CN115054734A

CN115054734A - 一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法

Info

Publication number: CN115054734A
Application number: CN202210792324.8A
Authority: CN
Inventors: 李明明; 郭刚; 李明
Original assignee: Nuoymeier Shandong Medical Technology Co ltd
Current assignee: Nuoymeier Shandong Medical Technology Co ltd
Priority date: 2022-07-05
Filing date: 2022-07-05
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2042-07-05
Also published as: CN115054734B

Abstract

本发明涉及一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法，所述支架的材料为羧基改性壳聚糖接枝多肽/天然生物骨复合材料，该复合材料具有三维多孔交联结构，羧基改性壳聚糖的C₂位保留氨基、C₅位具有羧基、且取代度大于1；制备如下：在酶催化剂的作用下将多肽接枝在羧基改性壳聚糖上，透析纯化，冷冻干燥后得到羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉；然后将羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉溶于水，加入天然生物骨粉形成分散液，然后逐滴加入交联剂于常温下进行交联反应获得复合材料水凝胶，冷冻成型，脱模后辐照灭菌即可获得可塑性复合骨修复支架。本发明支架能够有效促进骨修复，基本三个月的时间能够达到骨缺损完全愈合。

Description

一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法。

背景技术

由于疾病、老龄化、交通事故频发等因素的影响，骨损伤病例逐年增加，骨替代材料的需求不断增加。随着组织工程技术的发展，构建修复骨缺损的支架材料成为了研究热点。

现有技术中主要有传统骨粉、纯矿化的无机骨粉或微改性骨粉以及改良型骨粉。传统的骨粉产品，大多属纯矿化无机产品，虽然基本可以起到修复骨缺损的作用，却不利于细胞的粘附和增殖，且纯矿化无机骨粉长期存于体内，其降解速率难以匹配成骨速率。改良型骨粉，往往只是在骨粉表面复合有机材料，虽然一定程度上可以改善细胞粘附和增殖，却由于技术步骤多，生产工艺复杂，操作难度大，有些添加的有机物甚至无法降解且生物相容性差，容易引发炎症和免疫反应，造成生物安全性无法满足使用要求大量。纯矿化无机骨粉或微改性的骨粉易分散，使用时靠自然堆积构建空间结构，颗粒易分散，难塑形，空间易坍塌，其在孔隙率和力学性能上不能同时满足实际临床的需求。以上这些种类的骨粉在诱导骨细胞趋化和促进骨细胞生长方面，都表现得能力有限，且新生骨组织生长慢，骨愈合困难，患者康复期较长等缺点，难以满足现代医学对骨再生修复材料的更高技术需求。

发明内容

为了解决现有骨粉难塑形且对促进骨细胞生长方面能力不足的技术问题，而提供一种可塑性复合骨修复支架及其制备方法。本发明的复合骨修复支架能在植入后保持一定时间的形状，可塑性较好，且能够在较短时间内促进骨细胞生长，缩短骨愈合期。

为了达到以上目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种可塑性复合骨修复支架，所述支架的材料为羧基改性壳聚糖接枝多肽/天然生物骨复合材料，所述复合材料具有三维多孔交联结构；

所述复合材料中的羧基改性壳聚糖的分子结构如下：

其中R为至少一个亚甲基，所述亚甲基为直链结构或者具有支链的结构，所述羧基改性壳聚糖的取代度大于1。

进一步地，所述羧基改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖进行碱化处理后加入醇类溶剂和卤代有机羧酸，搅拌均匀后微波处理，冷却、过滤得到粗品，采用乙醇反复洗涤多次；将粗品溶于水中抽滤去除未反应的所述壳聚糖后对所得滤液采用无水乙醇进行沉淀，过滤得到沉淀物，不超过60℃下干燥后即制得所述羧基改性壳聚糖，即分子结构中保留了C₂位的氨基，且在C₅位上改性获得羧基。

再进一步地，所述碱化处理是在所述壳聚糖中加入40～50wt％的NaOH溶液、相转移催化剂，在-18～-22℃的冰箱中处理8h～12h后滤去NaOH溶液；所述微波处理采用波长1mm～1m、频率为0.3GHz～300GHz的电磁波进行处理20～60min。

再进一步地，所述壳聚糖的脱乙酰度≥85％、分子量9300～30万，壳聚糖的脱乙酰度越大，其抑菌性越强，生物相容性越好，壳聚糖的分子量在9300～30万时，其抗菌性最强；所述相转移催化剂为十二烷基苯磺酸钠(C₁₈H₂₉NaO₃S)、四丁基溴化铵(C₁₆H₃₆BrN)、甲苯磺酸(C₆H₆O₃S)、DMSO(C₂H₆OS)中的一种或其多种；所述醇类溶剂为异丙醇；所述卤代有机羧酸为氯乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、2-氯丁酸、3-氯丁酸、4-氯丁酸中的一种。

再进一步地，所述壳聚糖、所述NaOH溶液的质量比为1:(3-5)，所述相转移催化剂的用量为所述壳聚糖的4-6wt％；所述壳聚糖、所述卤代有机羧酸的质量比为1:(5-8)；所述壳聚糖与所述醇类溶剂中的质量体积比为1g:(10～50)mL。

上述可塑性复合骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将羧基改性壳聚糖溶于水中形成A溶液；分别将多肽、酶催化剂溶于缓冲液中形成B溶液、C溶液；

所述酶催化剂是专一催化所述羧基改性壳聚糖的游离氨基与所述多肽的游离羧基进行反应形成酰胺键的酶；

(2)持续搅拌下，将所述B溶液和所述C溶液加入到所述A溶液中，在小于60℃下进行催化接枝反应，待所述催化接枝反应完全后，置于沸水浴中使所述酶催化剂失活，自然冷却后，抽滤收集滤液，调节所述滤液的pH值为中性，然后对其透析纯化，冷冻干燥后得到羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉；

(3)持续搅拌下，将所述羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉溶于水中，加入天然生物骨粉形成分散液，然后逐滴加入交联剂于常温下进行交联反应获得羧基改性壳聚糖接枝多肽/天然生物骨复合材料水凝胶；

(4)然后置于模具中进行冷冻成型，脱模后辐照灭菌即可获得可塑性复合骨修复支架。

进一步地，所述多肽为RGD、RGDS、RGE-NH₂、RGDS-NH₂中的一种；所述缓冲液为PBS缓冲液；

所述酶催化剂包括但不限于转谷氨酰胺酶、门冬酰胺酶及β-内酰胺酶等的一种或多种；

所述天然生物骨粉采用哺乳动物的离体肱骨组织制取，粒径100-500μm；

所述交联剂为无细胞毒性的交联剂，优选为EDC/NHS的DMSO(二甲基亚砜)溶液。

进一步地，所述持续搅拌的速度为80-120rpm；所述催化接枝反应的温度为40-55℃、时间为1-2h；所述交联反应的温度为20-30℃、时间为12-24h；

所述透析纯化采用醋酸纤维素膜、在pH＝7.2～7.4的HEPES缓冲液中进行透析纯化3天；

所述冷冻成型的过程是先在-20～-18℃预冻1～3h后移至冻干机中-50～-15℃下冻干成型18～24h；

所述辐照灭菌的灭菌剂量为15～40kGy。

进一步地，所述A溶液的质量浓度为1-2.5％，所述B溶液的质量浓度为1-2.5％，所述C溶液的质量浓度为0.1-0.25％，所述羧基改性壳聚糖、所述多肽、所述酶催化剂的质量比为1:1:0.1。

进一步地，所述羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉、所述天然生物骨粉、所述水、所述交联剂的质量比为1:1:(5-8):(3-5)。

有益技术效果：

本发明的可塑性骨修复支架由天然生物骨与负载细胞粘附分子的天然聚合物构成。其中天然生物骨可释放对机体无害的钙、磷离子，参与体内代谢，能有效促进缺损组织的修复，引导骨再生。负载细胞粘附分子的天然聚合物为具有一定抗压强度的多孔材料，在稳定血凝块的同时，可以为细胞提供3D微环境，以增强细胞黏附、增值、迁移、分化，发挥极强的骨诱导功能。本发明的可塑性复合骨修复支架，制备方法简单，支架形状大小可随缺损空间大小进行个性化修剪，在体内实现梯度降解吸收，无需二次手术取出，有效促进骨细胞的增殖分化，生物安全性高，有效解决了无机骨粉或微改性骨粉难塑性，空间结构易坍塌，降解速率与成骨速率不匹配，骨诱导、传导性及细胞的粘附和增殖不能同时实现，生物安全性无法保证等问题。

附图说明

图1为实施例4天然生物骨高温处理后的SEM图。

图2为实施例5可塑性复合骨修复支架的SEM图。

图3为实施例5可塑性复合骨修复支架的体外降解试验图，其中a、b、c分别表示1周时的形态、1个月时的形态以及2个月时的形态。

图4为实施例5-7以及对比例1的支架进行促细胞增殖试验的细胞相对活性的对比图。

图5为实施例5可塑性复合骨修复支架与对照组支架用于动物试验一个月、三个月、六个月的骨修复细胞HE染色图，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、分别表示一个月、三个月、六个月，①表示实施例5，②表示对照组。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值不限制本发明的范围。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法应当被视为说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。

以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定；若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、或相关企业提出的标准要求进行。除非另有说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。

实施例1

本实施例为羧基改性壳聚糖的制备，其结构为：

制备方法为：取壳聚糖1g(脱乙酰度85％、分子量15万)、依次加入浓度50wt％的NaOH溶液3.0g、四丁基溴化铵0.04g，在-20℃的冰箱中进行碱化处理10h，滤去NaOH溶液，加异丙醇30mL和氯乙酸5.0g，搅拌均匀，微波处理25min时间，冷却至室温，过滤得粗品；用70wt％乙醇反复将粗品清洗，将洗净后的粗品溶于去离子水中，抽滤去除未反应的壳聚糖，对所得滤液采用无水乙醇进行沉淀，过滤得到沉淀物，50-60℃下干燥后即制得上述结构的羧基改性壳聚糖，即分子结构中保留了C₂位的氨基(C₂位的氨基对壳聚糖的抗菌性至关重要，因此保留壳聚糖的C₂位的氨基)，且在C₅位上改性获得羧基。

采用电位滴定法进行检测羧基的取代度，计算本实施例的羧基改性壳聚糖的取代度为1.32。

实施例2

本实施例的羧基改性壳聚糖的分子结构与实施例1相同，其制备方法为：

取壳聚糖1g(脱乙酰度85％、分子量15万)、依次加入40wt％NaOH溶液4.0g、四丁基溴化铵0.05g，在-20℃的冰箱中进行碱化处理10h，滤去NaOH溶液，加异丙醇40mL和氯乙酸6.0g，搅拌均匀，微波处理30min，冷却至室温，过滤得粗品；用70wt％乙醇反复将粗品清洗，将洗净后的粗品溶于去离子水中，抽滤去除未反应的壳聚糖，对所得滤液采用无水乙醇进行沉淀，过滤得到沉淀物，50-60℃下干燥后即制得上述结构的羧基改性壳聚糖，即分子结构中保留了C₂位的氨基(C₂位的氨基对壳聚糖的抗菌性至关重要，因此保留壳聚糖的C₂位的氨基)，且在C₅位上改性获得羧基。

采用电位滴定法进行检测羧基的取代度，计算本实施例的羧基改性壳聚糖的取代度为1.16。

实施例3

本实施例的羧基改性壳聚糖的分子结构与实施例1相同，制备方法如下：

取壳聚糖1g(脱乙酰度85％、分子量15万)、依次加入40wt％NaOH溶液5.0g、四丁基溴化铵0.06g，在-20℃的冰箱中进行碱化处理10h，滤去NaOH溶液，加异丙醇50mL和氯乙酸7.0g，搅拌均匀，微波处理35min，冷却至室温，过滤得粗品；用70wt％乙醇反复将粗品清洗，将洗净后的粗品溶于去离子水中，抽滤去除未反应的壳聚糖，对所得滤液采用无水乙醇进行沉淀，过滤得到沉淀物，50-60℃下干燥后即制得上述结构的羧基改性壳聚糖，即分子结构中保留了C₂位的氨基，且在C₅位上改性获得羧基。

采用电位滴定法进行检测羧基的取代度，计算本实施例的羧基改性壳聚糖的取代度为1.01。

实施例4

天然生物骨粉制备：

S1取哺乳动物的离体肱骨组织，去离子水进行充分清洗；其中哺乳动物的离体肱骨组织可取自羊、猪、牛等动物。

S2采用物理分离的方法去掉皮质骨及有机附着物质，切成(0.5～5)cm×(3～15)cm骨条，去离子水充分冲洗干净；

S3将上述预处理后的骨条，采用脂肪提取剂在100～250℃下浸提骨条上附着的脂类有机物，再采用蛋白提取剂于150～350℃下浸提骨条上附着的蛋白类有机物；其中脂肪提取剂可为低沸点有机溶剂，优选乙醚、石油醚、丙酮、苯、甲醇等；其中蛋白提取剂可为碱性有机试剂，优选苯胺、三乙醇胺、四丁基溴化铵等；

S4在300～500℃高温处理8～10h，高温处理后的天然生物骨的SEM图如图1所示，可见其具有多孔结构；

S5粉碎至粒径100～500μm，即得天然生物骨粉。

实施例5

一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将取1重量份的实施例1的羧基改性壳聚糖(取代度1.32)溶于50重量份去离子水中形成A溶液；分别将1重量份的RGD、0.1重量份的转谷氨酰胺酶催化剂溶于50重量份PBS缓冲液中形成B溶液、C溶液；

(2)100rpm的速度持续搅拌下，将所述B溶液和所述C溶液加入到所述A溶液中，在55℃下进行催化接枝反应(酶催化剂催化所述羧基改性壳聚糖的游离氨基与RGD多肽的游离羧基进行反应)1h，待所述催化接枝反应完全后，置于沸水浴中10min使酶催化剂失活，自然冷却后，抽滤收集滤液，用10wt％NaOH溶液调节所述滤液的pH值为中性，然后将所述滤液进行透析纯化，采用醋酸纤维素膜、在pH＝7.2～7.4的HEPES缓冲液中进行透析纯化3天，然后冷冻干燥得到羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉；

(3)100rpm的速度持续搅拌下，将1重量份所述羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉溶于6重量份去离子水中，加入实施例4的1重量份天然生物骨粉形成分散液，然后逐滴加入4重量份交联剂(EDC/NHS的DMSO溶液，在DMF中加入EDC盐酸盐、NHS，调pH4-6先活化7小时后使用)于25℃下进行交联反应20h获得羧基改性壳聚糖接枝RGD/天然生物骨复合材料水凝胶；

(4)然后将上述水凝胶置于模具中，于-20℃预冻1h，再移至冻干机中-45℃进行冷冻成型20h，脱模，辐照灭菌即可获得可塑性复合骨修复支架。

对本实施例最终产物复合骨修复支架进行SEM观察，结构如图2所示，由图2可知，可塑性复合骨修复支架由许多大孔相连，具有高度多孔三维结构，该结构可以为骨组织缺损处的再生提供微环境，且这些大孔之间的互连允许在整个结构体中进行物质运输和细胞迁移，同时可增强细胞的附着、为细胞增殖提供有效空间，同时发挥骨修复支架的诱导性和传导性。

实施例6

一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将取1重量份的实施例2的羧基改性壳聚糖(取代度1.16)溶于50重量份去离子水中形成A溶液；分别将1重量份的RGD、0.1重量份的转谷氨酰胺酶催化剂溶于50重量份PBS缓冲液中形成B溶液、C溶液；

(2)120rpm的速度持续搅拌下，将所述B溶液和所述C溶液加入到所述A溶液中，在50℃下进行催化接枝反应(酶催化剂催化所述羧基改性壳聚糖的游离氨基与RGD多肽的游离羧基进行反应)1.5h，待所述催化接枝反应完全后，置于沸水浴中15min使酶催化剂失活，自然冷却后，抽滤收集滤液，用10wt％NaOH溶液调节所述滤液的pH值为中性，然后将所述滤液进行透析纯化，采用醋酸纤维素膜、在pH＝7.2～7.4的HEPES缓冲液中进行透析纯化3天，然后冷冻干燥得到羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉；

(3)120rpm的速度持续搅拌下，将1重量份所述羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉溶于6重量份去离子水中，加入实施例4的1重量份天然生物骨粉形成分散液，然后逐滴加入4重量份交联剂(EDC/NHS的DMSO溶液，在DMF中加入EDC盐酸盐、NHS，调pH4-6先活化7小时后使用)于23℃下进行交联反应24h获得羧基改性壳聚糖接枝RGD/天然生物骨复合材料水凝胶；

(4)然后将上述水凝胶置于模具中，于-18℃预冻3h，再移至冻干机中-30℃进行冷冻成型24h，脱模，辐照灭菌即可获得可塑性复合骨修复支架。

对本实施例最终产物复合骨修复支架进行SEM观察，本对比例产物结构同样具有高度多孔三维结构。

实施例7

一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，包括如下步骤：

(1)将取1重量份的实施例3的羧基改性壳聚糖(取代度1.01)溶于50重量份去离子水中形成A溶液；分别将1重量份的RGD、0.1重量份的转谷氨酰胺酶催化剂溶于50重量份PBS缓冲液中形成B溶液、C溶液；

(2)80rpm的速度持续搅拌下，将所述B溶液和所述C溶液加入到所述A溶液中，在45℃下进行催化接枝反应(酶催化剂催化所述羧基改性壳聚糖的游离氨基与RGD多肽的游离羧基进行反应)2h，待所述催化接枝反应完全后，置于沸水浴中20min使酶催化剂失活，自然冷却后，抽滤收集滤液，用10wt％NaOH溶液调节所述滤液的pH值为中性，然后将所述滤液进行透析纯化，采用醋酸纤维素膜、在pH＝7.2～7.4的HEPES缓冲液中进行透析纯化3天，然后冷冻干燥得到羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉；

(3)80rpm的速度持续搅拌下，将1重量份所述羧基改性壳聚糖接枝RGD冻干粉溶于6重量份去离子水中，加入实施例4的1重量份天然生物骨粉形成分散液，然后逐滴加入4重量份交联剂(EDC/NHS的DMSO溶液，在DMF中加入EDC盐酸盐、NHS，调pH4-6先活化7小时后使用)于30℃下进行交联反应18h获得羧基改性壳聚糖接枝RGD/天然生物骨复合材料水凝胶；

(4)然后将上述水凝胶置于模具中，于-20℃预冻2h，再移至冻干机中-30℃进行冷冻成型18h，脱模，辐照灭菌即可获得可塑性复合骨修复支架。

对比例1

本对比例的支架制备与实施例1相同，不同之处在于：步骤(2)未进行接枝，而只是将羧基改性壳聚糖与RGD进行共混。

对比例2

本对比例的产物为壳聚糖冻干海绵：将壳聚糖溶于2.5％的醋酸水溶液中，NaOH调节pH，至成凝胶状态，于-18℃～-20℃预冻1～3h，移至冻干机中-50～-15℃冻干18～24h进行冷冻成型。

对以上实施例4-7以及对比例1-2的产物进行性能测试。

以上实施例4-7以及对比例1-2的产物的物理性能表征见表1。

表1实施例4-7以及对比例1-2的产物的物理性能数据

由表1可知，本发明的可塑性复合骨修复支架具有较强的抗压强度，可以保证裁剪成所需的形状，且在植入后在一定的时间内仍可保持其形状，为营养物质的传送和细胞的附着提供时间上的保证，充分发挥其可塑性。

对实施例4-7以及对比例1-2的支架进行体外降解试验，体外降解试验过程：将配制好的Sorensen缓冲液(pH＝7.4)240mL平均装入24个烧杯中，每个容器放1个支架，置于37℃±1℃的二氧化碳培养箱中，每7d换一次缓冲液以保持pH恒定，分别在1周、1月、2月时取3个样品进行肉眼观察及检测质量计算降解率(弃掉多余的缓冲液，电热鼓风干燥箱中干燥至恒重)，降解率数据见表2。

表2体外降解1周、1月、2月时支架的降解率

由表2可知，本发明实施例5-7的支架体外降解1周基本不超过10％的降解率，1个月基本达到50％以上降解率，2个月达到60％以上降解率。其中实施例5支架的体外降解试验实物图见图3，图3的a、b、c分别表示1周时的形态、1个月时的形态以及2个月时的形态，由图3可见本发明支架呈现梯度降解过程。以上体外模拟主要可以使试验人员了解本发明支架的降解周期情况。将本发明支架应用于试验兔股骨内，1个月时壳聚糖类多糖部分开始降解，此时体内环境下大部分已诱导成骨细胞进入支架的孔隙，血供已基本形成；2个月后，多糖类基本降解完成，此时无机支架已不仅仅靠堆积维持形态，成骨细胞已连接堆积孔隙空间基本成型，同时无机孔隙之间有许多交叉的血供，为成骨细胞修复骨缺损提供营养物质。这与实施例8的体内植入试验结果相辅相成。

对实施例5-7以及对比例1的支架进行促细胞的增殖试验，试验方法：在1640培养基中加入10％的胎牛血清，接种L929成纤维细胞后置于培养箱中培养；传代3次后，将细胞接种于96孔板上，每孔约5000个细胞，用100μL培养基培养24h；更换培养基，加入已灭菌不同取代度的复合骨修复支架0.01g，培养24h；用DPBS清洗两次后，更换新鲜培养基，加入10μL MTT溶液，避光反应；4h后加入100μL Formazan溶解液，适当混匀，在细胞培养箱37℃内再继续孵育4h，570nm测定吸光度，观察细胞相对存活率，具体数据见表3以及图4。

表3实施例5-7以及对比例1的支架对细胞的存活性能的影响

	细胞相对存活率(％)
		实施例5	106.2
实施例6	100.4
		实施例7	99.6
对比例1	94.8

由表3和图4可知，具有高取代度的复合骨修复支架更能促进细胞的黏附和增殖。

实施例8

依据《医疗器械动物实验研究技术审查指导原则》和GB/T 16886《医疗器械生物学评价》系列标准设计动物实验：

步骤1、选择新西兰兔作为骨缺损动物模型，本试验设置术后第1、3、6个月为观察时间终点。

步骤2、实验动物耳缘静脉注射麻醉剂，股骨部位备皮，固定于手术台。

步骤3、术区碘伏消毒、酒精脱碘，铺无菌洞巾。切开皮肤、皮下组织暴露术区，使用医用骨钻在股骨髁部位造成直径6mm、深约8～10mm的缺损，生理盐水冲洗骨碎屑组织等，止血并冲洗伤口。

步骤4、实验组将实施例5的可塑性骨修复支架修剪后填充于缺损处，对照组为假手术组。

步骤5、填充完成后缝合切口皮肤，消毒伤口。

步骤6、HE染色(苏木精—伊红染色法)后切片观察实施例5支架的降解及骨修复作用。

具体HE染色结果见图5。

实施例5的可塑性复合骨修复支架与对照组(假手术组)用于动物试验1个月、三个月、六个月的骨修复细胞HE染色图如图5所示。由图5可知：一个月时(I)，实验组①的骨缺损处可见骨小梁密度高、以及具有大量有活性的成骨细胞及血管内皮细胞；而对照组②的骨小梁密度低、可见大量纤维组织及炎性细胞。三个月时(II)，实验组①的骨缺损处可见骨连接，编织骨形成，板层骨可见，说明3个月时骨缺损基本达到愈合，与下表4的愈合时间基本吻合；对照组①的新生骨表面可见纤维结缔组织增生，炎性细胞聚集，未见缺损处编织骨出现。六个月时(III)，实验组①的骨缺损处骨连接已形成，可见板层骨；对照组②的骨缺损处未见连接，可见有活性的新骨聚集，编织骨出现。

表4实施例4-7以及对比例1-2的产物的动物试验结果

由表4可知，本发明的支架可促进骨修复，骨完全愈合时间在100±10天范围内，而对比例1的多肽共混支架虽然在一定程度上对细胞具有较好的粘附和增殖作用，但是应用于动物试验其对骨完全愈合时间达到了150天，时间较久。

综上所述，本发明的可塑性骨修复支架由天然生物骨与负载细胞粘附分子的天然聚合物构成。其中天然生物骨可释放对机体无害的钙、磷离子，参与体内代谢，能有效促进缺损组织的修复，引导骨再生。负载细胞粘附分子的天然聚合物为具有一定抗压强度的多孔材料，在稳定血凝块的同时，可以为细胞提供3D微环境，以增强细胞黏附、增值、迁移、分化，发挥极强的骨诱导功能。本发明的可塑性复合骨修复支架可有效促进骨细胞的增殖分化，生物安全性高，降解速率与成骨速率较为匹配，骨诱导、传导性及细胞的粘附和增殖可同时实现。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种可塑性复合骨修复支架，其特征在于，所述支架的材料为羧基改性壳聚糖接枝多肽/天然生物骨复合材料，所述复合材料具有三维多孔交联结构；

所述复合材料中的羧基改性壳聚糖的分子结构如下：

2.根据权利要求1所述的一种可塑性复合骨修复支架，其特征在于，所述羧基改性壳聚糖的制备方法为：将壳聚糖进行碱化处理后加入醇类溶剂和卤代有机羧酸，搅拌均匀后微波处理，冷却、过滤得到粗品，采用乙醇反复洗涤多次；将粗品溶于水中抽滤去除未反应的所述壳聚糖后对所得滤液采用无水乙醇进行沉淀，过滤得到沉淀物，不超过60℃下干燥后即制得所述羧基改性壳聚糖，即分子结构中保留了C₂位的氨基，且在C₅位上改性获得羧基。

3.根据权利要求2所述的一种可塑性复合骨修复支架，其特征在于，所述碱化处理是在所述壳聚糖中加入40～50wt％的NaOH溶液、相转移催化剂，在-18～-22℃的冰箱中处理8h～12h后滤去NaOH溶液；所述微波处理采用波长1mm～1m、频率为0.3GHz～300GHz的电磁波进行处理20～60min。

4.根据权利要求2所述的一种可塑性复合骨修复支架，其特征在于，所述壳聚糖的脱乙酰度≥85％、分子量9300～30万；所述相转移催化剂为十二烷基苯磺酸钠、四丁基溴化铵、甲苯磺酸、DMSO中的一种或其多种；所述醇类溶剂为异丙醇；所述卤代有机羧酸为氯乙酸、2-氯丙酸、3-氯丙酸、2-氯丁酸、3-氯丁酸、4-氯丁酸中的一种。

5.根据权利要求2所述的一种可塑性复合骨修复支架，其特征在于，所述壳聚糖、所述NaOH溶液的质量比为1:(3-5)，所述相转移催化剂的用量为所述壳聚糖的4-6wt％；所述壳聚糖、所述卤代有机羧酸的质量比为1:(5-8)；所述壳聚糖与所述醇类溶剂中的质量体积比为1g:(10～50)mL。

6.根据权利要求1-5任一项所述的一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将羧基改性壳聚糖溶于水中形成A溶液；

分别将多肽、酶催化剂溶于缓冲液中形成B溶液、C溶液；

7.根据权利要求6所述的一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述多肽为RGD、RGDS、RGE-NH₂、RGDS-NH₂中的一种；所述缓冲液为PBS缓冲液；

所述酶催化剂为转谷氨酰胺酶、门冬酰胺酶及β-内酰胺酶等的一种或多种；

所述交联剂为EDC/NHS的DMSO溶液。

8.根据权利要求6所述的一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述持续搅拌的速度为80-120rpm；所述催化接枝反应的温度为40-55℃、时间为1-2h；所述交联反应的温度为20-30℃、时间为12-24h；

所述冷冻成型的过程是先在-20～-18℃预冻1～3h后移至冻干机中-50～-15℃下冻干成型18～24h。

9.根据权利要求6所述的一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述A溶液的质量浓度为1-2.5％，所述B溶液的质量浓度为1-2.5％，所述C溶液的质量浓度为0.1-0.25％，所述羧基改性壳聚糖、所述多肽、所述酶催化剂的质量比为1:1:0.1。

10.根据权利要求6所述的一种可塑性复合骨修复支架的制备方法，其特征在于，所述羧基改性壳聚糖接枝多肽冻干粉、所述天然生物骨粉、所述水、所述交联剂的质量比为1:1:(5-8):(3-5)。