CN117642219A

CN117642219A - 分离和/或纯化糖脂的方法

Info

Publication number: CN117642219A
Application number: CN202180098235.7A
Authority: CN
Inventors: K·梅斯; S·罗伊兰斯; W·苏塔尔特; E·雷丹特; B·艾维拉伊特
Original assignee: Amu Feixing Co ltd
Current assignee: Amu Feixing Co ltd
Priority date: 2021-03-30
Filing date: 2021-03-30
Publication date: 2024-03-01
Also published as: EP4313350A1; CA3215734A1; JP2024513221A; WO2022207086A1

Abstract

本发明涉及从含糖脂组合物中分离和/或纯化糖脂的方法，其中所述方法包括以下步骤：提供具有吸附剂的加工单元，其中所述吸附剂是聚合树脂；使所述含糖脂组合物与所述吸附剂接触以用负载材料负载所述聚合树脂，且其中所述负载材料包含至少一定量的糖脂；处理所述吸附剂以回收负载于所述吸附剂上的所述负载材料内存在的预定的所需类型的糖脂，其中所述处理包括：使所述吸附剂与预选回收液接触以从所述吸附剂上的所述负载材料中回收所述预定的所需类型的糖脂；从所述加工单元中获得所述回收的预定的所需类型的糖脂。所述方法可用作针对例如食品或饮料行业、或化妆品或制药行业中的生物表面活性剂的有效纯化方法。

Description

分离和/或纯化糖脂的方法

技术领域

本发明涉及从含糖脂组合物中分离和/或纯化糖脂的方法。所述方法可用作针对例如食品、饲料或饮料行业、或化妆品、洗涤剂、工业和/或制药行业中的生物表面活性剂的有效纯化方法。

背景技术

生物表面活性剂诸如糖脂具有大的市场潜力，然而，其批量应用的成功性受限于经济限制和纯度要求。对于下游加工而言，高收率、可扩展性、经济可行性是至关重要的，同时对于特定应用，纯度无疑是一个重要方面。因此，生物技术产品的制造成本的大部分通常归因于下游加工成本和产品损耗。

生物表面活性剂下游加工中的主要挑战是含有生物表面活性剂的混合物的复杂度。取决于生物表面活性剂是通过发酵、生物催化、植物生物质或化学合成产生的，复杂混合物中将存在不同种类的杂质。这些混合物可包含微生物细胞、蛋白质、酶、盐、离子、肽、碳水化合物、脂肪醇、二醇、脂肪酸、油和脂肪、非期望的生物表面活性剂副产物或前体等。蛋白质、肽、酶当留在最终产品中时可引起过敏反应，同时基因修饰微生物和有毒催化剂不应在最终产品中检测到。同样地，亲脂性化合物不应留在最终产品中，但众所周知难以将两亲化合物诸如生物表面活性剂与通常存在于最终混合物中的亲脂性化合物分离，因为它们经常被用作生产生物表面活性剂的底物且往往过量添加。不同类型的杂质(例如亲水与疏水污染物)在纯化方法中通常要求不同的加工单元，这造成生物表面活性剂的完全纯化缓慢、昂贵并且在加工单元之间可造成产品损耗。

所需纯度取决于目标产品的应用。制药、食品和化妆品应用要求极高的纯度，而诸如(工业)洗涤剂、环境修复和农业的应用领域可具有较宽松的要求。大多数情况下，必须除去可导致可能的过敏反应的任何细胞、细胞碎片诸如DNA和RNA和蛋白质/肽。取决于应用，甚至可有必要分离糖脂的混合物，纯化特定的糖脂同源物(congener)。针对生物表面活性剂(诸如糖脂)的现有和适用的纯化方法通常是诸如沉淀、融解(melting)、洗涤、溶剂提取、膜过滤、泡沫分离、结晶、离子交换的技术和方法的组合。然而，这类纯化方法要求不同的加工单元和方法步骤，从而在各个步骤中导致产品损耗。

发明内容

本发明的目的是提供以时间和空间高效的方式从各种类型的混合物中分离糖脂，同时实现预选的终产物纯度和高回收/收率并有效使用资源的技术。

因此，本发明提供根据权利要求1的方法。更具体而言，从含糖脂组合物中分离和/或纯化糖脂的方法，其中所述方法包括以下步骤：-提供具有吸附剂(R)的加工单元，其中所述吸附剂是聚合树脂；-使含糖脂组合物与吸附剂接触以用负载材料(LM)负载聚合树脂，且其中所述负载材料包含至少一定量的糖脂(LM1)；处理吸附剂以回收预定的所需类型的糖脂(PLM1)，其中所述处理包括：使吸附剂与预选回收液(RL)接触以从吸附剂上的负载材料中回收预定的所需类型的糖脂；从加工单元获得回收的预定的所需类型的糖脂(PLM1)。

本发明基于以下见解：通过使用精心设计的加工单元，可选择预定类型的糖脂，并且从添加至加工单元的复杂混合物中分离和/或纯化所述类型的糖脂。已发现聚合树脂可从提供至加工单元的混合物中吸附某些种类的组分和至少一定量的糖脂。由于聚合树脂的吸附能力，所述组分被负载于吸附剂上并且形成聚合树脂上的负载材料。随后，通过用预选回收液处理负载材料吸附其上的吸附剂，可从负载于吸附剂上的材料中回收预定的所需类型的糖脂。以这种方式，可从提供至加工单元的混合物中获得所需类型的糖脂，以可利用极少或无额外的下游加工步骤实现高纯度和回收的方式。以这种方式，可获得大幅减少的产品损耗和高纯度，这适合于大多数应用，而不需要导致最终回收/收率低并因此经济次优的繁琐、缓慢且资源密集型的额外的处理纯化步骤。

优选该方法还包括以下步骤：-用洗涤液(WL)洗涤吸附剂以从吸附剂中分离至少非负载材料(NLM)；已发现通过使用洗涤液可从吸附剂中除去非负载材料。

洗涤液可理解为用来从加工单元中除去非负载材料NLM(即未吸附于吸附剂的非负载材料)的液体，示例性洗涤液为RO水，但同样地可由包含一种或多种能够从加工单元中除去非负载材料的洗涤液的溶液组成。

回收液可理解为用来从吸附剂中解吸和/或除去材料的液体。回收液通常用来解吸和回收所需糖脂。回收液可由单一液体组分组成或由包含一种或多种能够从吸附剂中解吸和/或除去材料的回收液的溶液组成。

处理液可理解为用来处理吸附剂以可从吸附剂中除去吸附于吸附剂的次要组分(诸如蛋白质、颜料、脂肪酸、盐、糖、细胞)的某些部分的液体和/或作为用来使负载材料改性(例如通过部分水解负载材料或例如通过在负载材料上进行诸如糖基化的一种或多种特定化学改性)的处理液。处理液可由单一液体组分组成或由包含一种或多种能够使负载材料改性和/或从吸附剂中除去材料的处理液的溶液组成。

本文所述的负载容量可理解为结合至吸附剂的目标组分诸如所需类型的糖脂的量除以吸附剂的总量。所述量通常以质量％表示，例如吸附于聚合树脂的kg所需糖脂除以单位为kg的聚合树脂的质量。

产品纯度可理解为目标组分诸如所需类型的糖脂的量除以最终产品中存在的组分的总量，并且通常以质量％表示。

在本申请各处提及负载材料和非负载材料。在本发明的上下文内，负载材料是吸附于吸附剂上的材料。相反地，非负载材料未吸附于吸附剂上。

优选地，处理步骤还包括以下步骤：-使吸附剂与一种或多种处理液(TL)接触以使负载于吸附剂上的至少一定量的糖脂改性和/或从吸附剂中除去一种或多种次要组分(NPLM2)。以这种方式，可除去所述次要组分并纯化所需类型的糖脂和/或通过使负载于吸附剂上的至少一定量的糖脂改性可将负载材料转化成所需类型的糖脂。在一些情况下，将洗涤液和处理液混合(例如将RO水与异丙醇混合)，使得可一次性除去次要组分和非负载材料。优选地，一种或多种处理液(TL)选自：极性溶剂，非极性溶剂，碱性溶剂，酸性溶剂，中性溶剂，或它们的组合。更具体而言，优选一种或多种处理液(TL)选自：甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，己烷，庚烷，乙酸乙酯，KOH，NaOH，NH₄OH，水，RO水，或它们的组合。通过选择处理液，可处理吸附剂上的负载材料并以预定义的方式处理所述负载材料，如将在本文中进一步描述的。

优选预选回收液(RL)选自包含以下的组：离子液体，液态二氧化碳，超临界溶剂，乙酸乙酯，甲醇，异丙醇，丙酮，乙醇，庚烷，叔丁基甲醚，二乙醚，乙腈，苯氧乙醇，苄醇，苯乙醇，氢化肉桂醇，四氢糠醇，二甲基异山梨醇，水杨酸甲酯，丁香酚，芳樟醇，己醇，冰乙酸，碳酸二甲酯，某些二醇醚诸如二丙二醇甲醚和1-丙氧基2-丙醇，和乳酸酯，包括乳酸乙酯、乳酸丁酯、乳酸戊酯、乳酸乙基己酯，或它们的组合。所述液体已发现具有或预期具有从吸附剂中除去预定类型的糖脂的所需能力。优选地，糖脂(GL)选自包含以下的组：糖基化脂肪酸，糖基化脂肪醇，糖基化类胡萝卜素，糖基化藿烷，糖基化固醇，糖基化仲康酸，甘油糖脂，鞘糖脂，脂多糖，酚糖脂，糖肽脂，核苷脂。

在实施方案中，糖脂(GL)选自包含以下的组：槐糖脂，鼠李糖脂，纤维二糖脂，木糖脂，海藻糖脂，甘露糖赤藓糖醇脂，葡萄糖脂，脂肪醇葡糖苷，烷基聚葡糖苷，烷基槐糖苷，(阴离子)烷基葡糖苷，(阴离子)烷基戊糖苷，蔗糖酯，山梨醇酯，甲基葡糖苷酯，脂肪酸甲基葡糖酰胺，寡糖脂肪醇。

在实施方案中，糖脂(GL)选自乙酰化和/或非乙酰化形式的酸性槐糖脂(ASL)、内酯型槐糖脂(LSL)。

在优选的实施方案中，糖脂(GL)选自乙酰化和/或非乙酰化形式的以下者：bola槐糖脂(BSL)，bola槐糖苷(BSS)，烷基槐糖苷(ASS)，醇葡糖苷(AGS)，bola槐糖苷(BSS)，蔗糖酯(SE)，bola葡糖苷(BGS)，烷基葡糖苷(ALGS)，葡萄糖脂，或它们的组合。

在本发明的实施方案中，处理步骤包括：使吸附剂(R)与具有第一浓度c1的处理液的处理溶液(TS2)接触；使吸附剂(R)与具有第二浓度c2的回收液的回收溶液(RS2)接触；其中第一浓度c1使得负载材料内基本上全部的糖脂(LM1)都未从吸附剂中除去，且其中第二浓度c2使得负载材料内基本上全部的糖脂(LM1)从吸附剂中除去。以这种方式，可首先处理吸附剂以除去不同于所需糖脂的其它组分，并随后利用回收液回收所需糖脂。在一些实施方案中，处理液和回收液可为相同的。在所述实例中，本发明的处理步骤包括：使吸附剂与具有第一浓度c1的处理液的处理溶液接触；使吸附剂与具有第二浓度c2的回收液的回收溶液接触；其中第一浓度低于第二浓度，使得处理液的c1足够低，使得负载材料内的糖脂未从吸附剂中有效除去，且回收液的c2足够高以从吸附剂中有效除去负载材料内的糖脂。通过选择回收液的浓度，可利用使用较低浓度c1的回收溶液选择并且除去吸附剂中的某些次要组分，其中所述较低浓度不从吸附剂中洗脱大量的所需糖脂。以这种方式，可除去杂质(诸如特定的蛋白质和颜料)，使得所需糖脂主要以纯化方式留在吸附剂上。然后，可通过具有较高浓度c2的回收液获得所述纯化的所需糖脂。在处理液和回收液相同的优选的实施方案中，利用具有低于45％的浓度、更优选10-35％的浓度、最优选15-30％的浓度的回收液除去杂质。优选地，回收液包含用RO水稀释的异丙醇。

在本发明的实施方案中，处理液和回收液都是以下中的一者：极性溶剂，非极性溶剂，碱性溶剂，酸性溶剂，中性溶剂，或它们的组合。

在本发明的方面中，该方法用来从吸附剂中除去负载和/或非负载的一种或多种次要组分中的第一部分，其中所述第一部分选自诸如蛋白质、颜料等的杂质或不期望类型的糖脂。以这种方式，从所需糖脂中除去了所述一种或多种次要组分(通常为杂质或其它类型的糖脂)。

在本发明的实施方案中，处理步骤包括：使吸附剂与第一处理液、优选碱性试剂接触，以至少部分地使负载于吸附剂上的一定量的糖脂水解/转化。以这种方式，可通过酯官能团的部分水解将某些类型的糖脂、诸如包含例如酯官能团的糖脂转化成所需类型的糖脂。由于转化，可由此产生或可纯化所需类型的糖脂。在本发明的方面中，可使用根据本发明的方法将乙酰化糖脂转化成非乙酰化糖脂。在另一个方面中，可使用该方法将乙酰化和/或非乙酰化的内酯型槐糖脂转化成乙酰化和/或非乙酰化的酸性槐糖脂。在另一个方面中，可使用该方法将乙酰化和/或非乙酰化的bola槐糖脂转化成乙酰化和/或非乙酰化的酸性槐糖脂和乙酰化和/或非乙酰化的槐糖。

在本发明的实施方案中，处理步骤包括使吸附剂与第二处理液、优选非极性溶剂、更优选非极性有机溶剂接触，以从负载材料中除去该一种或多种次要组分的第二部分；其中所述第二部分选自非极性组分诸如游离脂肪酸、脂肪醇、烷烃和/或油等。优选地，处理液选自己烷、庚烷或甲基叔丁醚。优选地，处理液选自己烷或庚烷。第二处理液可还与极性溶剂诸如甲醇、丁醇、水、异丙醇或它们的组合混合。通过使用所述第二处理液，可除去第二部分以纯化负载于吸附剂上的所需糖脂。

在本发明的实施方案中，处理步骤包括使吸附剂与第三处理液、优选极性溶剂接触，以从负载材料中除去该一种或多种次要组分的第三部分；其中所述第三部分选自亲水杂质诸如糖、蛋白质、碳水化合物、盐等。通过使用所述第三处理液，可除去第三部分使得可纯化负载于吸附剂上的所需糖脂。

前述处理步骤中的每一者可独立进行或与一个或多个所述处理步骤组合进行。在优选的实施方案中，进行了所有处理步骤。通过选择所述第一、第二和第三处理液，可从提供至加工单元的混合物以及从吸附剂上的负载材料的某些部分中选择性地除去某些部分。以这种方式，可使用加工单元将所需糖脂分离和/或纯化至高纯度，优选纯度高于90％、甚至更优选高于93％，甚至无需依赖进一步的纯化步骤。

在本发明的实施方案中，吸附剂是中性聚合树脂。以这种方式，由于疏水相互作用，所需糖脂结合至中性聚合树脂。中性聚合树脂的总电荷可为中性的，并且所需糖脂结合至聚合树脂无需离子交换。可通过改变温度改变所需糖脂的疏水相互作用或亲和性。优选吸附剂是聚合树脂并且选自包含聚甲基丙烯酸酯树脂、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯树脂或它们的组合的组；具体而言选自：苯乙烯-二乙烯基苯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯，丙烯酸酯，聚苯乙烯，交联的聚苯乙烯，甲基丙烯酸类，多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯。已发现所述选定树脂具有所需的与糖脂的亲和性，使得在接触中至少一定量的糖脂结合至聚合树脂。由于高亲和性，可实现高负载容量。

在本发明的实施方案中，加工单元具有输入流(S1)和输出流(S2)；优选通过经由所述输入流将洗涤液(WL)输入至加工单元并且直至输出流参数在输入流参数的预定范围内来进行洗涤步骤。在实施方案中，通过经由所述输入流将处理液(TL)输入至加工单元并且直至输出流参数在输入流参数的预定范围内来进行处理步骤。例如，输入RO水以除去亲水杂质诸如糖、蛋白质、肽、多元醇、有机酸、无机酸、碳水化合物、盐。在实施方案中，所述参数选自：电导率，折射指数，pH，蛋白质含量，糖含量，试验拭子值或它们的组合。自然地，当例如考虑电导率时，进行洗涤步骤或处理步骤直至输出流的电导率达到低于输入流电导率的150％的值。

在本发明的实施方案中，该方法还包括以下步骤：-使回收液蒸发；-如果存在的话，使处理液蒸发；通过蒸发用于从吸附剂中回收所需类型糖脂的回收液和/或处理液，可除去且优选再利用所述回收液和/或处理液。以这种方式，可获得高纯形式的所需糖脂。已发现可达到高于98质量％的纯度。在本发明的实施方案中，该方法包括再循环回收液(RL)、处理液(TL)和任选的洗涤液(WL)中的至少一者的步骤。实践测试已显示可通过再循环回收液和/或处理液和任选的洗涤液进一步有效地使用资源。

优选使回收液(RL)、处理液(TL)和任选的洗涤液(WL)中的至少一者再循环。以这种方式，可改进资源的有效使用。

在实施方案中，含糖脂组合物是植物提取或发酵、酶促、植物生物质或化学生产方法的终产物。在实施方案中，该方法与发酵方法组合进行；优选在原位产物回收装置中与发酵方法组合。

根据实施方案，该方法以分批模式、连续模式或半连续模式进行。优选连续模式或半连续模式。

根据实施方案，含糖脂组合物经过包含吸附剂的反应器。

根据实施方案，含糖脂组合物经过用聚合吸附剂填充的柱。

附图说明

现在具体参考附图，要强调的是所示详情是以举例方式并且仅出于说明性论述本发明的不同实施方案的目的。呈现它们是出于提供认为是最有用的东西和易于描述本发明的原理和概念方面的目的。在这点上，没有尝试示出比基本理解本发明所需的更详细的本发明的结构细节。描述结合附图使本领域技术人员易于明白在实践中可如何体现本发明的若干形式。

图1示出了包括方法步骤的流程图。

图2示出了方法的示例性实施方案。

具体实施方式

本申请涉及从含糖脂组合物中分离糖脂的方法。通常，所述组合物来自生物来源。所述方法基于根据权利要求1的步骤，并且将在下文进一步解释。

分离的糖脂可用作生物表面活性剂，并且与通常来自化石的经典对应物(counterparts)相比显示出独特的性质，诸如温和的生产条件、更低的毒性、更高的生物降解性以及皮肤和环境相容性、(完全)生物基性质等。微生物生物表面活性剂特别地具有一些优点，因为它们可由当地的(废弃)生物质流产生，由此避免了依靠与清洁问题相关的热带(例如棕榈油)和/或化石资源。这些众多优点已促使不仅在食品、农用化学品、化妆品和制药行业，而且在环境保护和节能技术中的应用。虽然生物表面活性剂具有大的市场潜力，但其批量应用的成功性受限于经济和技术限制和一些市场的严格纯度要求。在上游加工中，要求廉价原料的选择性的和有效的(底物的高收率)转化以及高生产率。对于下游加工，高收率(回收)是至关重要的。在许多应用中，所需糖脂的纯度是重要的，并且应除去次要组分诸如过敏原。在许多情况下，生物技术产品的制造成本的大部分可归因于下游加工成本和对应产品损耗。

生物表面活性剂的下游加工中的一些主要挑战与通常含有相对低的所需产品浓度的混合物的复杂度有关。取决于生物表面活性剂是通过发酵、生物催化、植物生物质或化学合成产生的，混合物中将存在不同的杂质。各种生产方法通常要求亲水底物(例如甘油、葡萄糖、蔗糖等)以及疏水底物(例如烷烃、脂肪酸、三酰基甘油酯、脂肪醇等)以产生糖脂结构。尽管一些生物化学生产方法诸如发酵生产方法不严格要求提供亲水底物和疏水底物两者，但底物的组合通常产生更高的生产率，使得这是优选选项。

发酵生产方法通常产生复杂混合物，因为发酵液可含有底物、细胞、盐、碳水化合物、多元醇、蛋白质、肽以及细胞内和细胞外代谢物等。疏水底物例如油和脂肪酸通常被所产生的生物表面活性剂溶解于发酵液中。

因此，加工生物表面活性剂的主要挑战在于混合物的复杂度，其通常含有相对低的产品浓度，并且在所述混合物中存在大量杂质。需要除去杂质诸如任何细胞、碎屑、DNA、RNA和蛋白质。特别是由于由潜在地来源于GM生物体的蛋白质、肽或酶和DNA/RNA引起的可能的过敏反应。迄今为止，由于相当低效的方法、树脂的低吸附容量、装置的尺寸以及巨大的投资和运行成本，特定的分离技术(诸如色谱和/或吸附)通常主要限于在研发实验室装置中分离和纯化含低浓度的生物表面活性剂的混合物。

经常地，本领域中指出现有技术吸附剂的低吸附容量和缺乏将混合物中的生物表面活性剂与其它组分分离的能力、树脂的高成本和所需装置的大尺寸使得吸附不适合于大多数应用。另外，尚未报道使用吸附作为纯化以下者的纯化方法：(发酵产生的)糖脂，诸如乙酰化或非乙酰化形式的bola槐糖脂(BSL)、bola槐糖苷(BSS)、烷基槐糖苷(ASS)、醇葡糖苷(AGS)、蔗糖酯(SE)、bola葡糖苷(BGS)、烷基葡糖苷(ALGS)、葡萄糖脂。

在本发明中，发明人描述了用于从包含糖脂的混合物中分离糖脂、以高回收产生高纯度产品的改进方法，并由此开发了将分离的糖脂用于若干应用的用途，其中过敏反应风险被最小化。另外，可利用灵活的洗涤和/或处理步骤改变分离糖脂的所需纯度。此外，可在纯化过程中使利用本发明的方法分离的糖脂进一步改性，这无需在(下游)加工单元中进行额外的加工和/或纯化步骤(可为当以常规方法衍生并随后纯化糖脂时所需的)。因而，本发明的方法产生了转化和/或分离生物表面活性剂的更有效的方法。

将使用图1中所示的步骤流程图和图2中所示的工艺流程图更详细地解释根据本发明的方法的示例性实施方案。加工单元包含聚合树脂作为吸附剂R。

除非在上下文中另外描述或暗示，如本文中所使用的，术语“复杂混合物”、“含糖脂组合物”、“输入混合物”可互换使用。

如图1的步骤流程图中所示，该方法可始于平衡步骤10。洗涤液WL通常用来平衡聚合树脂。优选的洗涤液是反渗透水(也称为RO水)。洗涤液WL通常以3至5个床体积添加。另外地或作为替代，其中聚合树脂经受树脂平衡液REL来进行树脂平衡步骤11。通常平衡液与后续在回收所需类型的糖脂的过程中使用的回收液类似或相同。使用洗涤液来从加工单元中除去非负载材料NLM(即未吸附于吸附剂上的非负载材料)。复杂混合物IM包含糖脂GL并且被提供至加工单元。可利用预处理步骤15，诸如微滤步骤、重力分离步骤或离心步骤预处理混合物。糖脂负载于吸附剂20上，并且残余非负载材料可经由废物流60除去，可在其间添加任选的再循环流来有效使用资源。

在负载步骤20后，可使用处理液TL使吸附剂经受一系列处理步骤(31至34)以从吸附剂中除去次要组分NPLM2。除去的典型次要组分选自包含以下的组：离子，盐，糖，(寡)糖，细胞，油，脂肪酸，蛋白质，肽，氨基酸，残余疏水底物和/或疏水物质，颜料或它们的组合。

可经由再循环流62将处理液TL添加回加工单元以实现有效的资源使用。处理液TL优选选自：异丙醇，甲醇，乙醇，丙醇，丁醇，己烷，庚烷，乙酸乙酯，NaOH，NH₄OH，水，RO水或它们的组合。通过选择预定处理液TL，可从吸附剂中除去负载材料的预定部分NPLM2。以这种方式，可纯化所需糖脂。然后，可通过回收液RL回收所需糖脂。当在纯化步骤42中除去回收液RL时，可以高纯形式61获得所需糖脂。

本发明的方法的特征是可存在数个处理步骤，并且所有处理步骤可在同一加工单元上进行。在所述实例中，可用水、缓冲溶液、溶剂或它们的混合物处理糖脂吸附其上的吸附剂以除去特定杂质。水性洗剂通常足以除去未吸附于吸附剂上的部分中存在的亲水杂质。这类杂质是各种有机或无机盐和酸，糖，碳水化合物，多元醇，蛋白质，肽和各种颜料/彩色组分。用缓冲溶液洗涤可改进水溶性差的化合物的洗去或帮助确保产品的稳定性。用水-溶剂混合物(诸如但不限于甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮)洗涤可协助洗去杂质，否则杂质会弱吸附于吸附剂上。

在处理步骤31中，用处理溶液(TS2)处理吸附剂以从吸附剂中除去第一部分F1。已发现当正常能够从吸附剂中洗脱所需糖脂的处理液具有比用来从吸附剂中洗脱所需糖脂更低的浓度时，可从吸附剂中除去杂质诸如蛋白质和彩色颜料而所需糖脂主要保留在吸附剂上。以这种方式，可纯化所需糖脂。即因为第一浓度不足够高来有效地解吸所需糖脂，所述所需糖脂保留在吸附剂上。优选的处理溶液是醇-溶剂溶液，其中醇是优选以20-40体积％、更优选24-34体积％、最优选25-30体积％的浓度稀释于水性溶液诸如水中的C1-C7醇。优选的处理溶液是丙醇，甚至更优选异丙醇。随后可在回收步骤40中通过用回收溶液RS2回收所需类型的糖脂PLM1除去所需糖脂。回收溶液可类似于处理溶液，但具有足够高以除去所需糖脂的更高浓度。工艺方面，当使用类似或相同类型的溶液时是有利的。

本发明人还已发现，吸附剂可经受处理步骤32，其中用第二处理液TL2、优选非极性有机溶剂处理吸附剂。以这种方式，可使用非极性有机溶剂从吸附剂中除去包含非极性组分的第二部分F2。以这种方式，可从吸附剂中除去诸如游离脂肪酸、脂肪醇、二醇、二羧酸、三酰基甘油酯、油等组分，同时所需糖脂保留在吸附剂上。通过除去第二部分，随后可通过使吸附剂经受回收液以回收所需糖脂，获得更纯形式的所需糖脂。己烷和庚烷是优选的有机溶剂。利用糖脂在其中可溶性差的非极性溶剂(诸如但不限于己烷、庚烷、环己烷和二乙醚)的纯形或混合物进行处理可用于洗出吸附于聚合吸附剂的杂质。这特别适用于分离疏水底物诸如游离脂肪酸、油、脂肪醇、脂肪、二醇、二羧酸、三酰基甘油酯等，其中一些在糖脂生产中被用作底物，和/或由微生物生产菌株共同产生，以防这些杂质与糖脂共同洗脱。

另一个处理步骤33可用于纯化所需糖脂。本发明人已发现，可通过在处理步骤33中用第三处理液TL3、优选极性溶剂诸如RO水处理吸附剂来获得所需糖脂的进一步纯化。在这种情况下，已发现还可从吸附剂中除去亲水杂质诸如糖、蛋白质、肽、有机酸、多元醇、碳水化合物、盐等，同时所需类型的糖脂仍负载于吸附剂上。

还意外地发现，当所述糖脂吸附于吸附剂上时，处理步骤34可用于糖脂的改性和/或转化。这种改性的实例包括化学水解酯键和糖苷键；或酯化、糖基化和其它化学改性，诸如本领域中所述的(生物)化学衍生路线，有但不限于：糖基化，酰化，烷基化，酰胺化，胺化，芳基化，生物素酰化，15氨甲酰化，羰基化，环加成，偶联反应，醚化，酯化，糖基化，卤化，金属化，复分解，腈形成，烯化，氧化，氧膦化(phosphinylation)，膦酰化(phosphonylation)，磷酸化，季铵化，重排反应，还原，甲硅烷基化，硫醇化，硫化，或它们的任何组合，针对例如但不限于ω-季铵SL(QASL)、ω-SS氧化胺、ω-SS胺、ω20bola两亲物SS等，诸如像由(Delbeke，2016；Delbeke等人，2018；Delbeke、Lozach等人，2016；Delbeke、Movsisyan等人，2015；Delbeke、Roelants等人，2016；Delbeke、Roman等人，2015；D.Develter和Fleurackers，2008；Gross等人，2013；Van Bogaert等人，2011)描述的本领域中针对野生型SL所述的。这类改性可通过使含有(生物)催化剂(任选地与(生物)化学反应中所需给体/受体组合)的水性溶液或溶剂经过吸附剂来进行，在这期间(生物)催化剂与吸附的糖脂反应。在优选的实施方案中，吸附剂和其上的负载材料与碱剂接触以使负载材料中存在的一定量的糖脂部分改性。以这种方式，可使用改性和/或转化以通过将吸附剂上其它类型的糖脂转化成所需类型的糖脂来进一步纯化所需类型的糖脂。由于转化，可形成或可纯化所需类型的糖脂。可使用该方法将乙酰化糖脂转化成非乙酰化糖脂，和/或将内酯型糖脂转化成酸性糖脂。非乙酰化内酯型槐糖脂可转化成乙酰化和/或非乙酰化酸性槐糖脂。在另一个方面中，可使用该方法将乙酰化和/或非乙酰化的bola槐糖脂转化成乙酰化和/或非乙酰化的酸性槐糖脂以及乙酰化和非乙酰化的槐糖。

图2示出了方法流程图的示例性实施方案。加工单元100设置有吸附剂R。在所示示例性实施方案中，吸附剂设置在具有输入流SC1和输出流SC2的柱100a中。洗涤液WL、处理液TL和回收液RL可在受控流(可为连续或半连续的)中提供至反应器。可利用加压气体(诸如N₂气体)对管线加压。另外地或作为替代，诸如膜泵的泵可用于控制提供至吸附剂的液体。在实施方案中，可使用多个柱100a，柱可顺序或彼此平行地放置。在启动期间，通常用洗涤液WL筛选吸附剂R，之后将含糖脂混合物IM提供至柱100a。将含糖脂混合物供应至柱100a以用糖脂负载吸附剂。通过选择回收液RL的类型，可通过用回收液RL解吸糖脂来回收并分离所需类型的糖脂。回收液和/或处理液可通过再循环流200a再循环。

通常，本发明的特征在于其提供了从含糖脂组合物IM中分离糖脂的方法。所述组合物可作为输入混合物IM提供至该方法的加工单元。在实施方案中，所述含糖脂组合物是发酵方法、酶促、植物生物质或化学生产方法的终产物。

在另一个实施方案中，所述含糖脂组合物是植物提取的终产物。在另一个实施方案中，在根据本发明的不同实施方案的方法中的含糖脂组合物是酶促衍生方法的终产物。在另一个实施方案中，在根据本发明的不同实施方案的方法中的含糖脂组合物是化学衍生方法的终产物。通过本领域中所述的化学(衍生)路线来衍生，路线有但不限于：费歇尔(fisher)合成，糖基化，酰化，烷基化，酰胺化，胺化，芳基化，生物素酰化，15氨甲酰化，羰基化，环加成，偶联反应，醚化，酯化，糖基化，卤化，金属化，复分解，腈形成，烯化，氧化，氧膦化(phosphinylation)，膦酰化(phosphonylation)，磷酸化，季铵化，重排反应，还原，甲硅烷基化，硫醇化，硫化，或它们的任何组合，针对例如但不限于ω-季铵SL(QASL)、ω-SS氧化胺、ω-SS胺、ω20bola两亲物SS等，诸如像由(Delbeke，2016；Delbeke等人，2018；Delbeke、Lozach等人，2016；Delbeke、Movsisyan等人，2015；Delbeke、Roelants等人，2016；Delbeke、Roman等人，2015；D.Develter和Fleurackers，2008；Gross等人，2013；Van Bogaert等人，2011)描述的本领域中针对野生型SL所述的。

在具体实施方案中，根据本发明的方法用来从含糖脂组合物IM中分离聚合糖脂。在又一个实施方案中，糖脂选自包含以下的组：糖基化脂肪酸，糖基化脂肪醇，糖基化类胡萝卜素，糖基化藿烷，糖基化固醇，糖基化仲康酸，甘油糖脂，鞘糖脂，脂多糖，酚糖脂，糖肽脂，核苷脂。在又一个实施方案中，根据本发明的方法用来从含糖脂组合物中分离槐糖脂、鼠李糖脂、木糖脂、海藻糖脂、甘露糖基赤藓糖醇脂、葡萄糖脂、脂肪醇葡糖苷、烷基聚葡糖苷、烷基槐糖苷、(阴离子)烷基葡糖苷、(阴离子)烷基戊糖苷、糖酯、脂肪酸甲基葡糖酰胺、寡糖脂肪醇，其中所述特定糖脂吸附于聚合吸附剂上，且其中所述特定糖脂随后从所述聚合吸附剂中解吸。在仍另一个具体实施方案中，本发明公开了从含槐糖脂组合物中分离槐糖脂的方法，所述方法包括使槐糖脂吸附于聚合吸附剂上，并且从所述聚合吸附剂解吸槐糖脂。

在优选的实施方案中，糖脂组合物包含诸如像bola葡糖苷、乙酰化bola葡糖苷、烷基槐糖苷、乙酰化烷基槐糖苷、烷基葡糖苷、乙酰化烷基葡糖苷、醇葡糖苷、乙酰化醇葡糖苷、bola槐糖苷、乙酰化bola槐糖苷的糖脂，如WO2020104582A1中描述并以引用方式并入本文的，以及bola槐糖脂，如WO2015028278A1中描述并以引用方式并入本文的。

在实施方案中，使用化学溴化的基于聚苯乙烯的树脂来从输入混合物IM中吸附糖脂。使用醇溶剂作为回收液以选择性解吸bola SL。以这种方式，可将bola SL与其它种类的糖脂诸如酸性bola SL分离。

在实施方案中，通过从吸附剂中除去其它组分(诸如次要组分和/或其它类型的糖脂、诸如bola SL)分离酸性SL。其它类型的糖脂被除去，且优选通过回收液RL诸如异丙醇、优选非酸性回收液回收。然后，通过酸性回收液回收酸性SL，其中酸性回收液是包含乙酸、柠檬酸和/或包含卤化氢(诸如盐酸)的混合物，或它们的混合物的水性溶液。

在实施方案中，通过使非极性SL吸附于吸附剂、优选聚合树脂、更优选基于聚甲基丙烯酸酯的树脂和/或基于丙烯酸酯的树脂上，从复杂混合物中分离非极性、低水溶性SL，诸如内酯型SL。

在实施方案中，输入混合物IM包含溶解于醇溶液、诸如乙醇溶液中的发酵液。优选醇溶液包含具有80％及更高浓度的C1、C2、C3、C4醇。

在本发明的实施方案中，利用包含低极性溶剂和非极性溶剂的溶剂混合物的回收液从吸附剂R中回收烷基槐糖苷(ASS)。低极性溶剂优选具有在20℃下测量的5至80g/100mL、优选7至80g/100mL、最优选7至80g/100mL的水溶解度。非极性溶剂优选具有在20℃下测量的0至5g/100mL、优选0至1g/100mL的水溶解度。技术人员可根据ILO国际化学品安全卡查阅水溶解度参数。优选的非极性溶剂是烷烃，诸如己烷、辛烷和庚烷。优选的低极性溶剂是酯，诸如乙酸乙酯。混合物优选还包含醇，优选C1、C2、C3、C4醇中的任意一种，例如甲醇和/或丁醇。

含糖脂组合物IM可还包含任何另外的化合物或物质。在另一个实施方案中，含糖脂组合物包含糖脂和一种或多种选自包含以下的组的另外的次要化合物：离子，盐，(寡)糖，细胞，有机和/或无机酸，油，脂肪酸，蛋白质，酶，肽，氨基酸，(残余)疏水底物，残余疏水物质，颜料和/或过敏原，或它们的组合。

根据本发明的实施方案的方法的特征在于，从含糖脂组合物中除去次要组分诸如蛋白质、肽、(残余)疏水底物、残余疏水物质、盐和/或有机酸，之后从聚合吸附剂中解吸糖脂。所述(残余)疏水物质可选自脂肪酸、脂肪醇、脂肪二醇、二羧酸、三酰基甘油酯、烷烃、油、脂肪等。已发现可通过处理液TL除去所述组分。

对于本发明典型的是糖脂首先吸附于聚合吸附剂R，之后从所述聚合吸附剂中解吸糖脂。具体而言，利用回收液RL进行解吸糖脂，回收液RL可为包含一种或多种溶剂、优选一种或多种有机或无机溶剂的回收溶液。本发明人发现糖脂吸附于聚合吸附剂上是基于糖脂与吸附剂之间的亲和性。吸附剂是聚合树脂。已发现某些聚合树脂可实现更高的负载容量，具体而言高于5％和甚至至多10％或更多的负载容量。优选的聚合树脂选自从包含聚甲基丙烯酸酯树脂、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯树脂或它们的组合的组中选择的聚合树脂；具体而言选自：苯乙烯-二乙烯基苯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯，丙烯酸酯，聚苯乙烯，交联的聚苯乙烯，甲基丙烯酸类，多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯。

根据其不同的实施方案，该方法的特征还在于，优选利用包含一种或多种溶剂、优选一种或多种有机或无机溶剂的回收液RL进行解吸糖脂。在另一个实施方案中，所述一种或多种溶剂选自包含以下的组：离子液体，液态二氧化碳，超临界溶剂，乙酸乙酯，甲醇，异丙醇，丙酮，乙醇，庚烷，叔丁基甲醚，二乙醚，乙腈，苯氧乙醇，苄醇，苯乙醇，氢化肉桂醇，四氢糠醇，二甲基异山梨醇，水杨酸甲酯，丁香酚，芳樟醇，己醇，冰乙酸，碳酸二甲酯，某些二醇醚、诸如二丙二醇甲醚和1-丙氧基2-丙醇，和乳酸酯，包括乳酸乙酯、乳酸丁酯、乳酸戊酯、乳酸乙基己酯。在本发明的另一个实施方案中，如上文提及的所述一种或多种溶剂的总浓度为20％至100％，优选50％至100％，甚至更优选70％至100％，其中所述浓度以体积浓度表示。此外，可通过使回收液、具体而言水-溶剂混合物或纯溶剂经过吸附剂而解吸或洗脱来进行从聚合吸附剂回收糖脂。在此至关重要的是选择糖脂在其中具有足够高溶解度的溶剂。解吸和因此洗脱的效率取决于接触时间、温度、糖脂于溶剂/洗脱剂中的溶解度、溶剂/洗脱剂的体积，和聚合吸附剂的特定基质。

通常，根据本发明的不同实施方案的方法的特征在于，在从组合物中分离糖脂期间，糖脂吸附于聚合吸附剂上。在具体实施方案中，所述聚合吸附剂是聚合吸附树脂。在又一个实施方案中，所述聚合吸附剂选自包含聚甲基丙烯酸酯树脂、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯树脂或它们的混合物的组。在又另一个具体实施方案中，聚合吸附剂是聚苯乙烯树脂。

在本发明的另一个方面中，该方法还包括一个或多个处理步骤。优选地，在糖脂吸附于聚合吸附剂上之后且在糖脂从所述聚合吸附剂解吸之前，进行至少一个处理步骤。在本发明的方法中，清洗步骤可使用水、缓冲溶液、溶剂或它们的组合来进行。

另外，使用疏水性各异的不同的处理溶液，可获得负载材料的逐渐解吸。例如，酸性和/或内酯型槐糖脂和/或它们的混合物可与脂肪酸分离，或槐糖脂的不同同源物可彼此分离，例如bola SL与酸性SL分离。

根据本发明的方法用来从含糖脂组合物中分离糖脂，其中糖脂吸附于聚合吸附剂上，之后糖脂从所述聚合吸附剂解吸。在具体实施方案中，且在该方法中，可发生吸附糖脂的(生物)化学和/或酶促改性，之后通过使用处理液TL从聚合吸附剂中解吸糖脂。吸附糖脂的化学和/或酶促改性可选自：酯键的化学和/或酶促水解，糖苷键的化学和/或酶促水解，酯化，醚化，糖基化，聚合，酰胺化，(还原)胺化，季铵化，氧化，环氧化。以这种方式，可改变负载于吸附剂上的糖脂并且在同一加工单元中将至少一定量的负载糖脂转化成所需类型的糖脂，而无需依赖另外的改性和/或下游步骤。以这种方式，可在同一加工单元中使所需糖脂改性并纯化。另外，通过使负载材料改性成所需糖脂，可改进所述所需糖脂的纯度。

在分离过程结束时，例如通过蒸发、优选真空蒸发，或通过超滤或纳滤与透析过滤组合，从洗脱的部分收集所需糖脂。如图2中所示，可在蒸发容器102中将处理液和/或回收液与所需糖脂PLM1分离。将填充有液体的容器102中的压力降至处理液和/或回收液的蒸气压以下，使所述液体在低于正常温度的温度下蒸发。蒸发的液体优选再循环回到方法的开端以实现最优资源使用。测试已显示以这种方式可再利用处理液和/或回收液，实现有效的资源使用。

在另一个方面中，聚合吸附剂R可再生并制备以用于下一轮分离。树脂可以准不定式(quasi-infinitive)的方式再生。测试已显示树脂可再生，使得树脂可再用于数次方法运行，鉴于有效资源使用这是有益的。可利用水、缓冲液和/或溶剂的组合进行再生。尽管不严格地要求洗涤步骤，但如果杂质累积在吸附剂上(这可减少其负载容量)，该洗涤步骤可为有利的。

在本发明的又一个方面中，以分批模式进行从含糖脂组合物中分离糖脂的方法。在另一个实施方案中，以连续模式进行所述方法。在又一个实施方案中，以半连续模式进行所述方法。

在又一个方面中，根据本发明的方法与发酵、生物催化和/或化学方法组合进行。在所述方面中，通过发酵生产含糖脂组合物与分离糖脂组合进行，例如在原位产物回收装置中与发酵组合。在特定装置中，在反应器中混合聚合吸附剂和含糖脂组合物。在另一个实施方案中，且在所述装置中，根据本发明的方法在反应器中进行。

在实施方案中，通过部分水解使负载于吸附剂上的糖脂化学改性。在特定实施方案中，使用bola槐糖脂(Bola SL)来生产酸性槐糖脂SL和槐糖，如例如WO2015028278A1中所描述并以引用方式并入本文的。使包含所述bola SL的负载材料经受碱剂诸如NaOH。碱剂的pH优选高于8，更优选高于12。已发现较高的pH通过提高反应速率而改进了加工时间。通常用水洗涤吸附剂以除去槐糖和碱，之后是解吸酸性槐糖脂。

在又一个装置中，在本发明的方法中，含糖脂组合物经过包含聚合吸附剂的反应器。在实施方案中，如本文所述的聚合树脂可在进行根据本发明的方法的反应器中与含糖脂混合物IM混合。在优选的实施方案中，在根据本发明的不同实施方案的方法中，含糖脂组合物经过用聚合吸附剂填充的柱。在另一个实施方案中，在加工单元中内酯型SL吸附于吸附剂上，并且利用碱剂改性以形成酸性SL。通常用水洗涤吸附剂以除去乙酸盐和碱。

根据本申请的方法可用于在食品行业、化妆品行业、制药行业、环境保护或节能行业中分离糖脂。

实施例

在下文中参考实施例更明确地来描述本发明。然而，本发明不局限于此，并且在本发明的主旨内本领域技术人员可能作出各种修改。通过以下实施例说明本发明。

在实施例中液体的浓度通常以体积％表示。这指可与其它液体混合和/或用其它液体稀释形成混合物的液体的体积除以混合物的总体积。

实施例1-利用吸附树脂从复杂混合物中纯化并分离酸性槐糖脂(ASL)和bola槐糖脂(BSL)

通过将树脂(聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、右旋糖酐基和烟煤)与含有SL的溶液混合来进行初始树脂筛选。首先用RO水、乙醇且再次用RO水依次平衡树脂。在每个步骤中将混合物置于孵化器中在200rpm下15分钟。通过比较添加树脂前后液体中SL的浓度估算负载容量。随后，通过经由100μm截止筛过滤来从混合物中除去树脂，并用RO水洗涤直至洗涤水的电导率达到<100μS/cm。这确保了如糖和盐的所有亲水杂质都被除去。

所有树脂都能够在某种程度上保留槐糖脂(在本文中也缩写为SL)。在孵化器中将吸附树脂与丙酮在200rpm下混合30分钟，产生了高达77％的回收率。其它溶剂诸如乙醇、异丙醇和乙酸乙酯也能够洗脱SL。

利用化学溴化的基于聚苯乙烯的树脂，可使用40-50％异丙醇洗脱所有bola SL，而无任何酸性SL。尽管也可利用交联的聚苯乙烯树脂，但亲和性的差异似乎更小，使得分离更困难。烟煤仅吸附酸性SL且不吸附bola SL，但负载容量相当低，因此它将更适合作为在方法结束时的精处理(polishing)步骤，以除去bola SL产物中少量的残余酸性SL杂质。

虽然bola SL不带电，但它们也被离子树脂的疏水骨架吸附。此性质可用于分离酸性SL和bola SL，首先用溶剂洗脱bola SL且随后通过使离子交换树脂再生而洗脱酸性SL。

通过将SL溶液与每种树脂混合来筛选离子交换树脂。所有离子树脂都可保留两种SL，观察到弱阴离子交联的聚苯乙烯树脂具有可接受的负载容量。就交联的聚苯乙烯吸附树脂而言，可利用70％异丙醇洗脱bola SL，同时酸性SL仍通过离子键与树脂联结，甚至在施用96％异丙醇时也是如此。相同的原理可适用于从bola SL中除去脂肪酸或从内酯型SL中除去酸性SL。乙酸(CH₃COOH)和柠檬酸(C₆H₈O₇)可部分地除去酸性SL。利用5％的氯化氢(HCl)在水溶液中获得了最佳结果。

使用容纳了填充有树脂的10-15mL小柱的真空歧管进行了另外的洗脱试验。选定的吸附树脂依次用RO水、异丙醇和RO水平衡。接下来，将通过发酵产生的含有SL的无细胞上清液加入每个柱。将柱置于孵化器中在30℃和200rpm下持续15分钟。在每个负载、洗脱和洗涤步骤中都重复这一孵化步骤。使用真空室来收集每个步骤的15mL试管中的部分。利用RO水进行洗涤步骤，并且利用50-96％异丙醇溶液洗脱。即使利用仅15分钟的短接触时间，也记录到化学溴化的聚苯乙烯树脂的高达10％的负载容量。

在具有300mL体积的实验室规模玻璃柱中测试了最合适且技术经济相关的聚苯乙烯树脂。定期取样以跟踪SL浓度、电导率、pH和白利糖度。使用标准BCA蛋白质分析法，测定每个部分中的蛋白质浓度。实验始终通过以下顺序进行：

-用RO水洗涤，

-调节树脂(仅新树脂)，

-负载产物，

-用RO水洗涤直至电导率<100μS/cm，

-用50-100％溶剂(例如乙醇)洗脱产物，

-(利用90-100％溶剂、例如乙醇使树脂再生)。

利用上述方法处理了主要含有bola SL和一些非乙酰化的酸性SL的无细胞发酵液。使用聚苯乙烯树脂并且用96％乙醇洗脱，获得了高于7.5％的负载容量和高于80％的回收率。通过延长洗脱阶段，可进一步提高该回收率。还可提高纯度，因为在洗脱期间在蛋白质中检测到了明显的峰。所述实例在实施例2中进一步描述。

实施例2-利用吸附树脂从蛋白质和彩色颜料中纯化酸性SL和bola SL

在用RO水冲洗负载产物的聚苯乙烯树脂后，当使用高乙醇浓度来洗脱SL时，如实施例1中描述的，所有SL以及一些蛋白质解吸。在负载和RO水洗涤步骤期间大多数蛋白质和彩色颜料已被除去，但更疏水的蛋白质和彩色颜料因它们与树脂的亲和性而保留。重复了实施例1中的300mL实验，但现在用更低的乙醇浓度洗涤树脂。通过首先用25％-30％乙醇洗涤树脂可除去更多蛋白质和彩色颜料，这足以清除大多数彩色颜料和蛋白质，而且足够低以致不解吸任何SL。然后，用50-96％乙醇洗脱SL。

通过施加以下顺序获得了纯度提高的SL，而不影响高回收率：

-用RO水洗涤，

-调节树脂(仅新树脂)，

-负载产物，

-用25％-30％乙醇/异丙醇洗涤，

-用RO水洗涤直至电导率<100μS/cm，

-用50-100％乙醇/异丙醇洗脱产物，

-(利用90-100％溶剂、例如乙醇使树脂再生)。

在期望纯度提高的情况下，可将上述吸附步骤替代或添加至糖脂纯化过程。

还在含有聚苯乙烯树脂吸附剂的30L中试规模柱上评估了此方法。使发酵液经受微过滤以除去细胞，并且随后用吸附树脂处理该滤液。为了洗脱SL，使用96％乙醇在一个步骤中使回收最大化并使柱完全再生。系统地记录到高于8％的负载容量，并且获得了高于95％的bola SL回收率。将此纯化策略与在相同的发酵产生的无细胞滤液上进行的50kDa和10kDa PES超滤纯化法的组合进行比较，如表1中所示，回收率和纯度可显著提高。

表1

	超滤DSP	吸附DSP
			SL回收率(％)	>70％	>95％
蛋白质(％w/w DM)	5.6％	1.1％
			葡萄糖(％w/w DM)	2.3％	0.3％
油(％w/w DM)	0.98％	<0.01％
			总纯度(％w/w DM)	91％	98.6％

最后，使用吸附剂来从15m³发酵液纯化SL。利用微滤除去细胞，并且使用滤液来负载具有聚苯乙烯树脂的1.1m³柱。使用70％异丙醇的溶液来洗脱SL。进行了数个批次，产生了95％的bola SL总回收率。

实施例3-利用吸附树脂从复杂混合物中纯化内酯型SL(不溶于水)

制备了含有酸性SL和内酯型SL的混合物、具有不同乙酰化程度的样品。最主要存在的是二乙酰化内酯型SL。利用发酵液和上清液筛选了九种不同的吸附树脂(基于聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯、丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯的树脂)，上清液是通过对相同的发酵液离心获得的。

使用容纳了填充有树脂的10-15mL小柱的真空歧管进行了实验室规模试验。在负载前，将树脂用RO水冲洗并且在200rpm下振荡15分钟。在通过施加真空除去水后，将树脂用发酵液或上清液负载并且在200rpm下振荡30分钟。用RO水洗涤树脂以除去亲水杂质，之后洗脱。使用70％异丙醇于水中的溶液作为洗脱剂。基于苯乙烯-二乙烯基苯的树脂显示出一些吸附，但最佳结果是利用基于聚甲基丙烯酸酯的树脂和基于丙烯酸酯的树脂获得的，达到了高达8％的负载容量。具有更大表面积的树脂能够吸附更多的SL，但证实了洗脱SL显著更难。

对溶解于水中的酸性SL和内酯型SL的混合物评估了数种其它溶剂。参比洗脱溶剂是70％异丙醇。70％乙醇、70％甲醇、100％丁醇、100％乙腈、70％丙酮和100％四氢呋喃都可洗脱两种SL，其中丁醇比异丙醇表现地略好。非极性溶剂诸如己烷和庚烷不洗脱任何SL，并因此可适合于在吸附期间分离游离脂肪酸、脂肪醇和油。

在筛选树脂的吸附容量和洗脱效率后，将规模增大至300mL柱。使用含有SL的相同的发酵液和上清液进行了实验。柱填充有基于聚甲基丙烯酸酯的吸附树脂。用RO水冲洗柱，直至电导率低于20μS/cm，之后负载发酵液或上清液。在洗脱之前，用RO水洗涤树脂直至电导率为50μS/cm。用70％异丙醇溶液进行洗脱。

由于结果有希望，在5L玻璃柱上测试了内酯型SL纯化。5L柱填充有基于聚甲基丙烯酸酯的吸附树脂。用RO水冲洗树脂，直至流出物电导率降至低于20μS/cm。

将发酵液与等量的96％乙醇混合以尽可能多地溶解内酯型SL。然后，将发酵液与硅藻土助滤剂混合并且倾倒在滤床上以除去所有细胞和碎屑。使该滤液中的乙醇蒸发，之后负载于树脂上以提高吸附效率。在负载柱后，用RO水洗涤树脂直至电导率降至低于50μS/cm。用70％异丙醇溶液进行洗脱。每5分钟取样以跟踪SL浓度、电导率、pH和白利糖度。总SL回收率达到89％。

实施例4-利用吸附树脂从复杂混合物中纯化并分离bola槐糖苷(BSS)、烷基槐糖苷和醇葡糖苷

将实验室规模10-15mL柱用基于聚苯乙烯的树脂填充并用RO水冲洗。随后，利用在高温下微滤发酵液获得无细胞滤液。该滤液含有烷基槐糖苷(烷基SS)、醇葡糖苷(醇GS)和bola槐糖苷(bola SS)。在将滤液负载于柱上后，用RO水洗涤树脂直至电导率低于100μS/cm。将含有甲基叔丁醚(MTBE)和异丙醇的不同溶剂混合物或庚烷、乙酸乙酯、甲醇、丁醇和水的混合物添加到树脂中，在200rpm下振荡30分钟，并随后洗脱。

20％庚烷(在25℃下的水溶解度为0.0022g/100ml)、27.5％乙酸乙酯(EA)(在20℃下的水溶解度为8.7g/100ml)、2.5％丁醇、2.5％甲醇和37.5％水的混合物似乎针对烷基SS最有选择性，洗脱了93％的烷基SS，而仅洗脱了10％的醇GS且不洗脱bola SS。异丙醇完全没有选择性，洗脱了全部三种糖脂。

甲基叔丁醚(MTBE)(水溶解度为4.2g/100ml)和二乙醚(在20℃下的水溶解度为6.9g/100ml)显示出一些选择性性质，然而效率较低：40％烷基SS与13％醇GS和3％bola SS一起洗脱。

生产槐糖苷和葡萄糖脂的这种混合物的基因修饰Starmerella bombicola菌株也生产新的脂肪酸。当使用上文提及的溶剂混合物时这些脂肪酸与SS一起洗脱，因此仍需要被除去。

在溶剂蒸发后，沉淀的SS分散于RO水中并且再次负载于填充有基于聚苯乙烯的树脂的柱上。在用RO水洗涤柱后，用另外的溶剂(混合物)洗脱每个柱。施用了以下比率的庚烷与乙酸乙酯：100:0，90:10，80:20，60:40和40:60。当使用100％庚烷时，新的脂肪酸衍生物都未被除去。己烷溶液似乎过于非极性。90:10溶液洗脱了一些新的脂肪衍生物和39.6％的烷基SS，而80:20溶液似乎最有希望除去大多数新的脂肪衍生物。遗憾的是，也有59％烷基SS的较多共洗脱。60:40和40:60溶液都能够洗脱全部烷基SS以及新的脂肪衍生物。然而，第二个比率也共洗脱了一部分醇GS。需要更多的优化，但该实验显示出通过从吸附树脂选择性洗脱，可分离新的脂肪酸衍生物、烷基SS和醇GS。

实施例5-利用吸附树脂从复杂混合物中纯化乙酰化bola槐糖苷(ABSS)

通过用树脂填充5mL Eppendorf管，并将不同浓度(5-12m/m％)的已知产物负载于树脂上，来估算乙酰化bola槐糖苷在聚苯乙烯树脂上的吸附容量。通过将所需量的冻干纯产物溶解于RO水中来制备溶液。在200rpm下振荡45min后，对溶液取样并借助TLC进行分析。如果超出树脂的负载容量，在TLC板上会发现产物斑点，这指示并非所有产物都能够结合至树脂。

该实验的结论是乙酰化bola槐糖苷在该树脂上的吸附容量为5至6m/m％。这显著低于相同的树脂对于bola SL的吸附容量(8m/m％)。假说是额外的空间被乙酰基占据，从而允许更少的产物吸附。然而，重复了该实验，并且当振荡过夜时，甚至最高测试到12m/m％比率的bola SS完全吸附于树脂。当施加了充足的接触时间时可发生多层吸附。

从发酵液中纯化乙酰化bola SS首先在300mL柱上使用实施例1中针对bola SL所述方法进行验证，且随后也在30L柱上验证。在使用前，用RO水、96％异丙醇和RO水冲洗用树脂填充的柱。在无细胞滤液负载于柱上后，用RO水再次洗涤树脂直至电导率为20μS/cm。用70％异丙醇洗脱bola SS。实现了88％的ABSS回收率，纯度高于95％，这与实施例1中对bolaSL所获得的结果一致。

表2

组分	结果
		乙酰化bola SS回收率(％)	88％
蛋白质(％w/w DM)	<1.3％
		葡萄糖(％w/w DM)	0.08％
甘油(％w/w DM)	<0.1％
		游离脂肪酸(％w/w DM)	<0.33％
NaCl(％w/w DM)	<0.5％
		总纯度(％w/w DM)	>95％

实施例6-利用吸附树脂纯化蔗糖酯(SE)

评估了可溶于温水中的E473蔗糖酯的吸附。使用容纳了填充有基于聚甲基丙烯酸酯的树脂的10-15mL小柱的真空歧管进行了实验室规模试验。在负载前，将树脂用RO水冲洗并且在200rpm下振荡15分钟。在通过施加真空除去水后，将树脂用蔗糖酯溶液负载并且在200rpm下振荡30分钟，这足以吸附全部SE。用RO水再次洗涤树脂以除去亲水杂质，之后洗脱。利用70％异丙醇的洗脱是成功的，但相比于酸性SL和内酯型SL回收率较低，这可通过增加异丙醇浓度或洗脱时间来补偿。

实施例7-糖脂的化学(部分)水解

1)柱上(部分)水解bola SL以生产酸性SL和槐糖

bola SL具有对(碱性)水解敏感的酯键。糖苷键可耐受碱性水解，因此所得产物是非乙酰化酸性SL和槐糖，这都是令人感兴趣的分子。通过进行在柱上的水解，可利用相同的单元操作生产和纯化酸性SL和槐糖，即使当从复杂混合物诸如含有bola SL的无细胞发酵液开始时也是如此。因为纯化在相同的单元操作期间发生，还可进行部分水解以获得bolaSL与酸性SL之间的所需比率。在水解期间将洗脱槐糖。可通过离子交换、纳滤或透析精处理步骤进一步纯化槐糖以除去离子和盐。bola SL到酸性SL和槐糖的优选转化在下方示出。

评估了作为化学水解的碱的氢氧化钠和氢氧化铵，首先将纯化的bola SL与数个浓度(分别为0.01-0.5M和0.1-1M)的每种碱混合并且在200rpm下振荡1小时。当使用NaOH时，获得完全转化需要0.05M的最低浓度或维持pH 12。对于NH₄OH则需要显著更高的1M。使用NH₄OH的优点是它是挥发性的并且可从槐糖中汽提，因此不需要额外的复杂纯化。挥发性也是一个缺点，因为它在加工期间造成刺激性氨蒸气。水解在pH 8时已开始，但在pH 12时快得多。由于形成了酸性SL，在水解期间pH将降低，并且应再次提高以维持高反应速率。

表3

pH	用NaOH水解(％)	用NH₄OH水解(％)
			8	46.2	49.8
10	45.2	69.8
			12	100	82.5

接下来，在用聚苯乙烯树脂填充的300mL吸附柱上测试水解。如实施例1中所述的将树脂平衡，用RO水洗涤直至电导率<50μS/cm，并随后负载10m/m％SL溶液/树脂。以0.1M和0.25M浓度的NaOH和0.5M的NH₄OH测试了两个床体积，全部以约3个床体积/小时的流量。由于增加的电导率和白利糖度值，可跟踪水解。这后一个值与槐糖的量相关。用RO水洗涤树脂直至电导率为50μS/cm，并且随后使用96％乙醇洗脱SL。对于两种NaOH浓度都未检测到bolaSL，而利用当前接触时间0.5M NH₄OH不足以完成水解。

将该过程放大到30L柱，使用相同的SL负载和2个床体积的0.1M NaOH溶液，流量为约2个床体积/小时。在水解期间，流出物中的pH增加至12.5。在用RO水洗涤后，使用50％乙醇洗脱SL。如所预期的，未检测到bola SL，表示完全水解。

替代地，还可在反应器中首先进行水解，之后吸附，这使得跟踪和调整更容易。然而，当使用复杂组合物诸如无细胞发酵液时，还将发生与其它产物的反应，从而产生不期望的副产物和更高的碱消耗。因此，更可能对更纯且已分离的产物使用吸附前水解。

2)柱上内酯型SL的化学(部分)水解

内酯型SL也易受(碱性)水解以形成酸性SL。然而，发酵生产的内酯型SL(野生型)通常被双乙酰化。优选在水解后除去乙酸盐和碱离子。将水解和吸附组合，可从纯产物或含有乙酰化酸性SL和内酯型SL混合物的无细胞发酵液直接生产和纯化非乙酰化酸性SL。

使用与实施例1中所述相同的真空歧管和方法在实验室规模进行了水解试验。差别是在负载与冲洗步骤之间将一个床体积的0.1M NaOH溶液添加到柱中。在50℃下在热混合器中过夜进行水解反应。24小时后，通过施加真空除去含有乙酸盐和盐的溶液。在用RO水冲洗后，用70％异丙醇洗脱非乙酰化酸性SL。利用这些条件观察到了完全转化。

3)化学(部分)水解以除去糖脂上的乙酰化

乙酰化可大幅影响糖脂的性质。这些可通过(碱性)水解(部分地)除去。优选在水解后除去乙酸盐和碱离子。通过将水解和吸附组合，糖脂可在柱上(部分地)脱乙酰化并且从纯产物或含有乙酰化糖脂的无细胞发酵液直接纯化。

乙酰化bola SS

用于生产乙酰化bola SS的基因修饰Starmerella bombicola菌株也产生少量的bola SL。如前文在实施例7中所描述的，柱上碱性水解可应用于将bola SL转化为酸性SL和槐糖。然而，这也将除去乙酰化，产生不同的产物。然后，可使用实施例1中的方法将bola SS与酸性SL分开。

将含有乙酰化bola SL的150L无细胞发酵液水解以除去乙酰化。这通过添加30％NaOH溶液直至pH为12完成。将该溶液孵育1h，连续监测并将pH调节至12，在这之后通过添加4.5M H₂SO₄使溶液稳定在pH 4-5。

将水解的溶液负载于含有聚苯乙烯树脂的30L柱上。在用RO水冲洗至电导率<50μS/cm后，使用70％异丙醇来洗脱SL，产生纯的乙酰化bola SS。

表4

组分	结果
		蛋白质(％w/w DM)	<1.3％
葡萄糖(％w/w DM)	0.04％
		甘油(％w/w DM)	<0.1％
游离脂肪酸(％w/w DM)	<0.03％
		NaCl(％w/w DM)	<0.5％
总纯度(％w/w DM)	>95％

Claims

1.从含糖脂组合物(IM)中分离和/或纯化糖脂(GL)的方法，其中所述方法包括以下步骤：

-提供具有吸附剂(R)的加工单元(100)，其中所述吸附剂是聚合树脂；

-使所述含糖脂组合物与所述吸附剂接触以用负载材料(LM)负载所述聚合树脂，且其中所述负载材料包含至少一定量的糖脂(LM1)；

-处理所述吸附剂以回收预定的所需类型的糖脂(PLM1)，其中所述处理包括：使所述吸附剂与预选回收液(RL)接触以从所述吸附剂上的所述负载材料中回收所述预定的所需类型的糖脂；

-从所述加工单元中获得回收的预定的所需类型的糖脂(PLM1)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括以下步骤：

-利用洗涤液(WL)洗涤所述吸附剂以从所述吸附剂中分离至少非负载材料(NLM)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中处理步骤还包括以下步骤：

-使所述吸附剂与一种或多种处理液(TL)接触以使所述至少一定量的糖脂(LM1)改性和/或从所述吸附剂(R)中除去一种或多种次要组分(NPLM2)。

4.根据前一个权利要求所述的方法，其中所述一种或多种处理液(TL)选自：极性溶剂，非极性溶剂，碱性溶剂，酸性溶剂，中性溶剂，或它们的组合。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述一种或多种处理液(TL)选自：甲醇，乙醇，丙醇，异丙醇，丁醇，己烷，庚烷，乙酸乙酯，KOH，NaOH，NH₄OH，水，RO水，或它们的组合。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述预选回收液(RL)选自包含以下的组：离子液体，液态二氧化碳，超临界溶剂，乙酸乙酯，甲醇，异丙醇，丙酮，乙醇，庚烷，叔丁基甲醚，二乙醚，乙腈，苯氧乙醇，苄醇，苯乙醇，氢化肉桂醇，四氢糠醇，二甲基异山梨醇，水杨酸甲酯，丁香酚，芳樟醇，己醇，冰乙酸，碳酸二甲酯，某些二醇醚诸如二丙二醇甲醚和1-丙氧基2-丙醇，和乳酸酯，包括乳酸乙酯、乳酸丁酯、乳酸戊酯、乳酸乙基己酯，或它们的组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖脂(GL)选自包含以下的组：糖基化脂肪酸，糖基化脂肪醇，糖基化类胡萝卜素，糖基化藿烷，糖基化固醇，糖基化仲康酸，甘油糖脂，鞘糖脂，脂多糖，酚糖脂，糖肽脂，核苷脂。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖脂(GL)选自包含以下的组：槐糖脂，鼠李糖脂，纤维二糖脂，木糖脂，海藻糖脂，甘露糖赤藓糖醇脂，葡萄糖脂，脂肪醇葡糖苷，烷基聚葡糖苷，烷基槐糖苷，(阴离子)烷基葡糖苷，(阴离子)烷基戊糖苷，蔗糖酯，山梨醇酯，甲基葡糖苷酯，脂肪酸甲基葡糖酰胺，寡糖脂肪醇。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖脂(GL)选自乙酰化或非乙酰化形式的酸性槐糖脂(ASL)、内酯型槐糖脂(LSL)。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述糖脂(GL)选自乙酰化或非乙酰化形式的以下者：bola槐糖脂(BSL)，bola槐糖苷(BSS)，烷基槐糖苷(ASS)，醇葡糖苷(AGS)，蔗糖酯(SE)，bola葡糖苷(BGS)，烷基葡糖苷(ALGS)，葡萄糖脂，或它们的组合。

11.根据权利要求3-10中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括：

-使所述吸附剂(R)与具有第一浓度c1的处理液的处理溶液(TS2)接触；

-使所述吸附剂(R)与具有第二浓度c2的回收液的回收溶液(RS2)接触；

-其中所述第一浓度c1使得所述负载材料内基本上全部的所述糖脂(LM1)都未从所述吸附剂中除去，

且其中所述第二浓度c2使得所述负载材料内基本上全部的所述糖脂(LM1)都从所述吸附剂中除去。

12.根据前一个权利要求所述的方法，其中处理液(TL2)和回收液(RL2)都是以下中的一者：极性溶剂，非极性溶剂，碱性溶剂，酸性溶剂，中性溶剂，或它们的组合。

13.根据权利要求10或12所述的方法的用途，用来从所述吸附剂(R)中除去负载和/或非负载的一种或多种次要组分(NPLM2)的第一部分(F1)，其中第一部分选自诸如蛋白质、颜料等的杂质。

14.根据权利要求3-12中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括：

-使所述吸附剂(R)与第一处理液(TL1)、优选碱性试剂接触，以至少部分地使负载于所述吸附剂上的所述糖脂(GL)改性。

15.根据权利要求14所述的方法的用途，用来将乙酰化糖脂转化成非乙酰化糖脂。

16.根据权利要求14所述的方法的用途，用来将乙酰化和/或非乙酰化的内酯型槐糖脂(LSL)转化成乙酰化和/或非乙酰化的酸性槐糖脂(ASL)。

17.根据权利要求14所述的方法的用途，用来将乙酰化和/或非乙酰化的bola槐糖脂(BSL)转化成乙酰化和/或非乙酰化的酸性槐糖脂(ASL)和乙酰化和/或非乙酰化的槐糖。

18.根据前述方法权利要求中的任一项权利要求中所述的方法，其中所述处理步骤包括：

-使所述吸附剂(R)与第二处理液(TL2)、优选非极性溶剂、更优选非极性有机溶剂接触，以从所述负载材料中除去所述一种或多种次要组分的第二部分(F2)；

其中所述第二部分选自非极性组分，诸如游离脂肪酸、脂肪醇、三酰基甘油酯、二羧酸、二醇、烷烃和/或油。

19.根据前一个权利要求所述的方法，其中所述第二处理液(TL2)选自己烷、庚烷或甲基叔丁醚。

20.根据前述方法权利要求中任一项的权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理步骤包括：

-使所述吸附剂(R)与第三处理液(TL3)、优选极性溶剂接触，以从所述负载材料中除去所述一种或多种次要组分的第三部分(F3)；

其中所述第三部分选自亲水杂质，诸如糖、蛋白质、肽、多元醇、有机酸、无机酸、碳水化合物、盐等。

21.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合树脂选自包含聚甲基丙烯酸酯树脂、丙烯酸类树脂、聚苯乙烯树脂或它们的组合的组；具体而言选自：苯乙烯-二乙烯基苯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯，丙烯酸酯，聚苯乙烯，交联的聚苯乙烯，甲基丙烯酸类，多孔聚苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，苯乙烯-二乙烯基苯，丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，化学溴化的聚苯乙烯。

22.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述聚合树脂是中性树脂。

23.根据权利要求2和前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述加工单元具有输入流(S1)和输出流(S2)；且其中洗涤步骤通过经由所述输入流将所述洗涤液(WL)输入至所述加工单元并直至输出流参数在输入流参数的预定范围内来进行。

24.根据权利要求3和前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述加工单元具有输入流(S1)和输出流(S2)；且其中所述处理步骤通过经由所述输入流将所述处理液(TL)输入至所述加工单元并直至输出流参数在输入流参数的预定范围内来进行。

25.根据前两个权利要求中所述的方法，其中所述参数选自：电导率，折射指数，pH，蛋白质含量，糖含量，测试拭子值，或它们的组合。

26.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其还包括以下步骤：

-使所述回收液(RL)蒸发；

-如果存在的话，使所述处理液(TL)蒸发。

27.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其还包括：

-使回收液(RL)、处理液(TL)和任选的洗涤液(WL)中的至少一者再循环。

28.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述含糖脂组合物是植物提取或发酵、酶促或化学生产方法的终产物。

29.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法与发酵方法组合进行；优选在原位产物回收装置中与发酵方法组合进行。

30.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法以分批模式、连续模式或半连续模式进行。

31.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述含糖脂组合物经过包含所述吸附剂的反应器。

32.根据前述方法权利要求中任一项所述的方法，其中所述含糖脂组合物经过用聚合吸附剂填充的柱。