CN103272283B - 一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法。包括采用计算机断层扫描技术分别对预期修复的骨组织和经脱钙处理的骨组织经行扫描,获得骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到其负型。利用三维快速成型技术制得三维多孔支架的石蜡负型。选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液,将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上,加入发酵培养基培养6~14d。发酵产物经石蜡脱除、纯化、矿化处理得到矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。本发明工艺简单,操作方便,可制备具有复杂形状的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架,制备的三维多孔支架可应用于骨组织工程领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物支架材料的制备加工技术领域。特别涉及一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法的制备方法。
背景技术
多年来骨组织修复技术主要采用自体或异体骨移植的方式,然而自体骨移植受自身供体数量限制,异体骨移植存在抗原性问题且来源短缺。随着组织工程技术的发展,为骨组织修复提供了新的途径。骨组织工程是以骨组织修复支架为载体,结合有成骨能力的种子细胞、生长因子,通过体内或体外培养构建骨组织。在这一过程中骨组织修复支架材料具有重要作用,它为细胞、组织的重建提供了必要的三维空间和力学支持,起到模拟细胞外基质的作用。具有良好的组织相容性;适合的孔径和孔隙率,利于细胞的增殖和黏附,以及营养物质的渗入和细胞代谢产物的排出。因此需要骨组织修复支架材料具有优良的生物材料性质,且能够具有与正常骨组织相符的宏观形貌和微观结构。
细菌纤维素(Bacterial Cellulose,BC)具有优良的理化性能,目前已成为材料科学尤其是生物材料研究的热点。BC已经被用作人工皮肤、人工血管。BC的生物相容性非常好,在组织工程支架构建方面具有潜在价值,它的纤维结构和组成骨头的胶原纤维在形态学方面是一致的,这种微纤维表面修饰能以类似于骨组织增长过程的方式诱导晶体形成。这种优良的性质使得BC具有作为骨组织工程支架的潜能。羟基磷灰石是一种磷酸钙生物陶瓷,是骨修复材料中的重要一类,其与人体骨骼的晶体成分和结构基本一致。羟基磷灰石的生物相容性、界面生物活性均优于各类医用钛合金、硅橡胶及植骨用碳素材料,并有极好的骨传导性、骨结合能力,且无毒副、致癌作用,所以被广泛用作硬组织修复材料和骨填充材料的生理支架。因此,细菌纤维素与羟基磷灰石复合将是一种优良的骨组织修复材料。目前已有研究将细菌纤维素与羟基磷灰石复合应用于骨组织修复。但这些研究大都局限在材料性能以及纳米级形貌的控制,很少涉及其与正常骨组织相符的宏观形貌和微观结构的制备。
本发明采用计算机断层扫描技术、三维快速成型技术、菌株/石蜡混合发酵技术以及细菌纤维素矿化技术,制备了一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。在制备过程中通过菌株与石蜡负型混合发酵制备三维多孔骨组织修复支架,该支架具有与正常骨组织相符的宏观形貌和微观结构。通过矿化处理,得到羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在细菌纤维素三维网络结构内部。制备的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架具有良好的力学强度、结构稳定性和成骨性能,高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高,有利于成骨细胞进入支架内部黏附、增殖,同时方便蛋白质等营养成分通过。该方法制备的三维多孔支架可应用于骨组织工程领域修复骨组织缺损和骨组织再生的治疗性植入物。
发明内容
本发明公开了一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法。涉及一种支架材料的制备加工技术领域。本发明工艺简单,操作方便,制备的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架具有良好的力学强度、结构稳定性和成骨性能,高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高,有利于成骨细胞进入支架内部黏附、增殖,同时方便蛋白质等营养成分通过。该方法制备的三维多孔支架可应用于骨组织工程领域修复骨组织缺损和骨组织再生的治疗性植入物。
本发明公开了一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法。包括:
(1) 采用计算机断层扫描技术分别对预期修复的骨组织和经脱钙处理的骨组织经行扫描,获得预期修复的骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到骨组织三维负型数字模型。
(2) 利用三维快速成型技术,采用三维快速打印机,以石蜡粉末作为成型材料,制得骨组织三维多孔支架的石蜡负型。
(3) 选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液,然后将种子醪液均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上,加入发酵培养基培养。发酵产物经石蜡脱除、纯化处理,得到细菌纤维素三维多孔支架。
(4) 将细菌纤维素三维多孔支架浸泡在CaCl2溶液中,经去离子水清洗后浸泡在Na2HPO4溶液中,然后经去离子水清洗、冷冻干燥,得到细菌纤维素与羟基磷灰石复合的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。
作为优选的技术方案:
其中,如上所述的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,所述的预期修复的骨组织为:缺损部位骨组织和/或与缺损部位相似、相对应的骨组织部位。所述的经脱钙处理的骨组织:选取与预期修复骨组织具有相似部位、相似形状和/或相似骨密度的脱钙骨。在本发明中,对预期修复的骨组织进行扫描,经过计算机处理(如镜像处理、比例缩放等)可以得到所需修复的骨组织的宏观形貌。对经脱钙处理的骨组织进行扫描,经计算机处理可以得到所需修复的骨组织的微观结构。将宏观形貌与微观结构的数字信息进一步处理,获得预期修复的骨组织三维多孔结构的数字模型,该数字模型具有与预修复的正常骨组织相符的宏观形貌和微观结构。
如上所述的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
如上所述的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的菌株/石蜡混合发酵方法为:将菌株浓度为50~95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上,10~20min后加入发酵培养基,发酵培养温度为20~30℃,时间为6~14d。
如上所述的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的石蜡脱除、纯化处理方法为:在50~70℃的温度下,发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5-10min,然后在70~100℃的温度下,在重量百分比为1~8%的NaOH水溶液中洗涤4-6h,再用蒸馏水反复冲洗至中性。以除去石蜡、细菌纤维素上的菌体蛋白和粘附在纤维素膜上的残余培养基。
如上所述的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的CaCl2与Na2HPO4溶液浓度:其中CaCl2溶液为50-100mmol/L,且Ca离子与PO4离子的摩尔当量比为5:3。所述的浸泡温度为20~25℃,时间为24-48h。上述这一过程是细菌纤维素矿化的方法,其中Ca离子与PO4离子的摩尔比例是得到羟基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2]的关键。在这一过程中,细菌纤维素上大量的羟基基团促进了Ca离子的沉积,以细菌纤维素的纤维素纳米纤维为模板,CaCl2与Na2HPO4溶液相互反应,最终得到的羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在细菌纤维素三维网络结构内部。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:采用计算机断层扫描技术、三维快速成型技术、菌株/石蜡混合发酵技术以及细菌纤维素矿化技术,制备了一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。在制备过程中通过菌株与石蜡负型混合发酵制备三维多孔骨组织修复支架,该支架具有与正常骨组织相符的宏观形貌和微观结构。通过矿化处理,得到羟基磷灰石颗粒均匀镶嵌在细菌纤维素三维网络结构内部。制备的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架具有良好的力学强度、结构稳定性和成骨性能,高孔隙率并且孔隙的相互贯通程度高,有利于成骨细胞进入支架内部黏附、增殖,同时方便蛋白质等营养成分通过。该方法制备的三维多孔支架可应用于骨组织工程领域修复骨组织缺损和骨组织再生的治疗性植入物。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1:以颅骨修复为例,制备矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架:
1) 采用计算机断层扫描技术分别对患者颅骨组织和与颅骨组织具有相似骨密度的脱钙骨经行扫描,获得颅骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到颅骨组织三维负型数字模型。
2) 将三维负型的数字模型数据导入三维快速打印机中,利用三维快速成型技术,以石蜡粉末作为成型材料,制得颅骨组织三维多孔支架的石蜡负型。
3) 选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌,将菌株活化制备成种子醪液,将菌株浓度为50%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上,10min后加入发酵培养基,发酵培养温度为30℃,时间为6d。发酵产物在50℃下,分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡10min。然后在重量百分比为8%的NaOH水溶液中,在70℃的温度下加热4h,再用蒸馏水反复冲洗至中性,得到细菌纤维素三维多孔支架。
4) 将细菌纤维素三维多孔支架浸泡在50mmol/L的CaCl2溶液中,浸泡温度为20℃,时间为48h。经去离子水清洗后浸泡在30mmol/L的Na2HPO4溶液中(Ca离子与PO4离子的摩尔当量比为5:3),浸泡温度为20℃,时间为48h。然后经去离子水清洗、冷冻干燥,得到细菌纤维素与羟基磷灰石复合的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。该支架材料可用于修复颅骨组织缺损。
实施例2:以趾骨修复为例,制备矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架:
1) 采用计算机断层扫描技术对患者左手趾骨组织(患者右手趾骨缺损)经行扫描,经计算机镜像处理,得到右手趾骨的宏观相貌数字模型。采用计算机断层扫描技术对与趾骨组织具有相似骨密度的脱钙骨经行扫描,得到微观结构数字模型。经计算机模拟获得趾骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到趾骨组织三维负型数字模型。
2) 将三维负型的数字模型数据导入三维快速打印机中,利用三维快速成型技术,以石蜡粉末作为成型材料,制得趾骨组织三维多孔支架的石蜡负型。
3) 选取能分泌细菌纤维素的假单胞菌属,将菌株活化制备成种子醪液,将菌株浓度为95%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上,20min后加入发酵培养基,发酵培养温度为20℃,时间为14d。发酵产物在70℃下,分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5min。然后在重量百分比为1%的NaOH水溶液中,在100℃的温度下加热6h,再用蒸馏水反复冲洗至中性,得到细菌纤维素三维多孔支架。
3) 将细菌纤维素三维多孔支架浸泡在100mmol/L的CaCl2溶液中,浸泡温度为25℃,时间为24h。经去离子水清洗后浸泡在60mmol/L的Na2HPO4溶液中(Ca离子与PO4离子的摩尔当量比为5:3),浸泡温度为25℃,时间为24h。然后经去离子水清洗、冷冻干燥,得到细菌纤维素与羟基磷灰石复合的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。该支架材料可用于修复趾骨组织缺损。
实施例3:以股骨修复为例,制备小颗粒状矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架作为骨组织再生的治疗性植入物。
1) 采用计算机断层扫描技术对与股骨组织具有相似骨密度,且直径为1cm,高3cm的脱钙骨经行扫描,获得骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到骨组织三维负型数字模型。
2) 将三维负型的数字模型数据导入三维快速打印机中,利用三维快速成型技术,以石蜡粉末作为成型材料,制得骨组织三维多孔支架的石蜡负型。
3) 选取能分泌细菌纤维素的产碱菌属,将菌株活化制备成种子醪液,将菌株浓度为75%的种子醪液以点阵方式均匀滴加在石蜡负型上,15min后加入发酵培养基,发酵培养温度为25℃,时间为12d。发酵产物在60℃下,分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡10min。然后在重量百分比为6%的NaOH水溶液中,在90℃的温度下加热5h,再用蒸馏水反复冲洗至中性,得到细菌纤维素三维多孔支架。
4) 将细菌纤维素三维多孔支架浸泡在75mmol/L的CaCl2溶液中,浸泡温度为20℃,时间为36h。经去离子水清洗后浸泡在45mmol/L的Na2HPO4溶液中(Ca离子与PO4离子的摩尔当量比为5:3),浸泡温度为20℃,时间为36h。然后经去离子水清洗、冷冻干燥,得到细菌纤维素与羟基磷灰石复合的圆柱颗粒状矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架。该支架材料作为股骨组织再生的治疗性植入物。
Claims (3)
1.一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:
(1)采用计算机断层扫描技术分别对预期修复的骨组织和经脱钙处理的骨组织经行扫描,获得预期修复的骨组织三维多孔结构的数字模型,通过布尔运算得到骨组织三维负型数字模型;
(2)利用三维快速成型技术,采用三维快速打印机,以石蜡粉末作为成型材料,制得骨组织三维多孔支架的石蜡负型;
(3)选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成菌株浓度为50~90%的种子醪液,然后将种子醪液以点阵方式均匀滴加在经灭菌处理的石蜡负型上,加入发酵培养基培养,发酵培养温度为20~30℃,时间为6~14d,发酵产物经石蜡脱除、纯化处理,在50~70℃的温度下,发酵产物分别在蒸馏水、异丙醇和无水乙醇中浸泡5-10min,然后在70~100℃的温度下,在重量百分比为1~8%的NaOH水溶液中洗涤4-6h,再用蒸馏水反复冲洗至中性得到细菌纤维素三维多孔支架;
(4)将细菌纤维素三维多孔支架浸泡在浓度为50-100mmol/L的CaCl2溶液中,经去离子水清洗后浸泡在Na2HPO4溶液中,然后经去离子水清洗、冷冻干燥,得到细菌纤维素与羟基磷灰石复合的矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架, Ca离子与PO4离子的摩尔当量比为5:3,浸泡温度为20~25℃,时间为24-48h。
2.如权利要求1的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的预期修复的骨组织为:缺损部位骨组织和/或与缺损部位相似、相对应的骨组织部位,所述的经脱钙处理的骨组织:选取与预期修复骨组织具有相似部位、相似形状和/或相似骨密度的脱钙骨。
3.如权利要求1的一种矿化细菌纤维素三维多孔骨组织修复支架的制备方法,其特征是:所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。
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