CN114181329B

CN114181329B - 一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法

Info

Publication number: CN114181329B
Application number: CN202111617770.7A
Authority: CN
Inventors: 邹圣灿; 刘桂亭; 孙婷; 王宝群; 林莎莎
Original assignee: Qingdao Chenland Marine Biotechnology Co ltd
Current assignee: Qingdao Chenland Marine Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-27
Filing date: 2021-12-27
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-12-27
Also published as: CN114181329A

Abstract

本发明公开了一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，属于植物多糖提取技术领域。本发明的方法是根据罗望子种子中蛋白质种类的多样性以及罗望子木葡聚糖耐酸、耐盐以及耐热的特性，将罗望子种子经过预处理得到罗望子多糖粗粉，再依次通过酸处理和碱处理并结合活性炭吸附去除多糖中的蛋白质，然后在无菌条件下进行透析，最终制备了一种蛋白和细菌内毒素含量均低的超纯罗望子木葡聚糖。与现有的水提醇沉法和有机酸提取法提取罗望子木葡聚糖相比，本发明制备得到的多糖，有着溶解性好、纯度高等优点，极大的促进了罗望子木葡聚糖在生物医药领域的应用，且本发明的方法不需醇做沉降剂，减少工序，降低了成本。

Description

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法

技术领域

本发明属于植物多糖提取技术领域，具体涉及一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法。

背景技术

罗望子种子中的木葡聚糖(XG)是一种天然的、无毒的、可食用的多糖。罗望子主要产于印度、缅甸和巴基斯坦等地，在我国云南、广东、福建等省区也有种植。罗望子木葡聚糖主要是由D-半乳糖、D-木糖和D-葡萄糖组成，其相对分子质量因测定方法不同差异较大，约为25万-65万。在罗望子木葡聚糖的分子结构中，主链是由β-1,4糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖构成，侧链是α-1,6糖苷键连接的D-吡喃木糖和β-1,2糖苷键连接的D-吡喃半乳糖。罗望子木葡聚糖具有耐盐、耐热和耐酸性的稳定作用。其黏度不受酸类和盐类等的影响。因罗望子木葡聚糖资源丰富、价格低廉，以及良好的流变特性、卓越黏附性、优良的胶凝性等，其在食品、生物医药、造纸、纺织等领域具有非常好的应用前景。

罗望子种仁粉中含有XG 61.5％～72.2％、蛋白质15.0％～20.9％、水分11.4％～22.7％、油脂3.0～7.5％、粗纤维2.5％～8.2％、灰分2.4％-4.2％等。可以看出脂肪和蛋白质为罗望子种子中除非纤维碳水化合物外含量最多的两种物质。其中，脂肪使罗望子多糖在储存和运输过程中容易腐烂变质，蛋白质使罗望子多糖在生物医药领域中应用时引发诸多不良的机体反应。脂肪可以通过异丙醇显著降低其在罗望子多糖中的含量，而蛋白质则较难去除。据报道，罗望子多糖中蛋白质主要是由38.7％的不溶性蛋白质和61.3％的可溶性蛋白质(其中包括21.7％的盐溶蛋白质、19.6％的水溶性蛋白质、16.7％的碱溶性蛋白质和3.9％的醇溶性蛋白质)组成。而对于其中多糖的提取方法有经典的水提醇沉法和有机酸提取法，但是这两种方法制备得到的多糖，有着溶解性差、纯度不高等缺点，极大的限制了罗望子木葡聚糖在生物医药领域的应用。因此，现亟需一种可以制备超纯罗望子木葡聚糖的方法。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)将罗望子多糖粗粉在80-100℃下，用水溶解2-6h配制成质量分数为0.5％-5％的溶液；

(2)将步骤(1)中的溶液离心去除不溶性杂质，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

(3)向罗望子多糖溶液中加入酸溶液，调节pH至2.5-4.5，然后室温下静置沉降3-6h，离心得到上清液Ⅰ；

(4)向上清液Ⅰ中加入碱溶液，调节pH至10.5-12.5，室温下继续静置沉降2-4h，离心得到上清液Ⅱ；

(5)向上清液Ⅱ中加入活性炭吸附后离心，得到上清液Ⅲ；

(6)将上清液Ⅲ装入50kDa透析袋中，透析除去杂质；透析后的溶液经过冷冻干燥得到超纯罗望子木葡聚糖。

本发明中罗望子多糖粗粉是由罗望子种子进行预处理得到，所述的预处理为常规的处理方法，一般为烘炒、粉碎、过筛、脱脂等。

在上述方案的基础上，所述步骤(2)中的离心为9000rpm，15min。

在上述方案的基础上，所述步骤(3)中的酸溶液为乳酸水溶液、醋酸水溶液中的至少一种。

在上述方案的基础上，所述酸溶液的浓度为质量分数0.1％-2.0％。

在上述方案的基础上，所述步骤(4)中的碱溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液中的至少一种。

在上述方案的基础上，所述碱溶液的浓度为质量分数0.05％-1％。

在上述方案的基础上，所述步骤(5)中活性炭的添加量为质量分数2％。

上述方法制备的木葡聚糖，所述木葡聚糖中蛋白质含量＜0.5％，细菌内毒素＜500eu/g。

上述木葡聚糖在生物医药领域中的应用。

本发明技术方案的优点：

本发明根据罗望子种子中蛋白质种类的多样性以及罗望子木葡聚糖耐酸、耐盐以及耐热的特性，将罗望子种子经过预处理得到罗望子多糖粗粉，再依次通过酸处理和碱处理并结合活性炭吸附去除多糖中的蛋白质，然后在无菌条件下进行透析，最终制备了一种蛋白和细菌内毒素含量均低的超纯罗望子木葡聚糖。与现有的水提醇沉法和有机酸提取法提取罗望子木葡聚糖相比，本发明制备得到的多糖，有着溶解性好、纯度高等优点，极大的促进了罗望子木葡聚糖在生物医药领域的应用，且本发明的方法不需醇做沉降剂，减少工序，降低了成本。

附图说明

图1实施例1所得样品的FT-IR图；

图2不同方法所制得的罗望子木葡聚糖的图片，从左到右依次为实施例1方法所制得的罗望子木葡聚糖、对比例2方法所制得的罗望子木葡聚糖和对比例3方法所制得的罗望子木葡聚糖。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)罗望子种子进行预处理得到罗望子多糖粗粉，将罗望子多糖粗粉用水配制成1％的溶液在80℃下溶解6h；

(2)以9000rpm离心15min，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

(3)向罗望子多糖溶液中加入0.5％乳酸，调节pH至3.5，然后室温下静置沉降3h，再离心得到上清液Ⅰ；

(4)向上清液Ⅰ中加入0.1％氢氧化钠，调节pH至11，静置沉降2h，离心得到上清液Ⅱ；

(5)向上清液Ⅱ中加入2％活性炭搅拌4h进行吸附，离心后得上清液Ⅲ；

(6)在无菌环境下将上清液Ⅲ装入50kDa透析袋，透析48h，进一步除去前步中降解的部分多肽蛋白、氨基酸和无机盐等杂质；

(7)最后，进行冷冻干燥得到罗望子木葡聚糖，经粉碎得到木葡聚糖粉末，罗望子木葡聚糖为类白色粉末(如图2中A所示)，测得其蛋白质含量为0.3％，低于国家标准规定的3％；细菌内毒素含量为200eu/g，将所得原料配制成1wt％的水溶液，室温下可以在30-40min内充分溶解，溶液澄清透明，紫外检测600nm透光率为99％；其中，蛋白质和细菌内毒素含量的测定方法分别依据《中华人民共和国药典》(2020版)四部通则0731蛋白质含量测定法和通则1143细菌内毒素检查法进行测定。

测定上述方法所得样品的FT-IR图如图1所示，其中，1030cm^-1处的吸收谱带归属于C-O的弯曲振动，2895cm^-1的谱带属于C-H的不对称伸缩振动，1373cm^-1处的吸收峰是C-H面内弯曲振动，3400cm^-1处的宽谱带是O-H的伸缩振动，1653cm^-1处的窄谱带是O-H的弯曲振动。其中1373、1039、945和899cm^-1处吸收峰表现出木葡聚糖的特证峰。945cm^-1为葡萄糖的环振动，而899cm^-1对应葡萄糖和木糖β端基的链接，说明该提取物为木葡聚糖。

实施例2

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)罗望子种子进行预处理得到罗望子多糖粗粉，将罗望子多糖粗粉用水配制成3％的溶液，于90℃下溶解4h；

(2)以9000rpm离心15min，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

(3)向罗望子多糖溶液中加入1％醋酸，调节pH至4.2，然后室温下静置静止沉降6h，再离心得到上清液Ⅰ；

(4)向上清液Ⅰ中加入1％氢氧化钾，调节pH至12.1，然后室温下静置静止沉降4h，再离心得到上清液Ⅱ；

(7)最后，进行冷冻干燥得到罗望子木葡聚糖，经粉碎得到木葡聚糖粉末，罗望子木葡聚糖为类白色粉末，测得其蛋白质含量为0.25％，低于国家标准规定的3％，细菌内毒素含量为180eu/g，将所得原料配制成1wt％的水溶液，室温下可以在30-40min内充分溶解，溶液无色澄清透明，紫外检测600nm透光率为98％。

对比例1

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)罗望子种子进行预处理得到罗望子多糖粗粉，将罗望子多糖粗粉用水配成1％的溶液，于80℃下溶解6h；

(2)以9000转离心15分钟，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

(3)向罗望子多糖溶液中加入0.1％氢氧化钠，调节pH至11，然后室温下静置静止沉降3h，再离心得到上清液Ⅰ；

(4)向上清液Ⅰ中加入2％活性炭搅拌4h进行吸附，离心后得上清液Ⅱ；

(5)在无菌环境下将上清液Ⅱ装入50kDa的透析袋，在无菌环境下透析48h，进一步除去前步中降解的部分多肽蛋白、氨基酸和无机盐等杂质；

(6)最后，进行冷冻干燥得到罗望子木葡聚糖，经粉碎得到木葡聚糖粉末，罗望子木葡聚糖为黄色粉末，测得其蛋白质含量为10.8％，高于国家标准规定的3％，细菌内毒素含量800eu/g，将原料配制成1wt％的水溶液，室温下需要3h或更长的时间才能溶解，溶液黄色稍浑浊，紫外检测600nm处的透光率为85％。

对比例2

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)罗望子种子进行预处理得到罗望子多糖粗粉，将罗望子多糖粗粉用水于90℃下溶解4h，配制成浓度为2.5％的溶液；

(2)以9000转离心15分钟，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

(3)向罗望子多糖溶液中加入1％乳酸，调节pH至4，然后室温下静置静止沉降3h，再离心得到上清液上清液Ⅰ；

(5)将上清液Ⅱ装入透析袋，在无菌环境下透析48h，进一步除去前步中降解的部分多肽蛋白、氨基酸和无机盐等杂质；

(6)最后，进行冷冻干燥得到罗望子木葡聚糖，经粉碎得到木葡聚糖粉末，罗望子木葡聚糖为淡黄色粉末(如图2中B所示)，测得其蛋白质含量为5.2％，高于国家标准规定的3％，细菌内毒素含量1500eu/g，将原料配制成1wt％的水溶液，可以在3h或更长的时间才能溶解，溶液淡黄色稍浑浊，透光率为83％。

对比例3

一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，步骤如下：

(1)罗望子种子进行预处理得到罗望子多糖粗粉，将罗望子多糖粗粉用水配制成浓度为3.3％的溶液，用柠檬酸调节溶液pH4.5左右，加热搅拌，90℃下溶解30min，得到粘稠的浆状液；

(2)在浆状液中加入原体积50％热水稀释，搅拌均匀，静置24h，9000rpm下离心15min，收集上清液；

(3)向上清液中加入0.1％NaOH溶液，将其pH调至中性，然后加热浓缩至半流动状时停止加热，加入少量NaHCO₃溶液。

(4)粘稠的半流动浆状液在75℃下烘干，粉碎得到罗望子多糖为肉粉色(如图2中C所示)，测得其蛋白质含量为11.2％，高于国家标准规定的3％，细菌内毒素含量5000eu/g，将原料配制成1wt％的水溶液，室温下需要4h或更长的时间才能溶解，溶液肉粉色稍浑浊，透光率为75％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.一种提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）将罗望子多糖粗粉在80-100℃下，用水溶解2-6 h配制成质量分数为0.5%-5%的溶液；

（2）将步骤（1）中的溶液离心去除不溶性杂质，取上清液，即为罗望子多糖溶液；

（3）向罗望子多糖溶液中加入酸溶液，调节pH至2.5-4.5，然后室温下静置沉降3-6h，离心得到上清液Ⅰ；

（4）向上清液Ⅰ中加入碱溶液，调节pH至10.5-12.5，室温下继续静置沉降2-4h，离心得到上清液Ⅱ；

（5）向上清液Ⅱ中加入活性炭吸附后离心，得到上清液Ⅲ；

（6）将上清液Ⅲ装入50kDa透析袋中，透析除去杂质；透析后的溶液经过冷冻干燥得到超纯罗望子木葡聚糖；

所述步骤（3）中的酸溶液为乳酸水溶液、醋酸水溶液中的至少一种，酸溶液的浓度为质量分数0.1%-2.0%；所述步骤（4）中的碱溶液为氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液中的至少一种，碱溶液的浓度为质量分数0.05%-1%。

2.根据权利要求1所述提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）中的离心为9000rpm，15min。

3.根据权利要求1所述提取罗望子种子中木葡聚糖的方法，其特征在于，所述步骤（5）为，向上清液Ⅱ中加入2%活性炭进行吸附，离心后得到上清液Ⅲ。