CN110330538B

CN110330538B - 一种槐糖脂发酵液中异构产物的分离纯化方法

Info

Publication number: CN110330538B
Application number: CN201910583672.2A
Authority: CN
Inventors: 石森; 黄长荣; 李晶; 黄真真; 王勤隆; 周芸; 孔令晓; 刘照; 任娟
Original assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Current assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Priority date: 2019-07-01
Filing date: 2019-07-01
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2039-07-01
Also published as: CN110330538A

Abstract

本发明涉及一种发酵法生产槐糖脂的产物分离纯化方法，包括以下步骤：1.发酵法生产槐糖脂结束发酵后先稀释发酵液，然后过滤分离菌体，得到含有槐糖脂的无菌液，2.无菌液通过树脂进行吸附，吸附结束后的树脂用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，得到酸型槐糖脂纯品，3.经过树脂吸附后的无菌液加入絮凝剂，静置后进行固液分离，液体蒸干溶剂，即可得到内酯型槐糖脂纯品。本方法的槐糖脂总回收率大于92％，同时能够高效分别获得两种构型的槐糖脂产品，每种产品单一构型产物比例不低于98％；与传统分离方法相比，本发明分离纯化槐糖脂的工艺简单、无复杂设备、不使用有毒有害溶剂、三废量少、绿色环保。

Description

一种槐糖脂发酵液中异构产物的分离纯化方法

技术领域

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种槐糖脂发酵液中异构产物的分离纯化方法。

技术背景

槐糖脂是一种生物表面活性剂，具有生物可降解性、低生态毒性、环境友好等特点，被广泛应用于各个领域。槐糖脂是由酵母菌大规模发酵生产的表面活性剂，发酵产量较高，可达400g/L，现已实现工业化生产。

槐糖脂具有酸型和内酯型两种结构，如下式所示，A为酸型槐糖脂，B为内酯型槐糖脂。不同结构的槐糖脂具有不同理化性质，一般而言，内酯型槐糖脂有较好的降低表面张力的能力和抗菌活性，而酸型槐糖脂有较好的泡沫形成能力和溶解性。内酯型槐糖脂适用于油田采油、环境修复等领域，酸型槐糖脂适合用于日化及家庭护理领域。

目前，常规的工业化分离方式得到的槐糖脂为酸型和内酯型的混合物，如专利CN1839892B介绍了用乙酸乙酯萃取槐糖脂发酵液，之后减压蒸馏得到槐糖脂混合物。这种方法在分离槐糖酯时只能得到两种构型的混合物，且使用有机溶剂，不环保。

专利CN105886572A介绍了一种内酯型槐糖脂的制备方法，要求初始发酵液中内酯型槐糖脂比例必须高于70％，然后对发酵液进行酸化处理，再经过高温反应，使得发酵液中的酸型槐糖脂转化成内酯型槐糖脂，最后用乙酸乙酯进行萃取，得到内酯型占主导的槐糖脂，该方法虽然能够得到以内酯型为主的产品，但要求初始发酵液中的内酯型产品不低于70％，并且在分离过程中经过了高温反应，使得酸型进行了转化，分离工艺复杂，并且只能得到一种内酯型产品。

单批次原料通过分离可以分别获得高纯度酸型和内酯型槐糖脂产品的工艺尚未有报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种高收率、高纯度、同时获得酸型和内酯型槐糖脂产品的分离纯化方法。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种槐糖脂发酵液中异构产物的分离纯化方法，包含以下步骤：

(1)使用工程菌发酵生产槐糖脂结束发酵后，用水稀释发酵液，之后分离菌体得到含槐糖脂的无菌液；

(2)无菌液通过树脂进行吸附，吸附结束后用洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到酸型槐糖脂产品；

(3)收集经树脂吸附后的无菌液，加入絮凝剂，开始有固体析出，静置待固体析出完全后，分离固体沉淀和液体，将液体减压蒸发除去水，得到内酯型槐糖脂产品，内酯型槐糖脂比例不低于98％。

本发明方法中，优选地，步骤(1)所述工程菌为酵母菌。

本发明方法中，步骤(1)结束发酵后，优选用3-5倍发酵液体积的水稀释发酵液，然后用过滤的方式除菌体，得到无菌液。

本发明方法中，步骤(2)中所述的树脂可以为碱性阴离子树脂，优选丙烯酸系弱碱性阴离子树脂，例如上海华震335弱碱性离子交换树脂、315弱碱性离子交换树脂、碱性阴离子吸附树脂155、碱性阴离子树脂HZ-016；也可以为大孔树脂，所述大孔树脂优选D101型大孔吸附树脂；所述树脂的装填长径比为5：1-20：1，优选8：1-10：1；所述树脂的体积为待吸附无菌液总体积的1/50-1/10。

本发明方法中，步骤(2)中无菌液通过树脂进行吸附时，流量控制为每小时1-5倍树脂体积，优选2-3倍树脂体积。

本发明方法中，步骤(2)中吸附结束后，用洗脱剂对树脂进行洗脱，当采用的树脂为碱性阴离子树脂时，所述的洗脱剂为浓度0.1-5wt％、优选0.5％-1.5wt％的氢氧化钠和/或氢氧化钾水溶液；当采用的树脂为大孔树脂时，所述的洗脱剂为乙醇。洗脱剂用量为20-50倍树脂体积，洗脱剂流量为每小时5-20、优选8-10倍树脂体积。

本发明方法中，步骤(2)中洗脱液优选用减压蒸发的方式进行浓缩，最终得到槐糖脂浓度约为30-50wt％的酸型槐糖脂产品，酸型槐糖脂比例不低于98wt％。

本发明方法中，步骤(3)收集吸附后的无菌液，加入絮凝剂搅拌均匀，静置约0.5-1小时待固体完全沉淀析出后，分离固体沉淀和液体，固体沉淀为吸附了杂蛋白的絮凝剂；将液体优选采用减压蒸发的方式除去水，得到内酯型槐糖脂产品，内酯型槐糖脂比例不低于98wt％。

本发明方法中，步骤(3)中所述的絮凝剂可以是聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、明胶、海藻酸钠中的一种或多种。絮凝剂加入的质量为吸附后的无菌液质量的0.1-1％，优选0.3-0.5％。

该方法可以将发酵液中的酸型和内酯型槐糖脂有效分离，两种产品总收率不低于92％，分离得到的每种产品中主要构型产物的比例不低于98％。

本发明的有益效果在于：

(1)本方法的槐糖脂总回收率大于92％，同时能够高效分别获得两种构型的槐糖脂产品，每种产品单一构型产物比例不低于98％；

(2)与传统分离方法相比，本发明分离纯化槐糖脂的工艺简单、无复杂设备、不使用有毒有害溶剂、三废量少、绿色环保。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明所提供的方法予以进一步的说明，但本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其它任何公知的改变。

实施例原料来源：

实施例中使用的分离原料是使用拟威克酵母，以葡萄糖和大豆油为碳源发酵得到的槐糖酯发酵液，菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC.No 3798，通过购买得到。

实施例中发酵工艺如下：

(1)取拟威克酵母(Wickerhamiella domercqiae Y2A CGMCC NO.3798)，在斜面培养基上30℃培养24小时，得活化的拟威克酵母；斜面培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂粉20g/L，蒸馏水定容；

(2)将步骤(1)制得的活化拟威克酵母接种于300mL三角瓶装50mL种子培养基，30℃，摇床160r/min振荡培养24h，得拟威克酵母种子液；种子培养基组分如下：葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，蒸馏水定容；

(3)按照体积比5％的接种量，将步骤(2)制得的拟威克酵母种子液接种到发酵培养基中，30℃、160r/min培养168小时，得发酵液。发酵培养基组分如下：葡萄糖80g/L，油酸60mL/L，硫酸铵5g/L，KH₂PO₄1g/L，Na₂HPO₄·12H₂O1g/L，酵母粉3g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L，pH6.0，水定容。

树脂：

上海华震335弱碱性离子交换树脂、315弱碱性离子交换树脂；

西安蓝晓101大孔树脂。

槐糖脂定量方法：

1)蒽酮法

准确称取蒽酮试剂0.1g，加入100ml98％浓硫酸，混匀后即为蒽酮试剂。配制10mg/ml的无水葡萄糖溶液：准确称取0.1g分析纯的无水葡萄糖(预先在105℃干燥至恒重)，用蒸馏水溶解后移至100ml容量瓶中，并用蒸馏水洗称量瓶数次，以使全部葡萄糖移入容量瓶中，最后定容到刻度，摇匀，其浓度为1000mg/L。然后分别取0.5、1、2、3、4ml定容至100ml，浓度分别为5、10、20、30、40mg/L。

绘制葡萄糖标准曲线：分别量取蒽酮试剂4ml和标准葡萄糖溶液1ml置于具塞试管中，迅速浸入冰浴中冷却，然后在沸水浴上加热10min，冰浴冷却，620nm下，用分光光度计测OD值(1ml蒸馏水为空白对照)。根据OD值从蒽酮法测定的葡萄糖标准曲线上求出葡萄糖的含量；

利用蒽酮法测定吸光值，绘制标准曲线。

y＝ax+b

其中y为葡萄糖含量，x为吸光度，最终槐糖脂的计算公式为：

槐糖脂含量＝反应液中葡萄糖的含量×稀释倍数1.91

槐糖脂测定步骤：取发酵液1ml，加入等体积1ml乙酸乙酯，混匀后静置5min，5000r/min离心5min；取10ul加入具塞试管中，水浴蒸发掉乙酸乙酯，正己烷洗涤、蒸干；加入1ml水、4ml蒽酮试剂，沸水浴10min，冰水冷却；620nm测OD值。根据OD值带入标准曲线算出槐糖脂含量。蒽酮法测定的是槐糖脂总含量。

2)液质联用(LC-MS)法：

LC-MS检测设备及条件：仪器为1100型高效液相色谱/G1969A型电喷雾飞行时间质谱联用仪(HPLC/ESI-TOF/MS)(美国Agilent公司)，并配有二极管阵列(DAD)检测器；色谱柱：Diamonsil C18柱，规格为150mm×4.6mm×5μm。柱温为30℃，进样量为1μL，检测波长为UV 207nm，流动相A：0.5％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱条件:0min，50％B；5min，50％B；30min，60％B；50min，100％B；60min，100％B。流速为0.4mL/min。无分流进入质谱。质谱采用电喷雾正离子模式；扫描范围：m/z200～900；毛细管电压：3.5kV；喷雾气压：344.5kPa；干燥气体：高纯N₂，气体流速：11.0L/min；气体温度：350℃；裂解电压：100V；锥孔电压：65V；参比溶液：m/z121.05，922.01；分辨率：9500±500(922.01)

槐糖脂标品制备：采用已填充硅胶介质的色谱柱分离纯化发酵后自然沉降的槐糖脂粗品。具体操作如下：将100g充分活化的硅胶装到色谱柱中(Φ1.5*40cm)。将5g槐糖脂粗品溶于有机溶剂乙酸乙酯中，后填充到层析柱的顶端。洗脱剂为氯仿和甲醇(95：5，v/v)混合溶液，洗脱时间约为1h。每隔5分钟收集一次流出液，每段流出液用乙酸乙酯萃取2-3次，最后用无水硫酸钠进行干燥，旋蒸法除去溶剂后转移至色谱小瓶中，进行LC-MS测定，相应的色谱图和分子结构及含量可作为标定不同结构槐糖脂的标准品使用。

经过LC-MS分离得到的槐糖脂标品主要有以下几种结构：

表1液质鉴定槐糖脂结构

实施例1

槐糖脂发酵液1L(其中槐糖脂含量约410g/L)，加入3L水充分稀释发酵液，然后通过200nm陶瓷膜进行过滤除菌，收集滤液，得到约3.2L无菌液滤液。

使用碱性阴离子吸附树脂335对滤液进行吸附(树脂装填长径比为5：1，树脂装填量为250mL)，滤液进液速度为1.25L/h，将3.2L滤液全部吸附完毕。把树脂先用1L去离子水洗涤一次，然后用1.5％NaOH水溶液进行洗脱，洗脱剂速度为1.25L/h，洗脱剂用量为5L，收集洗脱液，进行减压蒸发得到约380g溶液，为A产品，蒽酮法测定槐糖脂含量为34.8％，液相法测定酸型占总含量的99.9％。

树脂吸附后的滤液约3L，加入海藻酸钠15g，搅拌均匀，静置约1小时固体全部析出，过滤分离固体，滤液减压蒸发除去水，得到约300g固体，为B产品，蒽酮法测定槐糖脂含量为90％，液相测定内酯型占总含量的98.86％，发酵液及A\B产品中酸型和内酯型槐糖脂含量如下表2所示。经过两步分离后槐糖脂总收率大于98％。

表2分离产品中不同糖脂比例

实施例2

槐糖脂发酵液2L(其中槐糖脂含量约350g/L)，加入10L水充分稀释发酵液，然后通过200nm陶瓷膜进行过滤除菌，收集滤液，得到约11L无菌液滤液。

使用碱性阴离子树脂315对滤液进行吸附(树脂装填长径比为20：1，树脂装填量为420mL)，滤液进液速度为0.42L/h，将11L滤液全部吸附完毕。树脂先用1L去离子水洗涤一次，然后用0.5％KOH水溶液进行洗脱，洗脱剂速度为8.4L/h，洗脱剂用量为21L，收集洗脱液，进行减压蒸发，得到约390g溶液，为产品A，蒽酮法测定槐糖脂含量为51％，其中酸型占比为99.1％。

吸附后的滤液加入聚丙烯酰胺10g，搅拌均匀，静置约半小时固体全部析出，过滤分离固体，滤液减压蒸发除去水，得到固体580g，为产品B，槐糖脂含量为87％，内酯型占比为98.8％。发酵液及A\B产品中酸型和内酯型槐糖脂含量如下表3所示。两步槐糖脂回收率为97.6％。

表3分离产品中不同糖脂比例

实施例3

槐糖脂发酵液1.5L(其中槐糖脂含量约420g/L)，加入6.5L水充分稀释发酵液，然后通过200nm陶瓷膜进行过滤除菌，收集滤液，得到约7.5L无菌液滤液。

使用101大孔树脂对滤液进行吸附(树脂装填长径比为10：1，树脂装填量为150mL)，滤液进液速度为0.45L/h，将7.5L滤液全部吸附完毕。树脂先用500mL去离子水洗涤一次，然后用乙醇进行洗脱，洗脱剂速度为1.5L/h，洗脱剂用量为1.5L，收集洗脱液，进行减压蒸发，得到约800g溶液，蒽酮法测定槐糖脂含量为41％，其中酸型占比为98.7％。

树脂吸附后的滤液加入明胶20g，搅拌均匀，静置1小时，过滤分离出固体，滤液减压蒸发蒸干水，得到320g固体，蒽酮法测定槐糖脂含量为93％，其中内酯型占比99.5％。发酵液及A\B产品中酸型和内酯型槐糖脂含量如下表4所示。两步槐糖脂的收率为97.7％。

表4分离产品中不同糖脂比例

对比例1

槐糖脂发酵液2L，槐糖脂含量约420g/L，通过200nm陶瓷膜进行过滤除菌，收集滤液，得到约1.5L滤液，用1.5L乙酸乙酯分两次萃取，合并萃取液，蒸干溶剂，得到1000g固体，蒽酮法测定槐糖脂含量为74.3％，其中酸型占比38.9％，其余为内酯型，收率为90％。发酵液及产品中酸型和内酯型槐糖脂含量如下表5所示。不同结构槐糖脂如下表所示。

表5分离产品中不同糖脂比例

Claims

1.一种发酵法生产槐糖脂的产物分离纯化方法，包含以下步骤：

(2)无菌液通过树脂进行吸附，吸附结束后用洗脱剂对树脂进行洗脱，收集洗脱液，浓缩得到酸型槐糖脂产品；所述的树脂选自大孔树脂、碱性阴离子树脂；

(3)收集经树脂吸附后的无菌液，加入絮凝剂，分离沉淀物和溶液，溶液除水，得到内酯型槐糖脂产品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)结束发酵后，用3-5倍体积水稀释发酵液，然后用过滤方式除菌体，得到无菌液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的树脂选自大孔树脂、碱性阴离子树脂，所述大孔树脂为D101型大孔吸附树脂，所述碱性阴离子树脂为丙烯酸系弱碱性阴离子树脂；所述树脂的装填长径比为5：1-20：1；所述树脂的体积为待吸附无菌液总体积的1/50-1/10。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述树脂的装填长径比为8：1-10：1。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中无菌液进行吸附时，流量控制为每小时1-5倍树脂体积。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中无菌液进行吸附时，流量控制为每小时2-3倍树脂体积。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中吸附结束后，用洗脱剂对树脂进行洗脱，碱性阴离子树脂的洗脱剂为浓度0.1-5wt％的氢氧化钠和/或氢氧化钾水溶液，大孔树脂的洗脱剂为乙醇。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，碱性阴离子树脂的洗脱剂为浓度0.5％-1.5wt％的氢氧化钠和/或氢氧化钾水溶液。

9.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，洗脱剂用量为20-50倍树脂体积，洗脱剂流量为每小时5-20倍树脂体积。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，洗脱剂流量为每小时8-10倍树脂体积。

11.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中洗脱液用减压蒸发的方式进行浓缩，最终得到槐糖脂浓度为30-50wt％的酸型槐糖脂产品，酸型槐糖脂比例不低于98％。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)收集经树脂吸附后的无菌液，加入絮凝剂，静置待固体沉淀析出完毕后，分离沉淀物和液体，液体减压蒸发除去溶剂水，得到内酯型槐糖脂产品，内酯型槐糖脂比例不低于98％。

13.根据权利要求1或12所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的絮凝剂选自聚丙烯酸钠、聚丙烯酰胺、明胶、海藻酸钠中的一种或多种，絮凝剂加入的质量为经树脂吸附后的无菌液质量的0.1-1％。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，絮凝剂加入的质量为经树脂吸附后的无菌液质量的0.3-0.5％。

15.根据权利要求1、2、3、7、12中任一项所述的方法，其特征在于，酸型和内酯型槐糖脂总收率不低于92％。