JP6082633B2 - 多糖ナノゲルおよびその製造方法、ならびにそれを用いた創傷治癒剤 - Google Patents

Description

本発明は、多糖ナノゲルおよびその製造方法、ならびにそれを用いた創傷治癒剤に関し、より詳細には、安全性に優れた多糖ナノゲルおよびその製造方法、ならびにそれを用いた創傷治癒剤に関する。

水溶性多糖類の一部の水酸基を構成する水素原子が疎水性分子で置換した疎水化多糖が水中で疎水的相互作用により自己会合し、ナノサイズの会合体微粒子（ナノゲル）を形成することが報告されている（非特許文献１および２）。このナノゲルは様々なタンパク質・疎水性薬物と複合化することも明らかとなっており、特にタンパク質との相互作用において変性状態のタンパク質と選択的に複合化することも報告されている。また、ナノゲルに取り込まれたタンパク質をシクロデキストリン（ＣＤ）の疎水性分子包接能を利用した会合制御によりナノゲルから放出させ、リフォールディングさせ得ることも明らかとなっており（非特許文献３）、汎用性人工分子シャペロンシステムの研究が展開されている。さらには、ナノゲルのシャペロン機能を応用したタンパク質デリバリーシステムも開発されており、静注ワクチンキャリア（非特許文献４）や経鼻ワクチンキャリア（特許文献１および非特許文献５）への応用が進められている。

一方、高齢化社会の進行に伴い、寝たきりまたは介護が必要な高齢者は増加の一途をたどっている。医療および介護の現場で、寝たきりもしくは介護が必要な高齢者、または入院患者に特有の問題としては、床ずれなどが挙げられる。あるいは、がんまたは脳卒中により入院を余儀なくされた場合、その治療が成功した後の患者のＱＯＬ向上においては、床ずれなどの皮膚の創傷の予防および改善は重要な課題である。床ずれなどの創傷患部に細菌が感染した場合、患者の死に繋がることも多く、特に、免疫力が低下した高齢者にとって重要な課題である。また、たとえ健康であっても、加齢に伴い、皮膚が乾燥しやすくなり、それに伴う創傷も大きな問題である。

ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属に属する細菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は、腸管内の腸内細菌群の中で優勢を示す細菌の一つであり、その整腸作用および免疫調節作用が数多く報告されている。

一部のビフィズス菌は、菌体外に多糖類を産生することが報告されているが、その多くは、多糖の特徴的な構成成分および構造についての報告である（特許文献２）。ビフィズス菌が産生する多糖の機能については、免疫賦活効果（特許文献３）および抗アレルギー効果（特許文献４）に関する報告がある。

特開２０１０−１０５９６８号公報 国際公開第０７／００７５６２号 特開昭５８−２０３９１３号公報 特開２０１１−２０１７８１号公報

K. Akiyoshiら, Macromolecules, 1993年, 26巻, 3062-3068頁 K. Akiyoshiら, Macromolecules, 1997年, 30巻, 857-861頁 Y. Sasakiら, The Chemical Record, 2010年, 1巻, 366-376頁 A. Uenakaら, Cancer Immunity, 2007年, 7巻, 9頁 T. Nochiら, Nature Materials, 2010年, 9巻, 572-578頁

本発明は上記問題の解決を課題とするものであり、その目的とするところは、安全かつ増粘性に優れた、多糖ナノゲルおよびその製造方法を提供するとともに、高齢者や長期入院患者における創傷（床ずれ）の予防または改善のために、副作用の心配がなく、安全性を有し、かつ効率的に創傷患部を治癒することができる、創傷治癒剤を提供することにある。

本発明は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースからなるオリゴ糖単位の繰り返しにより構成され、かつピルビン酸で修飾されている多糖から構成され、
該多糖中の一部の水酸基を構成する水素原子が、
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；または
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
で置換されている、多糖ナノゲルである。

１つの実施態様では、上記オリゴ糖単位は、上記ラムノース１ｍｏｌに対して、それぞれ上記ガラクトースが３ｍｏｌから５ｍｏｌであり、かつ上記グルコースが１ｍｏｌから３ｍｏｌであるモル比で構成されている。

１つの実施態様では、上記オリゴ糖単位は、オリゴ糖単位１ｍｏｌあたり０．８ｍｏｌから１ｍｏｌの上記ピルビン酸で修飾されている。

１つの実施態様では、上記多糖の平均分子量は、５０，０００から１，０００，０００である。

１つの実施態様では、上記多糖は、以下の式（Ｉ）で表される構造：

（式（Ｉ）中、
Ｘ_１からＸ_２０は、それぞれ独立して、水素原子、コレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基で置換されたコレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基、および−ＣＯ−ＮＨ−Ｙからなる群から選択される基であり、
Ｙは、水素原子、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基、および−（ＣＨ_２）_ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ（ここで、ｐは０から２０の整数である）からなる群から選択される基であり、そして
Ｚは、水素原子、コレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基で置換されたコレステリル基、およびＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基からなる群から選択される基であり、
但し、Ｘ_１からＸ_２０のすべてが水素原子である場合を除く）を含む。

１つの実施態様では、上記多糖中の水酸基を構成する水素原子は、単糖１００残基内の総水酸基に対して、１個から１０個の割合で置換されている。

１つの実施態様では、上記多糖はビフィズス菌由来である。

さらなる実施態様では、上記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）由来である。

本発明はまた、上記多糖ナノゲルと、タンパク質またはペプチドとを含む、複合体である。

本発明はまた、多糖ナノゲルの製造方法であって、
（１）ビフィズス菌から、多糖を調製する工程、
（２）該多糖を有機溶媒に溶解する工程、
（３）工程（２）で溶解した多糖の一部の水酸基を構成する水素原子を、
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；または
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；で置換して、置換多糖を得る工程、および
（４）該置換多糖をゲル化する工程、を含む、方法である。

本発明はまた、多糖を有効成分として含有し、該多糖が、ガラクトース、グルコース、およびラムノースからなるオリゴ糖単位の繰り返しにより構成され、かつピルビン酸で修飾されている、創傷治癒剤である。

１つの実施態様では、上記オリゴ糖単位は、上記ラムノース１ｍｏｌに対して、それぞれ上記ガラクトースが３ｍｏｌから５ｍｏｌであり、かつ上記グルコースが１ｍｏｌから３ｍｏｌであるモル比で構成されている。

１つの実施態様では、上記オリゴ糖単位は、オリゴ糖単位１ｍｏｌあたり０．８ｍｏｌから１ｍｏｌの上記ピルビン酸で修飾されている。

１つの実施態様では、上記多糖の平均分子量は、５０，０００から１，０００，０００である。

１つの実施態様では、上記多糖はビフィズス菌由来である。

さらなる実施態様では、上記ビフィズス菌は、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）由来である。

１つの実施態様では、上記多糖中の一部の水酸基を構成する水素原子は
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；または
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
で置換されている。

１つの実施態様では、上記多糖中の水酸基を構成する水素原子は、単糖１００残基内の総水酸基に対して、１個から１０個の割合で置換されている。

１つの実施態様では、本発明の創傷治癒剤は外用剤として用いられる。

本発明によれば、安全かつ増粘性に優れた多糖ナノゲルを提供することができる。上記多糖ナノゲルは、ビフィズス菌産生多糖（以下、「ＢＰＳ」ともいう）と比較して、顕著な増粘効果を有し、さらにタンパク質またはペプチドを取り込み、該タンパク質またはペプチドと複合体を形成する効率が高い。よって、ＢＰＳの特性である保湿・保水性を損なわず、使用用途に合わせたゾル−ゲルマテリアルの設計が可能となる。

さらに本発明によれば、副作用の心配がなく、安全性を有し、かつ効率的に創傷患部を治癒する創傷治癒剤を提供することができる。上記創傷治癒剤は、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、坐剤などの種々の分野に利用することができる。

実施例１において、圧力下にて低分子化させたＢＰＳの重量平均分子量をSEC-MALLSを用いて測定した結果を示すグラフである。 実施例３において、ＢＰＳからＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０が合成されたことを、^１Ｈ−ＮＭＲ測定によって確認したことを示すチャートである。 実施例５において、超音波照射がＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０ナノゲルへ及ぼす影響を、動的光散乱（ＤＬＳ）測定の結果によって示したグラフである。 実施例６において、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１の増粘性を、マイクロレオロジーを用いて測定した結果を示すチャートである。 実施例６において、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０の増粘性を、マイクロレオロジーを用いて測定した示すチャートである。 実施例６において、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０溶液の増粘性を示した写真である。 実施例７において、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０ナノゲルとＦＩＴＣ−Ｉｎｓとの複合体量を、紫外可視分光光度計を用いて測定した結果を示すグラフである。 実施例８〜１０において、調製例１および実施例２で得られた各種ＢＰＳを塗布したマウスの創傷患部組織の経日変化を示す写真である。 実施例１１〜１３において、調製例１および実施例３で得られた各種ＢＰＳを塗布したマウスの創傷患部組織の経日変化を示す写真である。

以下、本発明を詳細に説明する。

（多糖）
本発明において用いられる多糖は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースからなるオリゴ糖単位の繰り返しにより構成され、かつピルビン酸で修飾されている、多糖である（以下、単に「多糖」という）。

上記オリゴ糖単位は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースの単糖同士が結合することによって形成される。

一つの実施態様では、上記オリゴ糖単位は、上記ラムノース１ｍｏｌに対して、それぞれ上記ガラクトースが３ｍｏｌ〜５ｍｏｌのモル比で構成されており、そして上記グルコースが１ｍｏｌ〜３ｍｏｌのモル比で構成されている。

上記オリゴ糖単位は、例えば０．８ｍｏｌ／オリゴ糖単位〜１ｍｏｌ／オリゴ糖単位、好ましくは０．８６ｍｏｌ／オリゴ糖単位〜０．９７ｍｏｌ／オリゴ糖単位にてピルビン酸で修飾されている、および／または上記多糖の総質量に対して、４質量％〜７質量％のピルビン酸が多糖を構成する単糖を修飾している。

上記多糖は、以下の式（ＩＩ）：

で表される繰り返しにより構成される構造を含む。式（ＩＩ）中のGalpはガラクトピラノースを表し、Glcpはグルコピラノースを表し、Rhapはラムノピラノースを表し、これらガラクトース、グルコース、およびラムノースでピラノース構造を構成する。

このような構造を有する多糖は、ビフィズス菌、すなわち、ビフィドバクテリウム属に属する微生物、好ましくはビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）によって培養液中に産生され得る。例えば、ヒトの腸内から単離されたビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）（以下、単に「ＪＢＬ０５株」ということがある）によって産生され得る。したがって、本明細書中では、便宜上、「多糖」のうち、このようなビフィズス菌により産生され得る多糖を「ＢＰＳ」（ビフィズス菌産生多糖）ともいうが、この表現によってＢＰＳを産生する微生物種またはその菌株を限定するものではない。

本発明においては、ビフィドバクテリウム属に属しかつＢＰＳを菌体外に産生する微生物もまた用いられる。「多糖を菌体外に産生する」とは、培養液中に多糖を分泌すること、あるいは微生物が細胞膜の周囲に夾膜状の多糖を産生することをいう。この様に多糖を菌体外に産生するビフィズス菌を、本明細書中では、便宜上、「菌体外多糖産生ビフィズス菌」ともいう。

本発明においては、ＢＰＳの調製のために用いられる微生物として、または菌体外多糖産生ビフィズス菌として、ＪＢＬ０５株を例示することができる。ＪＢＬ０５株の菌学的性質は以下の表１の通りである。

これらの表現形質による分類学的性質に基づき、ＪＢＬ０５株は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロジー（Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology）Vol.2（1984）に従ってビフィドバクテリウム・ロンガムであると同定された。そして、２００５年３月３日（原寄託日）に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８ 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）に寄託され、受託番号ＮＩＴＥ ＢＰ−８２が付与された。

多糖の調製のために、上記ＪＢＬ０５株を適切な培地で培養し得る。培養の手順を、以下の例示によって説明するが、この例示に限定されない。

培地としては、ビフィドバクテリウム属に属する微生物が利用できる炭素源および窒素源、ならびに、必要に応じて、システイン塩酸塩、アスコルビン酸ナトリウム、微量の無機塩などを含む培地が挙げられる。特に、多糖を多量に調製するためには、脱脂乳または乳成分を含む培地が好ましい。この場合、脱脂乳をプロテアーゼなどの酵素で分解した酵素分解脱脂乳に、魚肉エキス、ラクトース、アスコルビン酸ナトリウムなどを加えた培地が好ましく用いられ得る。

上記培地を用い、ＪＢＬ０５株を、培養温度、例えば２０〜４５℃にて、嫌気条件下、撹拌あるいは静置して、ｐＨを、例えば４〜７、好ましくは５〜６に制御しながら、例えば１２〜６０時間、好ましくは１５〜５０時間培養を行うことにより、培養液中に粘性物質（多糖）が産生され得る。

得られた培養液からの多糖の回収には、加熱、酵素処理、遠心、濾過、膜処理、濾別などの、当業者が通常、培養液から多糖を回収する方法が用いられる。例えば、多糖等の粘性物質および微生物菌体を含む培養液を遠心し、菌体を除去する。培養液の粘性が高い場合は、例えば、培養液を水で希釈した後、遠心することにより菌体を除去することができる。次いで、得られた上清に適切な有機溶媒を加えてタンパク質だけを析出させ、例えば遠心分離によって沈殿を除去し、さらに得られた上清にさらに有機溶媒を添加して多糖を沈殿させ、例えば遠心分離によって、多糖を回収する。詳細には、菌体を除去した培養上清に、終濃度が、例えば２０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行ってタンパク質を含む沈殿物を除去し、さらに得られた上清に終濃度が、例えば５０容量％となるようにエタノールを添加し、遠心分離を行って沈殿物を回収することにより、粗精製多糖を得ることができる。

あるいは、得られた培養液からの多糖の回収には、有機溶剤とカチオンとを組み合わせて多糖を回収する方法を用いられる。例えば、１価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法、２価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５８−５３０１号公報）、３価のカチオンと有機溶剤とを用いる回収方法（特開昭５９−１９６０９９号公報）などと同様の方法を用いられる。カチオンは、多糖の回収率を高める点から、好ましく用いられる。１価カチオンとしては、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどが挙げられる。２価カチオンとしては、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどが挙げられる。３価カチオンとしては、アルミニウムイオンなどが挙げられる。これらのカチオンをエタノールなどの有機溶剤とともに、多糖が含まれる粘性溶液に添加することにより、より多くの多糖を回収することができる。２価あるいは３価のカチオンは、１価のカチオンよりも多糖の回収率を高めることが可能である。

回収した粗精製多糖からの精製には、当業者が通常行う方法、例えば、イオン交換樹脂を用いる分画法、ゲル濾過による分画法、これらを組み合わせる方法が用いられる。イオン交換樹脂を用いる方法としては特に制限されず、例えば、陰イオン交換樹脂（例えば、商品名ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０（ファルマシア社）など）に多糖を吸着させ、塩化ナトリウムの濃度勾配にかけ多糖を溶出させる方法が挙げられる。ゲル濾過による方法としては、商品名ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ６５Ｓ（東ソー株式会社）などを用いる方法などが挙げられる。

多糖の構造は以下のような方法で決定される。まず、精製した多糖を、例えば、蟻酸、希塩酸、トリフルオロ酢酸などで酸加水分解し、この加水分解物をＨＰＬＣで分析することにより、多糖を構成する糖（単糖）が決定される。次いで、この酸加水分解物を、常法によりアセチル化し、ガスクロマトグラフィーで分析（ＧＣ分析）することにより、多糖を構成する糖組成（構成糖の比率）が求められる。さらに、精製した多糖を常法によりメチル化した後に酸加水分解し、この加水分解物を還元後アセチル化して得られる生成物をＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー／質量分析）などで分析することにより、多糖の結合様式（結合位置）が決定される。また、ＮＭＲ分析により、各単糖どうしの結合構造が明らかにされる。多糖に結合しているピルビン酸は、ＮＡＤＨ存在下、乳酸デヒドロゲナーゼによるピルビン酸還元により生じる乳酸を測定することにより、定性的かつ定量的に測定できる。

ＪＢＬ０５株は、以下の特徴を有する多糖を産生し得る：
（１）多糖は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースからなるオリゴ糖単位の繰り返しにより構成され、かつピルビン酸で修飾されている。
（２）上記オリゴ糖単位が、１オリゴ糖単位あたり０．８ｍｏｌ〜１ｍｏｌの上記ピルビン酸を含む、および／または上記多糖の総質量に対して、４〜７質量％の上記ピルビン酸を含む。
（３）平均分子量は、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ６５Ｓによるゲルろ過で約２００，０００〜２，５００，０００である。
（４）比旋光度は、約＋１３０°である。
（５）アセチル基を含有する。

なお、ＢＰＳの分子量は、培養条件および回収・精製条件により調整することが可能である。また、以下に詳述するが、ＢＰＳの分子量は、ＢＰＳを超音波処理または圧力下にて処理することにより調整することも可能である。

このようなＪＢＬ０５株が産生するＢＰＳは、例えば、以下の式（ＩＩ）：

で表される繰り返しにより構成される構造を含む。ここで、Galpはガラクトピラノースであり、Glcpはグルコピラノースであり、Rhapはラムノピラノースである。

このような構造を有する多糖は、ヒトの腸内から単離されたＪＢＬ０５株より産生され得るが、このような多糖の調製のためにＪＢＬ０５株以外の微生物を利用してもよい。そのような微生物としては、例えば、腸内細菌を分離・培養し、培養液中に多糖を産生することが判明した株の多糖を回収・精製し分析することにより、上記ビフィズス菌産生多糖の特徴を有するものであれば、本発明の多糖ナノゲルの製造に用いることができる。この際、多糖の回収および精製は、上記に準じて行われ得る。

菌体外多糖産生ビフィズス菌として、ＪＢＬ０５株が例示されるが、ビフィズス菌産生多糖を菌体外に産生する他のビフィズス菌もしくは他の微生物もまた本発明に用いられ得る。

（多糖の低分子化方法）
多糖を圧力で処理することなどによって、重量平均分子量（Ｍｗ）および／または数平均分子量（Ｍｎ）を低下させることができる（低分子化）。具体的には、多糖の低分子化方法は、（１）多糖を溶媒に溶解させる工程、および（２）工程（１）で溶解した多糖を圧力で処理することによって微粒化する工程を含む。

上記多糖を圧力で処理する方法としては、特に限定されない。例えば、多糖を超音波処理する、多糖を高圧で噴射し、多糖同士を超高速で斜向衝突させる（噴射衝突）、および／または多糖をセラミックスのボールへ衝突させる（ボール衝突）ことによって微粒化させる方法が挙げられる。

多糖の低分子化には、例えば市販の微粒化装置を用いてもよい。市販の微粒化装置として、湿式微粒化装置（Star Burst Mini、HJP-25001H、株式会社スギノマシン製）が挙げられるがこれに限定されるものではない。

上記（１）多糖を溶媒に溶解させる工程において、多糖を溶解させるために用いる溶媒は特に限定されないが、好ましくは水である。多糖を溶媒に溶解させる場合の溶解濃度は特に限定されないが、０．１Ｗ／Ｖ％〜１Ｗ／Ｖ％、好ましくは、０．４Ｗ／Ｖ％〜０．５Ｗ／Ｖ％である。また、上記溶媒にはナトリウム塩および／またはカリウム塩などの塩類が含まれていてもよい。

多糖を処理するための圧力は、例えば５０ＭＰａ〜３００ＭＰａ、好ましくは少なくとも２４５ＭＰａである。上記圧力で処理する回数（以後、「圧力処理回数」ともいう）（回）は、多糖が所望の分子量（重量平均分子量および／または数平均分子量）になるように適宜設定される。圧力が高い方が、多糖の平均分子量（Ｍｗ）はより小さくなる傾向にある。

低分子化したＢＰＳの平均分子量は、例えば、５０，０００〜１，０００，０００、好ましくは５０，０００〜３００，０００、より好ましくは５０，０００〜２００，０００、さらにより好ましくは５０，０００〜１００，０００である。ＢＰＳの平均分子量が小さくなると、ＢＰＳのゲル化濃度が低下する。

（多糖ナノゲルおよびその製造方法）
本発明において「多糖ナノゲル」とは、親水性多糖の一部の水酸基を構成する水素原子が、以下に詳述する疎水性の所定の置換基で置換された構造を有する疎水化多糖が、水中で疎水性相互作用により自己会合して形成したナノサイズの会合体微粒子（ナノゲル）ををいう。

多糖ナノゲルは、多糖の一部の水酸基を構成する水素原子が
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；または
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
で置換された多糖（置換多糖）から形成される。なお、置換多糖のうち、多糖の一部の水酸基を構成する水素原子が
コレステロール；
コレステロール誘導体；
ウレタン結合を介したコレステロール；または
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；
で置換された多糖を総じて「ＣＨ−ＢＰＳ」ということがある。一方、多糖の一部の水酸基を構成する水素原子が、
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合を介した水素；あるいは
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
で置換された多糖を総じて「Ｒ−ＢＰＳ」ということがある。

多糖中の水酸基を構成する水素原子の置換数は、平均分子量１００，０００の多糖中の水酸基を構成する水素原子が、単糖１００残基内の総水酸基に対して、例えば１〜１０個、好ましくは２個〜５個である。

置換多糖であるＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳを製造する方法は、（１）多糖を有機溶媒に溶解する工程、および（２）工程（１）で溶解した多糖の一部の水酸基を構成する水素原子を、
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；および
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
からなる群から選択される物質
で置換する工程を含む。

このような水酸基内の水素原子を置換するために用いることができる物質（以下、「水酸基置換物質」という）としては、例えば、非特許文献１に従い合成したＮ−（６−イソシアネートヘキシル）コレステリルカルバメート（以下、「ＣＨＩ」ともいう）、Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）アルキルカルバメート（以下、「Ｒ−Ｉｃ」ともいう）が挙げられる。

上記（１）多糖を有機溶媒に溶解する工程において、多糖を溶解させるために用いる溶媒としては、例えば有機溶媒が挙げられる。有機溶媒の例としては、ジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、アセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、イソプロパノールなどが挙げられる。好ましくはＤＭＳＯ、より好ましくは脱水ＤＭＳＯである。有機溶媒の量（ｍＬ）は、多糖５００ｍｇ（３．０８６×１０^−３ｍｏｌ（単糖換算量））に対して５０ｍＬ〜２５０ｍＬが好ましいが、特に限定されない。有機溶媒の量（ｍＬ）は、当業者によって適宜設定され得る。

上記（２）の工程において、水酸基置換物質は、多糖中の水酸基を構成する水素原子が、単糖１００残基内の総水酸基に対して、例えば、１個〜１０個置換されるように、多糖と反応させ得る。例えば、モル比にて、多糖１ｍｏｌ（単糖換算量）に対して、水酸基置換物質が１×１０^−２〜１０×１０^−２ｍｏｌである。当該水酸基置換物質の量（ｍｏｌまたはｍｇ）は、多糖において置換すべき水酸基の個数に応じて、適宜設定することができる。

上記方法では、必要に応じて、上記（１）多糖を有機溶媒に溶解する工程の前に、多糖を乾燥させる工程があってもよい。多糖を乾燥させる方法としては、例えば、減圧乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥、および凍結乾燥が挙げられる。好ましくは減圧乾燥である。減圧乾燥の条件（例えば、気圧、温度または時間）は多糖の平均分子量（Ｍｗ）および／または質量（ｍｇ）に応じて適宜設定することができる。

上記方法によって得ることができるＣＨ−ＢＰＳおよびＲ−ＢＰＳは、以下の式（Ｉ）で表される構造：

（式（Ｉ）中、
Ｘ_１からＸ_２０は、それぞれ独立して、水素原子、コレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基で置換されたコレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基、および−ＣＯ−ＮＨ−Ｙからなる群から選択される基であり、
Ｙは、水素原子、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基、および−（ＣＨ_２）_ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｏ−Ｚ（ここで、ｐは０から２０の整数である）からなる群から選択される基であり、そして
Ｚは、水素原子、コレステリル基、Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基で置換されたコレステリル基、およびＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基からなる群から選択される基であり、
但し、Ｘ_１からＸ_２０のすべてが水素原子である場合を除く）を含む。

ＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳは水中にて、負電荷を有する大きさの均一な多糖ナノゲル（以下、この多糖ナノゲルを「ＣＨ−ＢＰＳナノゲル」または「Ｒ−ＢＰＳナノゲル」ともいう）を形成する。ＣＨ−ＢＰＳナノゲルまたはＲ−ＢＰＳナノゲルの粒径は、例えば１００ｎｍ〜２００ｎｍである。

ＣＨ−ＢＰＳナノゲルまたはＲ−ＢＰＳナノゲルの形成は、上記ＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳを適切な溶媒（例えば、水）でゲル化させることにより行うことができる。

本発明の多糖ナノゲルを有効成分として含有する組成物の用途としては、食品、医薬品および化粧品が挙げられる。組成物の形態としては、特に限定されず、例えば、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、ペースト状、クリーム状、ゼリー状、液体状が挙げられる。本発明の多糖ナノゲルは、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの無機物または有機物と混合して使用され得る。組成物の製造は、食品、医薬品および化粧品の製造について当業者に周知の方法が用いられ得る。

（多糖ナノゲルを含む複合体）
多糖ナノゲルを含む複合体は、ナノゲルとナノゲルに複合体を形成させるために用いられる物質（以下、複合化物質という）を共存させ、相互作用させることにより、複合化物質を多糖ナノゲル中の空隙に取り込ませることによって形成される。

上記複合化物質としては、各種の酵素、抗体、抗原、ホルモン等のタンパク質またはぺプチド、核酸、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、酵素基質、酵素基質類似物、補酵素、レクチン、多糖類、グリコプロテイン、ヒストン、およびホルモン受容体などの生理活性物質受容体を例示することができ、特に限定されないが、タンパク質またはペプチドが好ましい。タンパク質またはペプチドとしては、例えばインスリン、成長ホルモン、ソマトメジン、グルカゴン、心房性ナトリウム利尿ペプチド、脳性ナトリウム利尿ペプチド、カルシトニンなどのペプチドホルモン、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）などの造血因子、γ−インターフェロンなどのインターフェロン類、およびアンチ-α-チュブリン、抗ＴＮＦアルファ抗体、抗ヒトCD20ヒト・マウスキメラ抗体などの抗体が挙げられる。

多糖ナノゲルと複合化物質との混合比は、用いる多糖ナノゲルと複合化物質の種類に応じて適宜設定される。

多糖ナノゲルを含む複合体の好適な形成条件としては、多糖ナノゲルと複合化物質とをバッファー中で混合し、例えば２０℃〜７０℃、好ましくは３０℃〜５０℃にて、１０分間〜４８時間、好ましくは１時間〜２４時間静置する。多糖ナノゲルを含む複合体の形成に用いるバッファーは、多糖ナノゲルと複合化物質の種類により適宜選択される。

このような複合体もまた、例えば、食品、医薬品および化粧品として用いられる。本発明の複合体もまた、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの無機物、有機物と混合され得る。

（創傷治癒剤）
次に、本発明の創傷治癒剤について詳述する。

本明細書において、「創傷」とは、ヒトまたは哺乳動物の体表組織に生じる損傷であって、外的、内的要因によって生じる物理的な損傷のことをいう。創傷としては、特に限定されず、例えば、切創、裂創、刺創、咬創、擦過傷、銃創、挫傷、熱傷、褥瘡、糖尿病性潰瘍、および化学損傷が挙げられる。

本明細書において、「創傷治癒」とは、上記損傷した組織または細胞が、再生および／または修復するこという。

本発明の創傷治癒剤は、有効成分として、多糖（例えば、ＢＰＳ）の一部の水酸基を構成する水素原子を、
コレステロール；
コレステロール誘導体；
Ｃ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
ウレタン結合（−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−）を介した水素；
ウレタン結合を介したコレステロール；
ウレタン結合を介したコレステロール誘導体；または
ウレタン結合を介したＣ_１からＣ_２０の分岐または環を有していてもよいアルキル基；
で置換した多糖（ＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳ）、あるいはこれらの組み合わせ（以下、「有効成分多糖」ともいう）を含有する。多糖、ＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳは、それぞれ、上記低分子化された多糖、ＣＨ−ＢＰＳまたはＲ−ＢＰＳであってもよい。

（創傷治癒剤の製造および使用方法）
上記創傷治癒剤は、医薬品または化粧品として使用することができる。上記創傷治癒剤の形態としては、特に限定されず、例えば、粉末状、顆粒状、錠剤状、カプセル状、ペースト状、クリーム状、ゼリー状、および液体状が挙げられる。このような創傷治癒剤の製造には、医薬品または化粧品の製造について当業者に周知の方法が用いられ得る。

医薬品または化粧品として使用する場合、有効成分多糖の配合量、あるいは有効成分多糖として、多糖、ＣＨ−ＢＰＳおよびＲ−ＢＰＳのうち任意の組合せを用いる場合の多糖、ＣＨ−ＢＰＳおよびＲ−ＢＰＳの質量（ｍｇ）比は、その目的、用途、形態、剤型、症状、または体重などに応じて任意に定めることができる。

本発明の創傷治癒剤は、有効成分多糖以外に、例えば、創傷治癒作用を奏するおよび／または他の薬理効果を有する他の薬剤成分、および／または当該技術分野の当業者に周知の他の添加剤を含有していてもよい。本発明において、上記他の薬剤成分および／または他の添加剤の含有量は、上記多糖が有する創傷治癒作用を阻害しない範囲において、当該技術分野の当業者により、任意の量が設定され得る。

上記他の添加剤としては、特に限定されず、例えば、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、等張剤、懸濁剤、コーティング剤などの各種調剤用配合成分が挙げられる。

上記多糖を有効成分として含有する創傷治癒剤は、外用剤として用いられ得る。外用剤としては、例えば、化粧品または医薬品が挙げられる。上記外用剤として用いられる創傷治癒剤が配合され得る医薬品としては、特に限定されず、例えば、皮膚への塗布または投与用の創傷治癒剤（例えば、クリーム剤、軟膏剤、液剤、ゲル剤、ローション剤、チック剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、パッチ剤、エアゾール剤、および坐剤など）、眼粘膜への投与用の創傷治癒剤（例えば、点眼剤、洗眼剤など）、ならびに咽喉粘膜への投与用の創傷治癒剤（例えば、うがい薬、洗口剤、およびトローチなど）が挙げられる。このような医薬品には、貼布剤（有効成分多糖を練りこんだ不織布を包含する）、傷保護剤、救急絆創膏などの衛生材料も含まれ得る。

上記創傷治癒剤を、皮膚または粘膜の創傷患部に塗布もしくは投与することにより、上記創傷患部は治癒され得る。上記外用剤として用いられる創傷治癒剤を塗布または投与する方法としては、特に限定されず、創傷患部に創傷治癒剤を直接塗布または投与し、必要に応じて、創傷患部にリトン布またはガーゼを貼付してもよい。また、必要に応じて、創傷治癒剤の塗布前に創傷患部およびその周辺を、例えば、電気バリカンで毛刈りし、例えば、電気シェーバーで皮膚表面を除毛しておいてもよい。

上記外用剤として用いられる創傷治癒剤を、皮膚または粘膜の創傷患部に塗布もしくは投与する場合、化粧品または医薬品における上記有効成分多糖の配合量は、特に限定されないが、医薬品または化粧品の全質量に対して、例えば、０．００１質量％〜１０質量％、好ましくは０．０１質量％〜１質量％である。

上記外用剤として用いられる創傷治癒剤が配合され得る化粧品としては、特に限定されず、例えば、洗顔料、化粧水、美容液、乳液、スプレー剤、パックシート、クリーム、軟膏剤、および入浴剤などが挙げられる。

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（調製例１：菌体外多糖産生ビフィズス菌の培養およびビフィズス菌産生多糖の調製）
ビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）の培養および該微生物が産生する多糖の精製は、特許文献２の記載に従った。より詳細には以下の通りであった。

まず、９質量％の脱脂乳溶液に、パンクレアチン（天野エンザイム株式会社）およびシリコンをそれぞれ終濃度が０．３６質量％および０．０１質量％となるように加えた。次いで、１０Ｎ ＮａＯＨで溶液のｐＨを８．０に調整し、５５℃にて４時間パンクレアチンを反応させて、酵素分解脱脂乳を得た。これに、カルチベータ、ラクトース、およびアスコルビン酸ナトリウムを、それぞれ終濃度で、３．０質量％、２．５質量％、および０．２質量％となるように加え、これを１２１℃にて１５分間オートクレーブで滅菌し、液体培地として使用した。

上記で調製した液体培地を用いて前培養したビフィドバクテリウム・ロンガムＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）を、１％（ｖ／ｖ）となるように、５Ｌの同じ液体培地に接種し、３７℃にて４０時間静置嫌気培養を行い、粘性物質を産生させた。培養液を遠心分離し、菌体を除去した後、上清に終濃度２０％となるようエタノールを加え、これを４℃に静置保存した。一晩静置後、遠心分離によりタンパク質を含む沈澱物を除去し、上清に終濃度５０％となるようエタノールを加え、これを４℃にて静置保存した。一晩静置後、遠心分離により沈澱物を回収し、得られた粗精製多糖画分を凍結乾燥して保存した。

上記凍結乾燥した粗精製多糖画分を水で溶解し、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−５０充填カラム（ファルマシア株式会社製）を用いてさらに分画し、０．０７Ｍ〜０．５ＭのＮａＣｌで溶出された画分を凍結乾燥し、精製多糖画分とした。

調製した上記精製多糖画分を水で溶解し、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ６５Ｓ充填カラム（東ソー株式会社製）を用いてゲル濾過し、ＧＰＣ−ＭＡＬＬＳ（ゲル浸透クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱）により重量平均分子量（Ｍｗ）を調べたところ、約５４０，０００であった。

次に、ゲル濾過画分（多糖）に蟻酸を加え、加水分解した。この加水分解液を減圧乾固後、さらにトリフルオロ酢酸を加えて加水分解し、加水分解生成物を得た。ＩＯＮ−３００カラム（東京化成工業株式会社製）を用いたＨＰＬＣ分析により、この多糖が、ガラクトース、グルコース、およびラムノースから構成されることがわかった。

この加水分解生成物を水素化ホウ素ナトリウムで還元し、無水酢酸とピリジンを加えてアセチル化したものを、Ｒ−２２５カラム（Ｊ＆Ｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社製）を用いてＧＣ分析した。その結果、この多糖を構成するガラクトースと、グルコースと、ラムノースとのモル比は４：２：１であると判定した。

上記加水分解生成物に、ＮＡＤＨの存在下、乳酸デヒドロゲナーゼを作用させたところ、乳酸が生じた。したがって、この多糖画分にピルビン酸が存在することがわかった。また、多糖中のピルビン酸含有率は、５質量％であることがわかった。

多糖の結合様式を明らかにするため、メチル化して分析を行った。ゲル濾過画分（多糖）をメチル化した後に蟻酸を加えて加水分解し、この加水分解物を還元後アセチル化して得られた生成物をＧＣ−ＭＳ測定にかけ、分析した。その結果、１，５−ジ−Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−グルシトール、１，５−ジ−Ｏ−アセチル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、１，３，４，５−テトラ−Ｏ−アセチル−２，６−ジ−Ｏ−メチル−ラムニトール、１，３，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、１，４，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−グルシトール、１，４，５−トリ−Ｏ−アセチル−２，３，６−トリ−Ｏ−メチル−ガラクチトール、および１，４，５，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２，３−ジ−Ｏ−メチル−ガラクチトールのメチル化された糖が得られた。

また、ＮＭＲ分析により、結合状態を検討した。これらのデータから、上記多糖は、ガラクトース、グルコース、およびラムノースからなる群より選択される少なくとも１種の単糖からなるオリゴ糖の繰り返しにより構成され、かつピルビン酸で修飾されており、上記多糖が、以下の式（ＩＩ）の繰り返しにより構成されることがわかった。

（実施例１：ＢＰＳの低分子化条件の検討）
調製例１で得られたＢＰＳ１００ｍｇを水２０ｍＬに溶解した（０．５Ｗ／Ｖ％）。湿式微粒化装置（Star Burst Mini、HJP-25001H、株式会社スギノマシン製）を用いて圧力５０ＭＰａにて、３０回処理し、５、１０、２０、および３０回処理の時に、２００μＬの溶液をサンプリングした。圧力２４５ＭＰａにて同様の操作を行った。サンプリングした溶液に、０．２Ｎ ＫＮＯ_３溶液５０μＬを加え(ＢＰＳ濃度０．４Ｗ／Ｖ％)、SEC-MALLS（サイズ排除クロマトグラフィー−多角度レーザー光散乱）を用いて、重量平均分子量（Ｍｗ）を測定した。結果を図１に示す

図１に示すように、湿式微粒化装置を用いて、ＢＰＳを低分子化できることがわかった。また、処理圧力が高い場合、調製されるＢＰＳの重量平均分子量（Ｍｗ）は低いため、例えば、最も効率的に重量平均分子量（Ｍｗ）１００，０００以下のＢＰＳを調製するためには、圧力２４５ＭＰａにて２０回程度の処理を行うことがよいとわかった。

（実施例２：低分子化ＢＰＳの調製）
上記湿式微粒化装置を用いて、ＢＰＳを低分子化し、重量平均分子量（Ｍｗ）の異なる２種類のサンプルを調製した。まず、調製例１で得られたＢＰＳ１ｇを水２００ｍＬに溶解した（０．５Ｗ／Ｖ％）。次に、圧力２４５ＭＰａにて４回の圧力処理を行い、処理された溶液１００ｍＬを回収した。残りの溶液１００ｍＬに対し、さらに１６回の圧力処理を行った（計２０回）。４回および２０回処理を行った溶液を凍結乾燥した。得られたサンプルを、SEC-MALLSを用いて重量平均分子量（Ｍｗ）を測定し、次いで^１Ｈ−ＮＭＲ測定、ピルビン酸量の定量を行った。結果を表２に示す。

表２に示すように、ピルビン酸量は圧力処理の前後でほとんど変わらなかった。湿式微粒化装置を用いた場合、ピルビン酸の修飾を維持したまま、ＢＰＳの重量平均分子量（Ｍｗ）を低下させることができた。

（実施例３：ＣＨ−ＢＰＳ合成）
ＢＰＳ(ＢＰＳ−Ｓ：重量平均分子量（Ｍｗ）１２５，０００（上記湿式微粒化装置（Star Burst Mini、HJP-25001H、株式会社スギノマシン製）を用いて圧力２４５ＭＰａにて１０回）、ＢＰＳ−Ｍ：重量平均分子量（Ｍｗ）３００，０００)（上記湿式微粒化装置（Star Burst Mini、HJP-25001H、株式会社スギノマシン製）を用いて圧力５０ＭＰａにて、３０回）の水酸基にコレステロールまたはコレステロール誘導体を部分的に置換したコレステロール置換ビフィズス菌産生多糖（ＣＨ−ＢＰＳ）を以下のようにして合成した。

ＣＨ−ＢＰＳの合成にあたり、まずＮ−（６−イソシアネートヘキシル）コレステリルカルバメート（ＣＨＩ）を以下のようにして合成した。

コレステロール２５ｇ（６５ｍｍｏｌ）、トルエン３００ｍＬを加えて溶解し、さらにピリジン１７ｍＬ（１２０ｍｍｏｌ）を加えた。そこへ、トルエン３００ｍＬに溶解したヘキサメチレンジイソシアネート１６１ｇ（９６０ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で約６時間反応させた。反応終了後、トルエンと過剰のヘキサメチレンジイソシアネートを減圧除去し、生成した淡黄色の結晶をヘキサンを用いて十分洗浄操作を行った後、室温で３時間減圧乾燥した。これにより、Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）コレステリルカルバメート（ＣＨＩ）を得た。

７０℃にて７日間減圧乾燥したＢＰＳ−Ｓ（Ｍｗ１２５，０００、１００ｍｇ、３．０８６×１０^−３ｍｏｌ（単糖換算量））を、フレームドライ（熱風乾燥）した三ツ口フラスコ中に移し、窒素ガス雰囲気下にて脱水ＤＭＳＯ（和光純薬）１００ｍＬに溶解させた。その後、ＤＢＴＤＬ（和光純薬）を５０μＬ（８．４３９×１０^−５ｍｏｌ）加え、４５℃にて１５分間撹拌した。得られた溶液に脱水ピリジン（和光純薬）に溶解させた上記Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）コレステリルカルバメート（ＣＨＩ）（３４．２ｍｇ、６．１７２×１０^−５ｍｏｌ）を滴下し、窒素ガス雰囲気下、４５℃にて２４時間反応させた。この反応溶液を再沈殿（溶媒Ｅｔ_２Ｏ（和光純薬）：ＥｔＯＨ（和光純薬）＝９：１）にて回収後、ＤＭＳＯに再溶解させ（約１ｍｇ／ｍＬ）、分画平均分子量（Ｍｗ）３，５００の透析膜を用い蒸留水に対して７日間透析した。透析後の溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た。得られた合成物の構造解析を^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６：Ｄ_２Ｏ＝９：１、８０℃）（EX-400、Bruker）により行うとともに、ＣＨＩの置換数を求めた。同様に、平均分子量（Ｍｗ）の異なるＢＰＳ−Ｍ（重量平均分子量（Ｍｗ）３００，０００）を用いてＣＨ−ＢＰＳ−Ｍを合成した。

^１Ｈ−ＮＭＲ測定結果（図２）およびM. Kohnoらの報告（M. Kohnoら, Carbohydrate Polymers, 2009年, 77巻, 351-357頁）より、ＣＨＩが置換した水酸基を構成する水素原子数（ＣＨＩ置換量）は、上記ＢＰＳ−Ｓ中の水酸基において、単糖１００残基内の総水酸基に対しておよそ２．０個であった（白色粉末、収量４４２ｍｇ、収率８６％）。重量平均分子量（Ｍｗ）の大きなＢＰＳ−Ｍを用いて合成したＣＨＩ置換体のＣＨＩ置換量は、単糖１００残基内の総水酸基に対しておよそ２．１個であった（収量１６１．０９ｍｇ、収率３２％）。同様にして、ＣＨＩ置換量の異なるＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ３．１（置換数３．１ＣＨＩ／単糖１００残基）、Ｓ５．１（置換数５．１ＣＨＩ／単糖１００残基）を合成した。ＣＨ−ＢＰＳの合成条件および結果を表３に示す。

表３に示すように、ＣＨ−ＢＰＳ合成における、置換される水酸基の数は、特に、ＤＭＳＯ量（ｍＬ）、コレステロールまたはその誘導体の量（ｍｏｌまたはｍｇ）、ＢＰＳの平均分子量（Ｍｗ）の影響を受けた。

（実施例４：Ｒ−ＢＰＳ（ＳＴ−ＢＰＳ−Ｓ）合成）
ＢＰＳ(ＢＰＳ−Ｓ：重量平均分子量（Ｍｗ）１２５，０００、ＢＰＳ−Ｍ：平均分子量（Ｍｗ）３００，０００)の水酸基にステアリル基を部分的に置換したステアリル基置換ビフィズス菌産生多糖（ＳＴ−ＢＰＳ−Ｓ（Ｒ−ＢＰＳ））を以下のようにして合成した。

ＳＴ−ＢＰＳ−Ｓの合成にあたり、まずＮ−（６−イソシアネートヘキシル）ステアリルカルバメート（ＳＴＩ）を以下のようにして合成した。

ステアリルアルコール３．４８ｇ（１２．９ｍｍｏｌ）、トルエン５０ｍＬを加えて溶解し、さらにピリジン２．０４ｇ（２５．８ｍｍｏｌ）を加えた。そこへ、トルエン５０ｍＬに溶解したヘキサメチレンジイソシアネート３０ｇ（１７８ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、８０℃で約３時間反応させた。反応終了後、トルエンおよび過剰のヘキサメチレンジイソシアネートを減圧除去し、生成した淡黄色の結晶をヘキサンで十分洗浄操作を行った後、室温で３時間減圧乾燥した。これにより、Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）ステアリルカルバメート（ＳＴＩ）を得た。

次いで、実施例３で使用したＮ−（６−イソシアネートヘキシル）コレステリルカルバメート（ＣＨＩ）の代わりに、上記Ｎ−（６−イソシアネートヘキシル）ステアリルカルバメート（ＳＴＩ）（９．２５８×１０^−５ｍｏｌ）を用いたこと以外は、実施例３と同様にして、多糖中の単糖１００残基内の総水酸基に対しておよそ３．１個の水酸基を構成する水素原子がステアリル基置換されたＢＰＳ（ＳＴ−ＢＰＳ−Ｓ）を得た（^１Ｈ ＮＭＲ ＤＭＳＯ−ｄ_６，８０℃；収率３６％）。

（実施例５：動的光散乱（ＤＬＳ）法を用いたＣＨ−ＢＰＳの粒径およびゼータ電位の測定）
実施例３で得られたＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０、Ｓ３．１、Ｓ５．１およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１の動的光散乱（ＤＬＳ）法による粒径測定およびゼータ電位測定を行い、ＣＨ−ＢＰＳのリン酸バッファー中でのナノゲル形成およびその表面電位特性を検討した。本測定ではＮａＣｌ（終濃度１４０ｍＭ）を含有するリン酸バッファー、およびＮａＣｌを含有しないリン酸バッファーを用い、ナノゲル形成における塩の影響についても検討を行った。

ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０、Ｓ３．１、Ｓ５．１およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１を１．０ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳ（Dulbecco’ｓ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、ＳＩＧＭＡ）および１０ｍＭリン酸バッファー（ＰＢ、ｐＨ７．４）に撹拌溶解させた。プローブ型超音波照射器（SONIFIRE 450、Branson）を用いて、４℃にて２０Ｗの超音波を１５分間照射した後、２０，０００ｇ、２０℃にて３０分間遠心分離を行い、不純物を除去した。その上清をポアサイズ０．２２μｍの親水性ＰＶＤＥフィルター（Millex（登録商標）-HV、MILLIPORE）にて濾過し、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０、Ｓ３．１、Ｓ５．１およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１溶液を得た。これらの溶液をＤＬＳ測定用セルに入れ、Zetasizer Nano ZS（Malven Instruments、Malven）を用いてＤＬＳ測定を行った。また、ゼータ電位測定用専用セルを入れ、Zetasizer Nano ZSを用いてゼータ電位測定を行った。さらに、溶液調製時の超音波照射時間の影響についても検討を行った。結果を表４および図３に示す。

表４に示すように、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０、Ｍ２．１ともにＰＢＳバッファー中では粒径１５０〜１６０ｎｍの均一な大きさのナノゲルを形成したが、ＰＢバッファー中では約１９０ｎｍ前後であった。ＰＢバッファー中で粒径が大きくなった理由としてはＢＰＳの負電荷による静電反発が考えられる。これらの結果から、塩による粒径変化の影響は考えられるものの、生理的塩類濃度条件（ＰＢＳバッファー中）においてナノゲルを形成することが確認された。

また、図３に示すように、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０に対し、超音波照射時間１５分間〜６０分間の条件では粒径の変化はほとんど確認されず、１５分間の超音波照射時間で均一な大きさのナノゲルを形成することがわかった。また、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１についても同様の結果を得た。以上の結果を表５に示す。

表５に示すように、溶媒をＰＢＳ、超音波照射時間を１５分間として、ＣＨ−ＢＰＳ Ｓ２．０、Ｓ３．１、Ｓ５．１およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１の粒経をＤＬＳ法にて測定した結果、いずれも流体力学直径（Ｄ_Ｈ）が１２０〜２００ｎｍの比較的大きさが均一のナノゲルを形成することが確認された。また、同様の条件で調製した各ＣＨ−ＢＰＳナノゲルのゼータ電位を測定した結果、−５から−９ｍＶの値となり、ＣＨ−ＢＰＳはＰＢＳバッファー中で負電荷のナノ微粒子であることが明らかとなった。

（実施例６：ＣＨ−ＢＰＳナノゲルのマイクロレオロジー特性評価）
単糖１００残基内の総水酸基に対して、ＣＨ−ＢＰＳ中の水酸基のＣＨＩ置換量、ＢＰＳの平均分子量（Ｍｗ）およびＣＨ−ＢＰＳの濃度がＣＨ−ＢＰＳ溶液のレオロジー特性に与える影響をマイクロレオロジー測定により検討した。マイクロレオロジー測定とは、ソフトマター中に分散させたプローブ粒子の挙動を解析する（粒子追跡法）ことにより、周囲の媒質の力学的性質に関する情報を得る方法である。

ＣＨ−ＢＰＳを所定の濃度でミリＱ水に溶かし、一晩撹拌した（２ｍｇ〜８０ｍｇ／ｍＬ）。ＤＳＬ測定により約１４０ｎｍの均一なＣＨ−ＢＰＳナノゲルの形成を確認した後、終濃度が２．０×１０^４粒子／μＬとなるようにPolybead Hydroxylane Microspheres（１．０μｍ、Poly Science）を添加し、溶液中に分散したビーズの動きを光学顕微鏡（倍率１００倍）で観察した。それぞれのサンプルについて２５０秒の動画（２６ｆｐｓ）を撮り、その画像を解析することにより粘弾率を求めた。

解析には、まず取り込んだａｖｉファイルより１つまたは２つのビーズが映った箇所を、ＡＶｉソフトウェアを用いて切り出し、次いで、VirtualDubModソフトウェアを用いてファイルを１６０×１２０にリサイクルした。WCIF ImageJソフトウェアのプラグインであるMultiTrackerを用いてビーズの軌跡を２次元で数値化した。それらの数値を用いて平均２乗変位（ｒ２）を求め、複素粘弾率Ｇ（ω）、損失弾性率Ｇ”（ω）、貯蔵弾性率Ｇ’（ω）を求めた。

ＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１およびＢＰＳ−Ｍ２．１、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０およびＢＰＳ−Ｓ２．０のマイクロレオロジー測定結果を、それぞれ図４および図５に示す。ゲル化点をＧ’（ω）（黒線）とＧ”（ω）（灰色線）とが重なる濃度とすると、ＢＰＳでは、ＢＰＳ Ｍ２．１（図４（Ｂ））が２０ｍｇ／ｍＬ、ＢＰＳ−Ｓ２．０（図５（Ｂ））が７０ｍｇ／ｍＬ付近でゲル化し、低分子量化によりＢＰＳのゲル化濃度が顕著に低下することが確認された。一方、ＣＨ−ＢＰＳではＣＨ−ＢＰＳ−Ｍ２．１（図４（Ａ））が５ｍｇ／ｍＬ、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０（図５（Ａ））が２０ｍｇ／ｍＬ付近でゲル化し、コレステリル基が置換されたことで粘性が増加し、ゲル化点が低濃度側に移動したことが明らかとなった。

また、図６に示すように、各濃度におけるＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０溶液（図６（Ａ））およびＢＰＳ溶液（図６（Ｂ））の写真による視覚的な比較からも、ＢＰＳへのコレステロールまたはその誘導体の置換により増粘性が向上していることがわかる。

（実施例７：ＣＨ−ＢＰＳナノゲルにおけるタンパク質複合体形成機能の検討）
ＣＨ−ＢＰＳナノゲルとタンパク質との相互作用を、ＦＩＴＣ−Ｉｎｓ（Ｓｉｇｍａ社製）をモデルタンパク質として評価し、超遠心分離法を用いてＣＨ−ＢＰＳナノゲル−タンパク質複合体の機能について検討を行った。

ＢＰＳ−ＳおよびＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０を１ｍｇ／ｍＬになるようにＰＢＳバッファーに溶解させ、プローブ型超音波照射器（SONIFIRE 450、Branson）を用いて、４℃にて２０Ｗ超音波を１５分間超音波照射した後、２０，０００ｇ、２０℃にて３０分間遠心分離し、不純物を除去した。その上清をポアサイズ０．２２μｍの親水性ＰＶＤＦフィルター（Millex（登録商標）-HV、MILLIPORE）で濾過し、ＢＰＳ−Ｓ２．０およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０溶液を調製した。次にＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液の濃度を０．２、０．１、０．０５、０．０２３、および０．０１２５ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳバッファーで希釈調製した。このＦＩＴＣ−Ｉｎｓ溶液１５０μＬにＢＰＳ−Ｓ２．０およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０溶液に加え、３７℃にて３時間または２４時間静置し、複合化を行った（混合後のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ終濃度０．１、０．１、０．０５、０．０２５、０．０１２５、および０．００６２５ｍｇ／ｍＬ、ナノゲル濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）。２４時間後、２００，０００ｇ、４℃にて１時間超遠心分離を行い、その上清の４９２ｎｍ（ＦＩＴＣ−Ｉｎｓにおける最大吸収波長）における吸光度を、紫外可視分光光度計を用いて測定し、ＣＨ−ＢＰＳナノゲルのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ最大取り込み量を算出した。結果を図７に示す。

図７に示すように、複合体形成時間（３時間または２４時間）によるＣＨ−ＢＰＳナノゲルへのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ取り込み変化量について検討を行ったところ、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０のＦＩＴＣ−Ｉｎｓ取り込み量は３時間と２４時間とでほぼ差がないことからＣＨ−ＢＰＳは３時間以内でほぼ全てのＦＩＴＣ−Ｉｎｓを取り込むことが明らかとなった。

次に、ＢＰＳ−Ｓ２．０とＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０とのＦＩＴＣ−Ｉｎｓ複合体形成量の違いを検討したところ、ＢＰＳ−２．０がＦＩＴＣ−Ｉｎｓを最大１．８５μｇ、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ２．０が最大７．００μｇの複合体を形成したことが明らかとなった。コレステロールまたはその誘導体の置換によってＦＩＴＣ−Ｉｎｓ複合化量が顕著に増加することが確認された。これはＣＨ−ＢＰＳ−Ｓが疎水性相互作用によってナノゲルを形成し、内部に疎水性の物理架橋点とナノ空間を有することからＦＩＴＣ−Ｉｎｓと効率よく複合化できるためと考えられる。

以上より、コレステロールまたはその誘導体の置換量を制御することが可能なコレステロールまたはその誘導体で置換されたＢＰＳ（ＣＨ−ＢＰＳ）を合成することができた。

得られたＣＨ−ＢＰＳは、水中で粒径１２０〜２００ｎｍの負電荷を有する大きさの均一なナノ微粒子（ＣＨ−ＢＰＳナノゲル）を形成し、生理的食塩水条件においても安定であった。

ＢＰＳにコレステロールまたはその誘導体を置換したことでナノゲル化が促進され、さらには溶液状態での顕著な増粘効果も認められ、ＢＰＳの粘弾性を制御し得ることが明らかとなった。

またＣＨ−ＢＰＳナノゲルはＢＰＳと比較して、タンパク質との複合体形成能が飛躍的に向上し、短期間で効率的にＦＩＴＣ−Ｉｎｓを取り込むことが分かった。

（実施例８〜１０：各種ＢＰＳの塗布による創傷治癒作用の確認）
調製例１および実施例２で得られたＢＰＳ（ＢＰＳ、ＢＰＳ−Ａ（Ｍｗ１８５，０００）、またはＢＰＳ−Ｂ（Ｍｗ７６，０００））の創傷治癒作用を上皮欠損マウスモデルで評価した。

（実施例１１〜１３：各種ＢＰＳの塗布による創傷治癒作用の確認）
調製例１で得られたＢＰＳならびに実施例３で得られたＢＰＳ−Ｓ、ＣＨ−ＢＰＳ−Ｓの創傷治癒作用を上皮欠損マウスモデルで評価した。

生理的食塩水で調製した１５ｍｇ／ｍＬのストレプトゾトシンを、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢、雄、株式会社紀和実験動物研究所）の腹腔内に投与（１５０ｍｇ／ｋｇ体重）した。ストレプトゾトシンを投与したマウスをＱｕｉｃｋｆａｔ（日本クレア株式会社製）で４日間飼育し、その後４時間絶食させて、血糖を測定した。血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ以上のＢａｌｂ／ｃマウスを糖尿病とみなして、創傷治癒の検討に用いた。

上記血糖値が３００ｍｇ／ｄｌ以上のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、泡水クロラール（８％水溶液、和光純薬工業株式会社製）を投与（４００ｍｇ／ｋｇ体重）して麻酔し、動物用バリカンと除毛ムースを用いて背部を広範囲に除毛した。マウスを横向きに寝かせて背後の皮膚を引っ張りながら重ねて、生検トレパン（型番：ＢＰＰ−４０Ｆ、４ｍｍサイズ、カイ インダストリーズ株式会社製）を用いて上皮を切り取った。滅菌ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いて、各種ＢＰＳ（ＢＰＳ、ＢＰＳ−Ａ、ＢＰＳ−Ｂ、ＢＰＳ−Ｓ、およびＣＨ−ＢＰＳ−Ｓ）水溶液（３ｍｇ／ｍＬ）を調製し、マウスの創傷患部に、それぞれ３０μＬずつ毎日塗布した（各種ＢＰＳ塗布、実施例８〜１３：＋）。コントロールには、ＰＢＳのみを３０μＬずつ毎日塗布した（ＢＰＳ未塗布、実施例８〜１３：−）。結果を図８および９に示す。

図８に示すように、ＢＰＳ未塗布の創傷患部(−)に比べて各種ＢＰＳ塗布の創傷患部(＋)では、欠損創の作製後１〜３日目には上皮創傷患部周辺の腫脹・発赤が著しく誘発されていることが確認された。この上皮創傷患部周辺の腫脹・発赤は４〜５日目には観察されなくなり、各種ＢＰＳ塗布により腫脹・発赤の早期収束が促進されていることがわかる。各種ＢＰＳ塗布の創傷患部では凝血塊の吸収も促進され、５〜７日目には、凝血塊の大きさは、ＢＰＳ未塗布の創傷患部の半分以下にまで収縮した。７日目には凝血塊のほぼ完全な吸収とともに再上皮化が観察され、９〜１０日目には、ほぼ完全な上皮が確認された。このことから、創傷患部への各種ＢＰＳの塗布により、著しい腫脹・発赤の誘発および収束の促進、ならびに凝血塊の収縮・吸収および再上皮化、すなわち創傷治癒が促進されていることがわかる。

図９に示すように、ＢＰＳ-ＳおよびＣＨ-ＢＰＳ−Ｓ塗布創傷患部においても、未塗布の創傷患部(−)に比べて、創傷治癒が促進されていることがわかる。ＢＰＳ−Ｓ塗布部においては、４日目の凝血塊が未塗布部の約半分まで収縮し、７日目に凝血塊の剥離後、徐々に再上皮形成が観察されている。また、ＣＨ-ＢＰＳ-Ｓ塗布部においては、4日目に凝血塊周辺の剥離が部分的に認められ、７日目に凝結塊の完全な剥離が観察された後、徐々に再上皮形成が観察されている。

本発明によれば、ＢＰＳと比較して、顕著な増粘効果を有し、さらにタンパク質またはペプチドとの複合体形成効率が高いＣＨ−ＢＰＳナノゲルおよびその製造方法が提供される。上記ＣＨ−ＢＰＳナノゲルは、ＢＰＳの特性である保湿・保水性を損なわず、使用用途に合わせたゾル−ゲルマテリアルの設計が可能であり、例えば飲食品、医薬品、化粧品などに用いられ得る。さらに、本発明の創傷治癒剤は、ヒト、家畜、またはペットなどの哺乳動物を対象とし、医薬品、化粧品、石鹸、皮膚塗布剤、坐剤などの種々の分野に利用することができる。

Claims (7)

1. 糖尿病患者用の創傷治癒剤であって、多糖を有効成分として含有し、
   該多糖が、以下の式（ＩＩ）で表される構造：
   

   

   を含み、
   かつピルビン酸が式（II）の繰返し単位１ｍｏｌあたり０．８ｍｏｌから１ｍｏｌのモル比で結合されている、創傷治癒剤。
2. 前記多糖の平均分子量が、５０，０００から１，０００，０００である、請求項１に記載の創傷治癒剤。
3. 前記多糖がビフィズス菌由来である、請求項１または２に記載の創傷治癒剤。
4. 前記ビフィズス菌が、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）ＪＢＬ０５株（ＮＩＴＥ ＢＰ−８２）由来である、請求項３に記載の創傷治癒剤。
5. 前記多糖中の一部の水酸基を構成する水素原子が以下の置換基：
   −Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ _２ ） _ｐ −ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｚ
   （ここで、ｐは０から２０の整数であり、
   Ｚは、水素原子、コレステリル基、Ｃ _１ からＣ _２０ の分岐を有していてもよいアルキル基またはシクロアルキル基で置換されたコレステリル基、およびＣ _１ からＣ _２０ の分岐を有していてもよいアルキル基またはシクロアルキル基からなる群から選択される基）
   で置換されている、請求項１から４のいずれかに記載の創傷治癒剤。
6. 前記多糖中の水酸基を構成する水素原子が、単糖１００残基内の総水酸基に対して、１個から１０個の割合で置換されている、請求項５に記載の創傷治癒剤。
7. 外用剤として用いられる、請求項１から６のいずれかに記載の創傷治癒剤。

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