CN115385794B - 一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，该方法包括：取多依果汁与罗望子多糖溶液混匀，然后进行孵育，再经一次离心得到沉淀，将沉淀与乙醇水溶液混合并搅拌，然后经二次离心得到上清液，将上清液浓缩、冻干，即得到提取物绿原酸。本发明利用罗望子多糖与特定多酚相互作用形成絮凝沉淀的原理，将罗望子多糖应用于果汁中绿原酸的提取分离。与现有技术相比，本发明方法从多依果汁中提取绿原酸，有机溶剂消耗量较小，提取产物纯度高，提取率高，工序简单，提取所用溶剂对人体和环境均友好。

Description

一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的 方法

技术领域

本发明属于化合物提取及分离技术领域，涉及一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法。

背景技术

多依果，又称栘依果、酸苹果，是蔷薇科、苹果亚科、栘属热带经济作物云南栘的果实，是一种药食兼用的经济植物，含有丰富的多酚类活性成分。由于特殊的地域特征，关于多依果的研究开发报道较少。绿原酸是咖啡酸和奎宁酸缩合而成的酚酸类化合物，是一种强极性化合物，易溶于水。作为多依果汁中主要的酚类成分，绿原酸具有多种药理活性，目前已经报道了绿原酸具有降血糖、调节血脂代谢、抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗菌消炎、抗肿瘤、保护心血管以及神经系统等多种功能。但绿原酸不稳定，同分异构体较多且性质差异小，再加上果汁是含有大量水分的复杂混合体系，给常规分离提取绿原酸造成了一定的难度。开发一种经济、高效的从果汁中分离提取绿原酸的方法，对多依果的精深加工和天然绿原酸的制备具有深远意义。

目前，绿原酸提取制备的方法总的来说分为相分离和柱分离。相分离法包括醇提水沉或水提醇沉、水提石灰乳沉淀法、有机溶剂萃取、双水相萃取等；柱分离如聚酰胺柱层析、大孔树脂分离等。这些方法有些是有机溶剂消耗量大，提取杂质多，提取率低；有些是适应性虽广但成本很高，工序复杂且具有一定的污染。因此亟需开发一种绿色环保、操作简便的分离提取绿原酸的方法。

根据研究报道，郑喜群等介绍了一种从葵花籽中提取绿原酸的方法，以水酶法提取葵花籽油脂后分离出的水浸提液为原料，真空浓缩后，利用乙醇沉淀除去浓缩液中的多糖成分，过滤得到的滤液浓缩冷却后即得绿原酸产品，绿原酸纯度达75.9％以上(郑喜群,等.水提醇沉法从葵花籽中提取绿原酸.食品科学,2006,27(1):159-161)，这种方法需多次使用乙醇除去多糖，且在醇沉多糖的过程中，包裹的绿原酸也随之沉降，造成绿原酸的损失。

田洪等公布了一种从甜菊叶中分步制备甜菊糖和绿原酸的方法(CN201210421968.2)，将甜菊叶用冷水浸泡得提取液，在提取液中加二价铁盐后调pH进行絮凝，过滤得滤液和滤饼，滤液用大孔树脂吸附解吸得到甜菊糖，滤饼用水溶解后用酸调pH值至0.5～5.5，过滤得绿原酸滤液，再用大孔树脂纯化得到绿原酸产品。

吴俊伟等采用均匀设计法在水提金银花工艺中加入絮凝剂，考察了ZTC1+1II型絮凝剂浓度、絮凝时间、温度、pH这4个因素对金银花中绿原酸提取率的影响，得到最优的条件，绿原酸的得率可达4.8％(吴俊伟，等.均匀设计法优化金银花水煎液絮凝提取工艺的研究.中国兽药杂志,2006,40(8):23-25)，其中各种条件需要优化确定，工序较复杂。

胡居吾等采用分相萃取法，首先使用乙酸乙酯把绿原酸从粗品提取液萃取出来，再加入分相剂如石油醚、正己烷等非极性溶剂，达到分离目的，优化后得到绿原酸纯度达到99.5％(胡居吾,等.分相萃取法制备高纯度绿原酸的工艺研究.食品科学,2010,31(4):37-41)，但该法造成大量有机溶剂消耗，并且有些试剂对人体有毒副作用。

肖玉秀等公开了一种从苎麻叶中提取分离绿原酸的方法(CN108191657B)，该方法是利用双水相系统萃取苎麻叶提取液中绿原酸，用到的双水相系统为六氟异丙醇-无机盐，而六氟异丙醇有刺激性气味，对人体有害，并且六氟异丙醇和无机盐的用量是通过优化确定，步骤比较复杂。

多依果汁中主要的多酚类物质为绿原酸，由于果汁中水分含量高，无法采用与水共溶的醇类试剂直接提取多酚，因此暂未见从多依果汁中提取绿原酸的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，以克服现有技术中以下缺陷中的至少一种：1)绿原酸提取方法有机溶剂消耗量大；2)提取杂质多或提取率低；3)工序复杂；4)提取所用溶剂对人体有害或不环保；5)现有技术无法从多依果汁中提取绿原酸。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，包括：

取多依果汁与罗望子多糖溶液混匀，然后进行孵育，再经一次离心得到沉淀，将沉淀与乙醇水溶液混合并搅拌，然后经二次离心得到上清液，将上清液浓缩、冻干，即得到提取物绿原酸。

进一步的，所述罗望子多糖溶液的质量体积浓度为0.25％～3％。

更进一步的，所述罗望子多糖溶液的质量体积浓度为3.0％。

进一步的，所述多依果汁和所述罗望子多糖溶液的体积比为1:1。

进一步的，孵育过程具体为：

在转速为100rpm的恒温振荡器上进行孵育，孵育温度为5～55℃，孵育时间为0.5～12h。

更进一步的，孵育温度为5℃，孵育时间为6h。

进一步的，一次离心的转速为8000rpm，一次离心的时间为30min。

进一步的，所述乙醇水溶液的体积浓度为40～80％，沉淀与乙醇水溶液的质量体积比为1:(5～25)。

更进一步的，所述乙醇水溶液的体积浓度为60％，沉淀与乙醇水溶液的质量体积比为1:25。

进一步的，搅拌温度为65℃，搅拌时间为2h。

进一步的，所述的多依果汁为多依果经物理压榨、然后过滤得到的果汁。

天然多糖是一类经济、无毒、容易获得、可生物降解的生物大分子，是一种安全健康的食品原料。多糖具有羟基、羧基、氢键等官能团能与多酚类物质的羟基发生反应，这种结合具有特异性高等特点。罗望子多糖(TSP)是一种木葡聚糖，主链为β-D-1,4-连接的葡萄糖，侧链是α-D-1,6-连接的木糖和β-D-1,2-连接的半乳糖组成，葡萄糖、木糖和半乳糖的比例约为3：2：1。TSP可与特定多酚类物质结合形成凝胶或絮凝沉淀(Yan Y,Takemasa M,ZhaoC,Yu L,Nishinari K.Structure-gelation research on gallate analogs andxyloglucan by rheology,thermal analysis and NMR.Food Hydrocolloids.2016,52:447-59)，但TSP添加至果汁中能产生絮凝沉淀的现象还未见报道，对于这种沉淀的组分还未有相关研究，也没有相关研究报道使用TSP分离提取多依果汁中绿原酸的技术内容。

本发明将TSP应用于分离提取多依果汁中的绿原酸，首先将罗望子多糖加入多依果汁中产生沉淀(含绿原酸)，在水体系中将绿原酸与其它物质分离，再用有机溶剂处理沉淀将绿原酸解析出来，从而提取绿原酸。本发明将罗望子多糖应用于分离提取绿原酸，另辟蹊径，这种方法高效、安全环保、操作简便，突破了常规的分离提取绿原酸的思路。

本发明方法是在多依果汁中添加质量体积浓度为0.25％-3.0％的罗望子多糖，置于恒温振荡器上以100rpm转速，5℃-55℃温度条件下孵育0.5h-12h，然后用高速离心机离心，分离得到上清液和沉淀，将沉淀再与40％-80％乙醇溶液以1:5-1:25(m/v)料液比混合提取，在65℃的恒温水浴锅中恒温搅拌2h，离心，得到提取液，HPLC检测绿原酸纯度达90％以上。本发明中的方法，避免了将果汁干燥再提取的流程，减少了能源消耗，同时，也避免了果汁中功能成分因干燥而损失的风险，可以认为是一种简便且安全的绿原酸分离提取技术。

本发明利用TSP与特定多酚相互作用形成絮凝沉淀的原理，将其应用于果汁中绿原酸的提取分离。TSP与绿原酸通过静电、氢键、疏水等非共价相互作用形成可逆的复合物，改变TSP在溶液中的构象特征及其与溶剂(水)的亲和力，使得多糖复合物之间的亲和力大于多糖复合物与溶剂之间的亲和力，从而导致分子链发生缠绕和聚集。根据热力学基本定律，当溶液体系处于亚稳区时，改变溶液条件，多糖分子克服能量势垒相互缠结聚集，形成零星分布的“核”，当“核”的尺寸大于临界尺寸时，在自由能的驱动下，多糖分子逐步扩散到成核的微区，使小核不断增长粗化，最终形成絮凝沉淀。

本发明还对提取过程中的工艺条件，如罗望子多糖溶液的质量体积浓度、孵育温度、沉淀与乙醇水溶液的质量体积比等进行了限定，所限定的工艺条件都是为了提高绿原酸的得率和纯度。

若罗望子多糖溶液的质量体积浓度过低，无法形成沉淀，也就无法将绿原酸从果汁中分离出来；而浓度超过3％，TSP在溶液中会形成凝胶，也无法进行分离。

孵育温度会影响多糖与绿原酸的结合率，温度过低，分子相互作用减弱，结合率低，会导致絮凝沉淀量减少；温度过高，会导致分子运动加剧，分子间作用力减弱，最终也会导致两者结合率降低，此外，温度过高，也会影响多糖的凝胶结构的形成，导致无法形成絮凝沉淀。

沉淀与乙醇水溶液的质量体积比会影响绿原酸的提取率和提取效率。沉淀比例过低，导致乙醇水溶液消耗过大，也会增加后期的浓缩工作量；沉淀比例过高，会导致绿原酸提取不完全，影响其提取率。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明将澄清的多依果汁与罗望子多糖(TSP)溶液混合，然后反应一段时间后，经一次离心得到沉淀物，将沉淀物与乙醇水溶液混合，加热搅拌提取后，经二次离心得到上清液，将上清液浓缩、干燥，得绿原酸提取物。该工艺首先通过TSP与果汁中的绿原酸相互作用形成沉淀，然后分离出TSP沉淀物，继而采用40～80％乙醇水溶液将绿原酸从TSP沉淀物中萃取出来。本发明方法避免了将果汁干燥再提取的流程，减少了能源消耗，同时，也避免了果汁中功能成分因干燥而损失的风险，所用提取溶剂为乙醇水溶液，对人体、环境均较友好，因此，本发明方法可以认为是一种简便且安全的绿原酸分离提取技术；

(2)采用本发明方法提取多依果汁中的绿原酸，多依果汁中绿原酸与TSP的结合率可达67％，提取率高，最终提取分离得到的绿原酸纯度为90％以上；

(3)本发明采用先沉淀、后溶剂萃取的方法提取多依果汁中的绿原酸，有机溶剂消耗量较小。

附图说明

图1为实施例1绿原酸提取物和绿原酸标准品在4000-400cm^-1波数的红外光谱；

图2为实施例1绿原酸提取物(上)和绿原酸标准品(下)在328nm处的液相色谱图；

图3为实施例1绿原酸提取物在280nm和330nm处的液相色谱图；

图4为绿原酸标准品溶液在328nm处的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明所采用的均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。

以下各实施例中，所使用的多依果汁的制备过程为：

对多依果进行物理压榨，然后经过滤得到多依果汁。

实施例1：

一种从多依果汁中分离提取绿原酸的方法，步骤如下：

步骤一，将多依果汁与罗望子多糖溶液(质量体积浓度为0.25％)按体积比1:1(v/v)充分混合，得到混合液。

步骤二，将步骤一得到的混合液置于恒温振荡器上，以100rpm的速度，在35℃的温度条件下孵育12h。

步骤三，将步骤二孵育结束后的样品用高速离心机离心30min，离心转速为8000rpm，分离得到上清液和沉淀。

步骤四，将步骤三得到的沉淀与体积浓度为40％的乙醇水溶液按1:10(m/v)料液比混合，置于65℃的恒温水浴锅中恒温搅拌萃取2h，将提取液离心，分离得到上清液，浓缩，冻干，即为绿原酸提取物。

对所得绿原酸提取物进行红外光谱分析，分别将2mg的绿原酸提取物和2mg绿原酸标品与200mg溴化钾粉末混合碾磨，压片，在4000-400cm^-1波数进行红外光谱扫描。结果如图1所示。从图1可知，提取物的红外谱图与绿原酸标准品基本一致，在3500cm^-1-3200cm^-1范围内其吸收峰是分子间氢键O-H伸缩振动的吸收特征峰，说明样品分子中含有醇羟基和酚羟基；2935cm^-1处是C-H伸缩振动吸收峰，而在2930cm^-1处左右说明样品分子中含有亚甲基；2250cm^-1-1450cm^-1范围是不饱和碳碳键的伸缩振动特征峰，在1612cm^-1，1524cm^-1有吸收峰说明样品含有芳环，1438cm^-1，1385cm^-1处吸收峰是C-H弯曲振动的特征吸收峰，说明样品分子中含有烷烃；1281cm^-1处是羧基的C-O伸缩振动的特征吸收峰，说明样品中含有羧基；1202cm^-1峰是饱和酯C-C(＝O)-O的谱带，表明样品分子中含有酯的结构。

采用HPLC鉴定所得绿原酸提取物的纯度，具体步骤如下：

将得到的绿原酸提取物和绿原酸标准品分别溶于甲醇后，用HPLC分析，使用waters e2695高效液相色谱仪，C18色谱柱(4.6mm×250mm×5μm)进行分离，柱温为25℃，进样量为10μL，检测波长328nm和280nm，流动相溶剂A是三氟乙酸-水(pH＝3)，溶剂B是纯乙腈，梯度洗脱条件如下：0-40min：0-80％B，40-42min：80-100％B，42-44min：100％B，44-44.5min：100-0％B。由图2可知，绿原酸提取物与绿原酸标准品的出峰时间一致，表明提取物中的主要成分与绿原酸标准品一致。

将得到的绿原酸提取物和绿原酸标准品用LC-MS/MS鉴定比对，条件为使用超高效液相色谱和VION离子淌度四极杆飞行时间质谱联用仪，试剂：水为millipore超纯水，所有有机试剂都为Optima LC/MS级，液相条件：使用色谱柱BEH C18(1.7μm)，2.1*100mm(使用预柱)。柱温为45℃；流速0.4mL/min，流动相A：含0.1％甲酸-水，流动相B：含0.1％甲酸的乙腈。梯度洗脱条件为：0-3min：5％-20％B，3-10min：20％-100％B，10-12min：100％B，12-15min：100％-95％B，15-19min：95％B。质谱条件为采集模式：MSE(低能量/高能量切换扫描)；离子模式：电喷雾正离子/负离子分别扫描；毛细管电压:2KV(正)2KV(负)；锥孔电压：40V；雾化气温度：450℃；雾化气流量：900L/h；锥孔反吹气：50L/h；离子源温度：115℃；扫描范围：50至1000m/z；扫描速度：0.2s；碰撞能量：6eV/20～45eV；在线锁定质量(在线校正)：250pg/μL；亮氨酸脑啡肽持续进样，流速：10μL/min；采集间隔：0.5s；采集时间：0.5s；碰撞能量：6eV。

通过LC色谱分离，PDA检测器检测得到绿原酸提取物在280nm和330nm处的液相色谱图如图3所示。从图3中可知，绿原酸提取物纯度较高，通过采集正离子模式，在保留时间4.23min处的母离子峰为m/z 353，经比对，确定该峰为绿原酸的色谱峰。此外，在提取物中还鉴定出了少量的对香豆酰奎宁酸(RT 4.79min)，槲皮素-3-O-半乳糖甙或-葡萄糖苷(RT5.91min)和根皮苷(RT 7.38min)。

实施例2：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本实施例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液的质量体积浓度为3.0％，孵育温度为5℃，时间为6h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为60％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:25(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

实施例3：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本实施例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液的质量体积浓度为1.5％，孵育温度为55℃，时间为0.5h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为70％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:10(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

实施例4：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本实施例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液的质量体积浓度为2.0％，孵育温度为25℃，时间为1h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为80％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:5(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

对比例1：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本对比例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液浓度为0.1％，孵育温度为70℃，时间为20h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为10％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:30(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

对比例2：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本对比例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液浓度为0.2％，孵育温度为65℃，时间为24h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为15％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:40(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

对比例3：

与实施例1相比，绝大部分均相同，除了本对比例中，与多依果汁混合的罗望子多糖溶液浓度为0.15％，孵育温度为4℃，时间为0.3h，提取沉淀中绿原酸的溶剂为体积浓度为90％的乙醇水溶液，沉淀与乙醇水溶液的料液比为1:4(m/v)。按上述方法分离提取绿原酸。

将实施例1-4以及对照例1-3得到的绿原酸提取液用紫外分光光度计检测吸光度，以绿原酸标准品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线，计算绿原酸提取物中绿原酸的得率；同时采用HPLC鉴定绿原酸提取物的纯度。测试结果如表1所示。

采用紫外分光光度计法测定样品中的绿原酸含量，具体步骤如下：

称取绿原酸标准品溶于甲醇中，配制成浓度分别为2.5，5，7.5，10，12.5，15μg/mL的标准溶液，在328nm波长下分别平行三次测定吸光度，以绿原酸标准品溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制绿原酸标准曲线，见图1。将果汁或提取物用甲醇溶解稀释，在328nm下测定吸光度，代入标准曲线中，计算得到果汁或提取物中绿原酸的含量。

经峰面积计算，实施例1-4提取物中的绿原酸纯度为90％以上，见表1。

表1.提取的绿原酸得率及纯度

数据以平均值±标准偏差(n＝3)的形式进行表示，同列中的不同字母表示显著差异(P＜0.05，Duncan)。

如表1所示，实施例1～4得到的绿原酸得率和纯度都高于对照例1～3，实施例1-4中的绿原酸纯度均高于90％。表明通过本发明用罗望子多糖从多依果汁中分离提取绿原酸是有效的。

绿原酸与TSP的结合率计算：

分别测定多依果汁原液、以及与TSP结合沉淀后离心上清液(即步骤三得到的上清液)中的绿原酸含量，分别记为C_原和C_上，果汁中绿原酸与TSP的结合率按以下公式计算：

Y(％)＝(C_原-C_上)/C_原

其中Y(％)为绿原酸结合率。经测定，在TSP溶液的质量体积浓度为0.25～3％(m/V)，5～55℃的温度条件下孵育0.5～12h条件下，多依果汁中的绿原酸与TSP的结合率可达到67％以上。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，包括：

取多依果汁与罗望子多糖溶液混匀，然后进行孵育，再经一次离心得到沉淀，将沉淀与乙醇水溶液混合并搅拌，然后经二次离心得到上清液，将上清液浓缩、冻干，即得到提取物绿原酸。

2.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，所述罗望子多糖溶液的质量体积浓度为0.25%~3%。

3.根据权利要求2所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，所述罗望子多糖溶液的质量体积浓度为3.0%。

4.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，所述多依果汁和所述罗望子多糖溶液的体积比为1:1。

5.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，孵育过程具体为：

在转速为100 rpm的恒温振荡器上进行孵育，孵育温度为5~55℃，孵育时间为0.5~12h。

6.根据权利要求5所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，孵育温度为5℃，孵育时间为6h。

7.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，一次离心的转速为8000rpm，一次离心的时间为30min。

8.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积浓度为40~80%，沉淀与乙醇水溶液的质量体积比为1:(5~25)。

9.根据权利要求8所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，所述乙醇水溶液的体积浓度为60%，沉淀与乙醇水溶液的质量体积比为1:25。

10.根据权利要求1所述的一种利用罗望子多糖吸附作用分离提取多依果汁中绿原酸的方法，其特征在于，搅拌温度为65℃，搅拌时间为2h。

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