mL RNase于37℃消化5小时，再进行清洗；

所述的步骤2) 中，所用的碱处理剂为氢氧化钙溶液、氢氧化镁溶液、氢氧化锶溶液中的一种或几种；

所述的步骤3) 中，所用的有机酸处理剂为柠檬酸溶液、苹果酸溶液、醋酸溶液、乳酸溶液中的一种或几种；

所述的步骤4) 中，超声设备功率为800-1200瓦，反应温度为80-95℃，每隔10分钟超声一次，每次超声时间为20分钟，反应时间为1-3小时。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤2) 中，步骤1）所得干燥鱼鳞与碱处理剂的质量比为1:10-1:20，碱处理剂的质量浓度为20-40%，室温反应3-5小时。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤3) 中，步骤2）所得中性鱼鳞与有机酸处理剂的质量比为1:10-1:20，有机酸处理剂的质量浓度为5-15%，室温下反应1-2小时。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤5) 中，于60℃烘箱中干燥48小时，使用75%酒精杀菌30分钟，紫外线辐照12小时，37℃环境中浸泡于含体积比为5-20%胎牛血清的浓度为0.01M、pH 7.4的磷酸盐缓冲液48小时，紫外线辐照12小时后的鱼鳞基质与磷酸盐缓冲液的质量比为1:5。

5.一种鱼鳞基质骨修复材料，其特征在于，采用如权利要求1~4任一项所述的制备方法制备得到。

6.一种如权利要求5所述的鱼鳞基质骨修复材料在制备组织工程中的骨缺损修复材料领域的应用。