CN114392399B - 一种木葡聚糖防粘连膜及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种木葡聚糖防粘连膜及其制备方法，属于医用防粘连生物材料技术领域。本发明采用水/四氢呋喃/1,4‑二氧六环混合溶剂将木葡聚糖溶解后进行冻干，然后再采用戊二醛溶液交联，再次冻干后制得木葡聚糖防粘连膜。本发明的木葡聚糖防粘连膜具有良好的微观结构、力学性能和吸液能力，该膜材料在创伤部位能够快速发生溶胀形成具有一定粘性的凝胶，既可以对伤口产生压迫有助于止血，又可以促进防粘连层贴附于伤口，有效阻止防粘连层的移位。同时不需要缝合，极大的改善了使用的方便性，在医用防粘连领域具有广阔的应用前景。

Description

一种木葡聚糖防粘连膜及其制备方法

技术领域

本发明属于医用防粘连生物材料技术领域，具体涉及一种木葡聚糖防粘连膜及其制备方法。

背景技术

木葡聚糖是从自然界广泛存在的豆科罗望子属植物罗望子的种子胚乳中提取分离出来的一种中性多糖。这种天然多糖的易得性、安全性、生物降解性以及生物相容性等优良性能被各行各业广泛关注，在食品、化工和化妆品等诸多领域的应用研究取得了重大进展，但是在防粘连材料领域的研究还比较匮乏。

目前国内防粘连产品主要有膜和凝胶两种类型，如：医用透明质酸钠凝胶为液体流动状，受患者体位变换的影响。医用几丁糖膜用于防粘连，需要在充分止血的条件下使用，此外由于原料来源为动物源，常伴有免疫原性反应，且体内降解时间较快，需要缝合使用。聚乳酸防粘连膜为化学合成材料，在体内降解过程中会产生乳酸，而引起机体的刺激反应，使用时需要缝合。一般市售的膜必须要在充分止血的条件下才可以使用，因此亟需一种既可以对伤口产生压迫有助于止血，又可以促进防粘连层贴附于伤口，有效阻止防粘连层的移位的新型防粘连膜。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种木葡聚糖防粘连膜及其制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种木葡聚糖防粘连膜的制备方法，步骤如下：

将木葡聚糖溶于水/四氢呋喃/1,4-二氧六环的混合溶剂中，室温下搅拌，配制成木葡聚糖溶液；将该溶液在-20℃冷冻24h，再在-60℃下冻干48h；冻干后的样品用戊二醛溶液交联；交联完成后用去离子水洗涤，除去未结合的戊二醛；随后将样品再次冷冻干燥，制得到木葡聚糖防粘连膜。

所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法中，所述水/四氢呋喃/1,4-二氧六环的混合溶剂中，水、四氢呋喃和1,4-二氧六环的体积比为93-95:4-5:1-2。

所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法中，所述木葡聚糖溶液的浓度为0.5-1.0％。

所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法中，所述戊二醛溶液的浓度为2-4wt％。

所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法中，所述戊二醛交联的时间为10-60min。

上述方法制备的木葡聚糖防粘连膜。

上述木葡聚糖防粘连膜在制备止血防粘连材料中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明使用的木葡聚糖原料是从自然界广泛存在的豆科罗望子属植物罗望子的种子胚乳中提取分离出来的一种天然多糖，属于一种植物源的多糖，规避掉动物源多糖的免疫原性、病毒传染性等，更加安全；

(2)本发明采用水/四氢呋喃/1,4-二氧六环溶剂将木葡聚糖溶解后进行冻干，制备膜的微观结构具有相互连通的孔隙和纤维。对其机械性能、吸水倍率、吸水速率等性能进行研究。结果表明，木葡聚糖防粘连膜具有良好的微观结构、力学性能和吸液能力，同时用交联剂进行交联，增强膜的力学性能，吸液后形成一种具有粘性的致密凝胶，可以作为一种优秀的防粘连材料。

(3)本发明制备的防粘连膜，由于该膜材料在创伤部位能够快速发生溶胀形成具有一定粘性的凝胶，既可以对伤口产生压迫有助于止血，又可以促进防粘连层贴附于伤口，有效阻止防粘连层的移位。同时不需要缝合，极大的改善了使用的方便性。可以在不充分止血的条件下进行有效的防粘连，在医用防粘连领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1不同方法制备的木葡聚糖防粘连膜的SEM图，从左到右依次为实施例1、实施例2、对比例1和对比例2；

图2 A549细胞在不同浓度实施例1所得膜浸提液中培育24h、48h后的AO/PI染色荧光照片，比例尺为200μm。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

以下实施例中采用的木葡聚糖均来源于酸角。

实施例1

一种木葡聚糖防粘连膜，由以下方法制备而成：

将0.5g木葡聚糖溶于100mL水/四氢呋喃/1,4-二氧六环的混合溶剂(V_水:V_四氢呋喃:V_{1,4-二氧六环}＝93:5:2)中，室温下搅拌2h，配制成0.5％的溶液。将溶液在-20℃的冰箱中冷冻24h，再在-60℃下冻干48h。冻干后的样品用4wt％的戊二醛溶液交联30min。用去离子水将样品洗涤3次，除去未结合的戊二醛溶液。随后将样品再次冷冻干燥，得到木葡聚糖防粘连膜。

实施例2

一种木葡聚糖防粘连膜，由以下方法制备而成：

将1g木葡聚糖溶于100mL水/四氢呋喃/1,4-二氧六环混合溶剂(V_水:V_四氢呋喃:V_{1,4-二氧六环}＝95:4:1)中，室温下搅拌6h，配制成1.0％的溶液。将溶液在-20℃的冰箱中冷冻24h，在-30℃下冻干48h。冻干后的样品用2wt％的戊二醛溶液交联60min。用去离子水将样品洗涤3次，除去未结合的戊二醛溶液。随后将样品再次冷冻干燥，得到木葡聚糖防粘连膜。

对比例1

一种木葡聚糖防粘连膜，由以下方法制备而成：

将0.5g木葡聚糖溶于100mL水/四氢呋喃混合溶剂(V_水:V_四氢呋喃:V_{1,4-二氧六环}＝90:10:0)中，室温下搅拌6h，配制成0.5％的溶液。将溶液在-20℃的冰箱中冷冻24h，在-60℃下冻干48h。冻干后的样品用4wt％的戊二醛溶液交联30min。用去离子水将样品洗涤3次，除去未结合的戊二醛溶液。随后将样品再次冷冻干燥，得到木葡聚糖防粘连膜。

对比例2

一种木葡聚糖防粘连膜，由以下方法制备而成：

将0.5g木葡聚糖溶于100mL水/1,4-二氧六环混合溶剂(V_水:V_四氢呋喃:V_{1,4-二氧六环}＝90:0:10)中，室温下搅拌6h，配制成0.5％的溶液。将溶液在-20℃的冰箱中冷冻24h，在-60℃下冻干48h。冻干后的样品用4wt％的戊二醛溶液交联30min。用去离子水将样品洗涤3次，除去未结合的戊二醛溶液。随后将样品再次冷冻干燥，得到木葡聚糖防粘连膜。

一、木葡聚糖防粘连膜的理化性能

1)拉伸强度测试：将实施例1-2和对比例1-2方法制备的木葡聚糖防粘连膜裁成50mm×12.5mm，采用材料试验机进行拉伸强度测定，材料试验机的移动速度为(50±5)mm/min，夹持间距为20mm。记录最大载荷kgf。

2)吸水倍率测试：分别称取实施例1-2和对比例1-2方法制备的木葡聚糖防粘连膜0.8g，置于洁净干燥的培养皿中，称重m₁，加入适量去离子水，待膜吸水饱和后，倒出多余水分，称重m₂，根据下列公式计算吸水率A。

A＝(m₂-m₁)/0.8

3)吸水速率测试：分别称取实施例1-2和对比例1-2方法制备的木葡聚糖防粘连膜0.2g，加入水，开始计时，直至样品完全吸水，记录时间(s)。

结果如表1所示。

表1木葡聚糖防粘连膜的理化性能

样品	拉伸强度(kgf)	吸水倍率(％)	吸水速率(s)
				实施例1	1.235	36.63	10
实施例2	1.352	26.65	12
				对比例1	0.523	8.18	60
对比例2	0.533	5.21	120

由表1可知，实施例1和实施例2方法制备的木葡聚糖防粘连膜具有较高的拉伸强度，且吸水倍率和吸水速率显著优于对比例1和对比例2方法制备的木葡聚糖防粘连膜，理化性能优异。

二、木葡聚糖防粘连膜的SEM测试

分别取实施例1-2和对比例1-2方法制备的木葡聚糖防粘连膜，表面真空镀金后进行扫描电镜测试，观察表面形貌，结果如图1所示。

由图1可见实施例1和实施例2的制备方法均能得到多孔结构的木葡聚糖防粘连膜，但是对比例1和对比例2所得到的木葡聚糖防粘连膜的孔隙率较低，从而也解释了其理化性能较差的原因。

三、木葡聚糖防粘连膜的防粘连效果

3.1大鼠腹壁-盲肠损伤粘连模型的建立

使用水合氯醛(10wt％)按3mL/kg剂量通过腹腔注射对大鼠实施麻醉，固定于实验手术台后于大鼠下腹部备皮，将经碘尔康消毒后的手术洞巾铺上。用手术刀沿腹白线做一个5cm正中切口，然后在腹白线位置剪开腹壁。找到盲肠并轻轻的使用手术刷轻缓磨擦直到浆膜层被破坏至有明显的点状渗血，但没有出现穿孔，受损区域约1×2cm²。在受损区域相对的左侧腹壁上用手术刀划出深度约1mm的1×2cm²大小的区域，之后使用眼科剪将该区域的浅层肌剥离，形成出血表面；之后用3-0缝合线将盲肠的肠系膜缝合固定于腹壁创面的右上角处，以保证腹壁和盲肠的创伤面相互之间能够充分接触，防止盲肠蠕动，确保粘连形成。A组注射生理盐水后，逐层关腹；B组将2×3cm大小的壳聚糖防粘连膜(烟台万利医用品有限公司，商品名：粘连停)置于腹壁创面，逐层关腹；C组将实施例2的所得2×3cm大小的木葡聚糖防粘连膜置于腹壁创面，逐层关腹。

所有操作均在无菌条件下进行。并且各组打开关闭腹腔5分钟，所以盲肠暴露于空气的时间是一样的。术后分笼标准喂养，术后一开始的三天每天肌肉注射头孢拉定预防感染。

3.2大体观察

术后1、2周每组各取8只大鼠，过量水合氯醛至死，沿原切口进腹，观察腹膜粘连情况。根据Nair五级分级标准，对腹膜粘连进行评价。0级：完全无粘连；I级：单个纤维粘连；II级单个或2个轻度粘连，粘连带宽<1cm；III级：重度粘连，2个以上粘连或1个粘连带宽>1cm；IV级：广泛或切口下粘连。实验采用双盲设计，打分者不参与手术。并定义0～1级为少量粘连，2～4级为大量粘连，结果如表2所示。

表2各组术后腹腔粘连程度分级(n＝8)

由表2中数据可见，实施例2所得木葡聚糖防粘连膜可有效预防大鼠腹壁-盲肠粘连，三组试验中，C组效果最好，粘连评分和粘连率都较低(0.1-0.3,10-20％)，与阳性对照组(3-4,100％)和商业对照组(2-3,100％)比较有统计学意义(P＜0.05)。所以本发明方法制备的木葡聚糖防粘连膜对预防大鼠腹壁-盲肠粘连具有一定的疗效。

四、木葡聚糖防粘连膜的毒性试验

在10mL含有10％FBS的DMEM培养基中，加入1g实施例1所得木葡聚糖防粘连膜，放置37℃孵育48h使膜浸提液和培养液充分混合，提取液(100％)，提取液稀释，得到浓度为75％和25％的溶液。取培养状态最好的A549细胞，将完全培养基用移液管全部吸出，之后经过无菌的磷酸盐缓冲液缓慢冲洗3次，冲洗干净后，吸入0.25％胰酶500μL移入培养瓶中与细胞发生反应，1～2min后，马上把培养皿倒置放在相差显微镜下开始察看。待贴壁的细胞紧缩、变小，并有部分细胞开始脱壁后，加入新的完全培养基终止胰酶消化作用，轻缓吹打匀后，便可制成单个细胞；并根据需要计算细胞个数，最终使细胞密度为1×10⁴cells/well，将配制好的细胞悬液转移至96孔板中，并放入37℃并且CO₂浓度为5％的培养箱中，培养12h使细胞完整贴壁。之后将培养液吸出，分别加入配制好的浓度不同的浸提液并以普通培养基作为对照，在培养箱中继续培养24h、48h。之后采用AO/PI对细胞染色，使用荧光显微镜对细胞活性进行定性分析，其中活细胞显绿色荧光，死细胞显红色荧光。

采用AO/PI染色法评价了不同浓度的膜浸提液对A549细胞活性的影响。经过24h和48h的培养后，使用AO/PI染色的荧光照片如图2所示，同一时间点的横向比较显示，在三种不同浓度的浸提液组中，绿色荧光强度比红色荧光明显，而且与使用正常培养基的对照组相比没有明显区别，说明所有浓度的膜浸提液均没有对细胞的活性造成影响。此外，纵向比较可以发现，在不同的时间点，随着培养时间的延长，各提取液中的细胞数也明显增加，而在同一时间，实验组细胞密度非常接近对照组，这表明木葡聚糖防粘连膜浸提液对细胞的增殖并没有影响。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种木葡聚糖防粘连膜的制备方法，其特征在于，步骤如下：

将木葡聚糖溶于水/四氢呋喃/1,4-二氧六环的混合溶剂中，室温下搅拌，配制成木葡聚糖溶液；将该溶液在-20℃冷冻24h，再在-60℃下冻干48h；冻干后的样品用戊二醛溶液交联；交联完成后用去离子水洗涤，除去未结合的戊二醛；随后将样品再次冷冻干燥，制得到木葡聚糖防粘连膜；

所述水/四氢呋喃/1,4-二氧六环的混合溶剂中，水、四氢呋喃和1,4-二氧六环的体积比为93-95:4-5:1-2。

2.根据权利要求1所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法，其特征在于，所述木葡聚糖溶液的浓度为0.5-1.0％。

3.根据权利要求1所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法，其特征在于，所述戊二醛溶液的浓度为2-4wt％。

4.根据权利要求1所述木葡聚糖防粘连膜的制备方法，其特征在于，所述戊二醛交联的时间为10-60min。

5.权利要求1-4任一项所述方法制备的木葡聚糖防粘连膜。

6.权利要求5所述木葡聚糖防粘连膜在制备止血防粘连材料中的应用。

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