JP2000502062A - オリゴ糖及びそれらの誘導体の脱塩と精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）塩及び／又はポリペプチドを包含するオリゴ糖溶液を、カーボンを含む固体担体と反応させて、オリゴ糖を実質的に固体担体に結合させ; （ｂ）担体を洗浄して塩及び／又はポリペプチドを除去し; そして（ｃ）結合されたオリゴ糖を担体から溶離する; 諸工程を含む、塩及び／又はポリペプチドからオリゴ糖を分離する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴ糖及びそれらの誘導体の脱塩と精製技術分野 本発明は糖を精製する方法に関し、特に、オリゴ糖及びそれらの誘導体を脱塩 する方法に関する。技術背景 分子量が大きいので透析やゲルクロマトグラフィーによって容易に脱塩される タンパク質と違って、小さなオリゴ糖は極めて脱塩が難しい。使用されている方 法には、混合床イオン交換カラムを使用してのイオンの除去、非水性溶剤又は化 学反応による塩の沈殿（例えば炭酸バリウムを添加して硫酸を不溶性硫酸バリウ ムとして除去する）、及び高度に交叉結合した充剤を使用するゲルクロマトグラ フィーによる（それでは小さなオリゴ糖の分離は達成が難しい）、が挙げられる 。 固相抽出カートリッジは今や、地下水中の農薬や炭化水素の残留物のように水 溶液からの疎水性物質の抽出用に工業的に利用可能である。最も普遍的には、こ れらは逆相分離特性を与えるためにアルキル基（最も普遍的にはオクタデシル又 はＯＤＳ鎖）の共有結合導入によって修飾されているシリカを含有する。かかる 逆相吸着剤は優れた疎水性物質保持を示すが、糖のような親水性溶質に対しては 非常に親和力がない。従って、これらカートリッジは疎水性物質からの塩の除去 には有効であるが、糖からの除去には有効でない。 活性炭は気体及び液体どちらの精製のためにも長年確立された吸着剤である。 それは澱粉のような多糖の部分加水分解によって得られたオリゴ糖の混合物の分 取クロマトグラフ分画にも応用された[1]。その応用においてはカラムを通る溶 媒の増加した流れを可能にするために、不活性希釈剤代表的には珪藻土がカーボ ンと混合される。かかる「チャーコール - セライト(charcoal-Celite)」カラム に粗水解物の溶液が適用され、そして有機調節剤(organic modifier)としてエタ ノールを増加する割合で含有する水による溶離によって種々のオリゴ糖がサイズ 増加順に得られる。組成は代表的には、有機調節剤のグラジエントによる溶離に よるよりもバッチ基調で変えられる。 活性炭クロマトグラフ吸着剤は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に 使用されていなかったが、最近のグラファイト化カーボン充填剤（graphitizedc arbon packing)[2]の入手可能性によって、類似の分離モードが利用可能になっ た。より旧式の「活性炭」や「活性化されたチャーコール」と同じように、グラ ファイト化カーボンは良好な機械的性質ばかりでなく極めて高い化学的安定性を 有する。 多孔性グラファイト化カーボンはハイパ一カーブ(Hypercarb)ＨＰＬＣカラム も市場に出しているシャンドン(Shandon)ＨＰＬＣ（英国チェシャー(Cheshire) ）によって現在製造されている。同充填剤を含有するカルボグラフ(Carbograph) 固相抽出カートリッジはアルテク・アソシエーツ社(Alltech Associates Inc.)( 米国イリノイ州ディアフィールド(Deerfield))から入手可能である。ハイパーカ ーブカラムを使用してのオリゴ糖のＨＰＬＣ分離は報告されている[3,4，5,6]。 これまで認識されていなかった局面はオリゴ糖溶液の脱塩のためのカーボンカ ラムの評価である。この事実はオリゴ糖の有効な脱塩方法の欠如からすると驚く べきことである。本発明はオリゴ糖の溶液から塩又はポリペプチドを除去するた めの有効な方法を開発した。発明の開示 第一の面では、本発明は (ａ)塩を包含するオリゴ糖溶液を、カーボンを含む固体担体(solid support)と 反応させて、オリゴ糖を実質的に固体担体に結合させ; (ｂ)担体を洗浄して塩を除去し; そして (ｃ)結合されたオリゴ糖を担体から溶離する 諸工程を含む、オリゴ糖を塩から分離する方法にある。 第二の面では、本発明は (ａ)ポリペプチドを包含するオリゴ糖溶液を、カーボンを含む固体担体と反応さ せて、オリゴ糖を実質的に固体担体に結合させ; (ｂ)担体を洗浄してポリペプチドを除去し; そして (ｃ)結合されたオリゴ糖を担体から溶離する 諸工程を含む、オリゴ糖をポリペプチドから分離する方法にある。 好ましくは、固体担体は多孔性グラファイト化カーボンを含み、そして担体は クロマトグラフカラム又はカートリッジに充填されている。これらの形態におい て、担体は、試料のクロマトグラフ分離前の清浄化(clean up)のため、クロマト グラフ分離のため、又はクロマトグラフ分離後の清浄化のために、特に試料が分 光分析を受けるべきときに、連続又はバッチどちらのモードでも使用できる。洗 浄工程は好ましくは水を使用し、そして溶離工程は好ましくは有機調節剤を包含 する。一つの好ましい形態では、有機調節剤はアセトニトリルである。有機調節 剤の濃度は好ましくは約１〜９０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、他の有機 調節剤特に低級アルコール、メタノール、エタノール、プロパノール及びブタノ ールが適することは当業者に認識されであろう。 結合されたオリゴ糖は溶離工程中の有機調節剤の濃度を変動させることによっ て取り出すことができる。さらに、担体に結合された様々なオリゴ糖を分離する ためには、有機調節剤の様々な濃度を酸性又は塩基性調節剤と組み合わせて使用 できる。適する酸性調節剤は希酸、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、好ま しくは約０．０１〜１％（ｖ／ｖ）の、である。適する塩基性調節剤はアンモニ アである。しかしながら、他の塩基性又は酸性調節剤が本発明の方法に適するこ とは認識されるであろう。酸性又は塩基性調節剤の濃度は好ましくは約０．０１ 〜５％（ｖ／ｖ）である。溶離は有機調節剤の濃度をステップで又はグラジエン トによって増加させること包含してもよい。かかる溶離技術は当業者には周知で ある。 本発明の方法は糖溶液からポリペプチドを除去するばかりでなく生物学的緩衝 液および試薬に使用された塩を除去するのに特に有効である。例は塩化ナトリウ ムや塩化カリウムのような塩、水酸化ナトリウムのような苛性アルカリ、トリス のような陽イオン緩衝液、燐酸塩や酢酸塩のような陰イオン緩衝液、ＨＥＰＥＳ やＭＯＰＳのような両性イオン緩衝液、及びＳＤＳのような界面活性剤を包含す る。上記に列挙した塩は例としてのみ与えられているのであって、他の多数の塩 が本発明の方法を使用してオリゴ糖から除去できることが当業者には認識される であろう。さらに、「塩」の厳密な化学的定義の範囲に入らない生物学的物質の 分離及び分析に使用された他の化合物も本発明の方法を使用して糖から除去でき る。かかる化合物の例は非イオン性洗浄剤である。糖からのこれら化合物の除去 は本発明の範囲に包含される。 本発明がより明瞭に理解されるように、その好ましい形態を図面を参照しなが ら記述する。図面の簡単な説明 図１は、０．１Ｍの塩化ナトリウムの中のグルコース（ＤＰ１）とマルトース (ＤＰ２）とラフィノース（ＤＰ３）の分離の高性能陰イオン交換クロマトグラ フィー（ＨＰＡＥＣ）クロマトグラムであり; ａ）は元の溶液; ｂ）はグラファ イト化カーボンカラムから水による塩の初期溶離の後に１０％アセトニトリル水 溶液の中に回収された糖。 図２は、グラファイト化カーボンカートリッジから酸無添加の２５％アセトニ トリル溶離液によるラクトースの予備溶離の後に０．０５％トリフルオロ酢酸を 含有する２５％アセトニトリル溶離液を使用して溶離された市販Ｎ - ノイラミ ニルラクトースのＨＰＡＥＣクロマトグラムである。 図３は、ａ）市販のグルコース（コーン）シロップ; ｂ）グラファイト化カー ボンカートリッジから１０％アセトニトリル溶離液によって溶離された市販グル コース（コーン）シロップの中に存在したオリゴ糖; ｃ）グラファイト化カーボ ンカートリッジから水及び１０％アセトニトリルによるステップ溶離の後に２５ ％アセトニリトル溶離液によって溶離された市販グルコース（コーン）シロップ の中に存在したオリゴ糖; の中に存在するオリゴ糖の分離のＨＰＡＥＣクロマト グラムである。 図４は、ａ）当初のデキストランＨＣ^l 水解物; ｂ）グラファイト化カーボン カートリッジへの適用からの溶出液; ｃ）カートリッジの洗浄水; ｄ）ＢＳＷ／ １６溶出液; ｅ）ＢＳＷ／８溶出液; ｆ）ＢＳＷ／４溶出液; ｇ）ＢＳＷ／２溶 出液; 及びｈ）ＢＳＷ溶出液; の中に存在するオリゴ糖の分離のＨＰＡＥＣクロ マトグラムである。選択されたピークの上に付された数値は重合度（ＤＰ）を意 味する。 図５は、ａ）市販のグルコース（コーン）シロップの中に存在したオリゴ糖か ら調製されたグリコシルピラゾール; ｂ）グラファイト化カーボンカートリッジ から１０％アセトニトリル溶離液によって溶離されたグリコシルピラゾール; ｃ ）グラファイト化カーボンカートリッジから水及び１０％アセトニトリルによる ステップ溶離の後に２５％アセトニリトル溶離液によって溶離されたグリコシル ピラゾール; の分離の、アミノプロピルカラムを使用してのＨＰＡＥＣクロマト グラムである。 図６は、分取ＨＰＡＥＣによって得られそしてグラファイト化カーボンカート リッジを使用し水による塩の及び２５％アセトニトリルによるオリゴ糖の溶離に よって脱塩されたグルコースオリゴマー（ＤＰ６）の再クロマトグラフィーのＨ ＰＡＥＣクロマトグラムである。 図７は、分取ＨＰＡＥＣによって得られそしてグラファイト化カーボンカート リッジを使用し水による塩の及び０．０５％トリフルオロ酢酸含有２５％アセト ニトリルによるオリゴ糖の溶離によって脱塩されたＮ - ノイラミニルラクトー スの再クロマトグラフィーのＨＰＡＥＣクロマトグラムである。 図８は、ウシ胎児から無水ヒドラジンを使用することによって遊離されそれか らグラファイト化カーボンカートリッジで脱塩されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣクロ マトグラムである。塩は水で溶離され、そしてオリゴ糖は０．０５％トリフルオ ロ酢酸を含有する２５％アセトニトリルによって溶離された。脱塩されたグリカ ンヒドラゾンはアセチル化されてから酢酸銅（II）水溶液で処理することによっ て還元性グリカンに転化[7] されて還元糖を再生した。 図９は、ウシ胎児からＰＮＧａｓｅ及び０．０５％の還元されたトリトンＸ１ ００を使用することによって遊離されそれからグラファイト化カーボンカートリ ッジで脱塩されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣクロマトグラムである。塩と洗浄剤は水 で溶離され、そしてオリゴ糖は０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する２５％ア セトニトリルによって溶離された。 図１０は、ウシ胎児からＰＮＧａｓｅ及び０．１％ＳＤＳを使用することによ って遊離されそれから過剰ＮＰ４０の添加後にグラファイト化カーボンカートリ ッジで脱塩されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣクロマトグラムである。塩と洗浄剤は水 で溶離され、そして酸性オリゴ糖は０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する２５ ％アセトニトリルによって溶離された。 図１１は、ウシ胎児から酵素によって遊離されたトリシアリル化オリゴ糖異性 体(trisialylated oligosaccharide isomers)のエレクトロスプレー質量スペク トル(electrospray mass spectrum)である。異性体はＨＰＡＥＣカラムから収集 され、そして質量分析計にオンラインのグラファイト化カーボンカートリッジを 使用して脱塩された。 図１２は、卵アルブミンからＰＮＧａｓｅ及び０．１％ＳＤＳを使用すること によって遊離されそれから過剰ＮＰ４０の添加後にグラファイト化カーボンカー トリッジで脱塩されたオリゴ糖のＨＰＡＥＣクロマトグラムである。塩と洗浄は 水で溶離され、そして中性オリゴ糖は２５％アセトニトリルによって溶離された ゜ 図１３は、卵アルブミンから酵素によって遊離されたオリゴ糖のエレクトロス プレー質量スペクトルである。オリゴ糖はＨＰＡＥＣカラムから収集され、そし て質量分析計にオンラインのグラファイト化カーボンカートリッジを使用して脱 塩された。 図１４は、ムコ多糖沈着(mucopolysaccharidosis)疾病（ＧＭ１）の患者の尿 の中に蓄積したオリゴ糖のＨＰＡＥＣクロマトグラムである。尿はグラファイト 化カーボンカートリッジを使用して脱塩され、そしてオリゴ糖はクロマトグラフ 分析の前に２５％アセトニトリルの中に溶出された。発明の詳細な説明 糖サンプルの脱塩は質量分析、毛管電気泳動、陰イオン交換クロマトグラフィ ー、酵素減成(enzyme degradation)及び化学的誘導体化(chemical derivatisati -on）のような多数の炭化水素分析手法において極めて重要である。 本発明者らは、一つ又はそれ以上の次のような汚染物質:塩（苛性アルカリも 包含される）、タンパク質（酵素も包含される）、オリゴコンジュゲート(oligo conjugate)からオリゴ糖を遊離させるための試薬（例えばヒドラジンや水素化ホ ウ素ナトリウム）及びオリゴ糖誘導体の生成のために使用された試薬（芳香族ア ミンも包含される）、を含有する溶液からオリゴ糖（又はそれらの誘導体）の混 合物を単離するためにグラファイト化カーボンを評価した。さらに、溶離液の中 に酸性又は塩基性どちらかの調節剤を含有することによって、酸性オリゴ糖、燐 酸化オリゴ糖、硫酸化オリゴ糖及び中性オリゴ糖を分画することが可能である。 吸着剤は洗浄剤又は脂質の存在下以外では反復で及び再生可能に使用できる。 吸着剤の諸性質のこの組合せの特別の価値はオリゴコンジュゲート及び複合多 糖のオリゴ成分の製造、単離及び分析のための様々な化学的手法、分離手法及び 分光手法の統合にある。 例証として、Ｎ-結合グリカンは糖タンパク質からヒドラジンによる処理によ って遊離される。分析を進めるためには、過剰のヒドラジンから及びタンパク質 及び誘導されたペプチドヒドラジンからグリカンを分離することが必要である。 この分離は代表的には蒸発（大部分のヒドラジンを除去するため）とタンパク質 を含む物質からグリカンを分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー、セル ロースクロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーとの組合せによって達成 される。これら操作のどちらもが特に有効であるわけではない。他方、大量のヒ ドラジンの蒸発の後では、粗生成物の水溶液をグラファイト化カーボン固相抽出 カートリッジに適用し、それから水で洗浄して残留ヒドラジンを除去し、それか ら（２５％までのアセトニトリルを有機調節剤として含有する）水で中性グリカ ンの混合物を溶離し、その後で希酸（例えば０．０５％トリフルオロ酢酸）を含 有する同溶離液によって酸性グリカンを溶離することができる。これら溶離条件 下では、小さなペプチドヒドラジン（ヒドラジンがポリペプチドに作用して生成 された）だけがグリカンと共に同時溶離される。タンパク質を含む物質の殆どは カートリッジによって保持される。 代替として、グリカンはエンドグリカナーゼ又はグリコペプチダーゼのような 酵素の使用によって糖タンパク質から取り出されてもよい。この事例では、更な る分析に先立って緩衝液の塩及び酵素を除去することが通常必要がある。先と同 じように、グリカンはカラムに残り、そして水 - アセトニトリル混合物（酸を 添加して又は添加無しで）による溶離によって単離され、そしてタンパツ質は吸 着剤によって保持されたままである。 オリゴコンジュゲートから遊離された糖体(glycoform)の分析における次の工 程は、水酸化ナトリウムと（通常）グラジエントの酢酸ナトリウムを含有する溶 離液を使用することを伴う高ｐＨでの高性能陰イオン交換クロマトグラフィーを 使用するグリカンの分離が普通である。従って、グリカン画分が単離されたとき 、それらは非常にアルカリ性であり、グリカンの分析を非常に複雑にさせる高レ ベルの塩を含有している。溶離液はカーボン吸着剤を使用して脱塩できる。溶離 液を酸（無機酸又は好ましくは有機酸例えば酢酸）で中和し、そして中和された グリカン溶液を、カーボン吸着剤を含有するカラム又は抽出カートリッジに適用 し、水で塩を溶離してから、有機調節剤を含有する水でグリカンを溶離すること で十分である。代替の手法では、クロマトグラフ溶離液の中のアルカリを中和す るために酸を加える必要がない。溶離液を単に抽出カートリッジに添加し、それ から水で十分に洗浄して無機物質を除去し、そして先と同様に水-アセトニトリ ル混合液で糖を溶離する。 引用された刊行物では及び以下に概説される分離例では、溶離において水と一 緒に使用される有機調節剤は通常、アセトニトリルである。しかしながら、他の 調節剤（特に、低級アルコール、メタノール、エタノール、プロパノール、及び ブタノール）を使用して改善された選択性を得ることを促進しこれら溶媒のより 大きい化学的不活性を活用するができる。 オリゴ糖の分析 ＤＰ≧２のオリゴ糖からの塩及び／又は単糖の分離 ０．１Ｍの塩化ナトリウム（５ｍＬ）の中のグルコースとマルトースとラフィ ノースの（各１００μｇの）混合物の脱塩。コンディショニングされたグラファ イト化カーボンカートリッジ（数カラム容量の８０％アセトニトリル：０．１％ ＴＦＡで洗浄された後に水で再平衡化された）に溶液を適用し、それから水（５ ｍＬ）で洗浄し、そして保持された糖をアセトニトリル - 水（１：１、３ｍＬ ）による溶離によって取り出した（図１）。グルコース、マルトース及びラフィ ノースの回収はＨＰＡＥＣ - ＰＡＤによって測定したとき、それぞれ、０、９ ７±２及び９９±２％であった。 中性及び酸性グリカンの分画 中性オリゴ糖ど酸性オリゴ糖の分離のための１段階プロセスとしてのグラファ イト化カーボンカートリッジ（ＰＣＧ）の適用可能性を測定するには、１ｍｇの ラクトース（中性）とＮ - アセチルノイラミニルラクトース（酸性）の混合物 を水溶液としてＰＧＣカートリッジに適用した。１０％アセトニトリルを含有す る３床容量の水よってラクトースを溶離してから、０．０５％トリフルオロ酢酸 含有２５％アセトニトリルによってＮ - アセチルノイラミニルラクトースを溶 離した。溶出液をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによってモニターしたところ（図２）、中 性ラクトースが１段階で酸性Ｎ - アセチルノイラミニルラクトースからはっき りと分離されたことが示された。 希釈溶液からのオリゴ糖の濃縮 ラフィノースの希釈溶液（ＤＰ３、１μｇ／ｍＬ、１００ｍＬ）を約３０ｍＬ ／時でコンディョニング済みグラファイト化カーボンカートリッジ全体に行き渡 らせ、それからカートリッジを水で洗浄した（５×１ｍＬ）。保持されたラフィ ノースはアセトニトリル／水（１：１、３ｍＬ）の中に溶出された。溶出液のア リコート（１００μＬ）を窒素流の下で蒸発させ、水（１００μＬ）の中で再び 液体状にし、そしてその回収物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析したところ９８ ±３％であった。 カラムのキャパシティを測定するために、水（５ｍＬ）の中のラフィノース（ ２００ｍｇ）の溶液をコンディョニング済みグラファイト化カーボンカートリッ ジに適用し、カートリッジを水で洗浄し（５×１ｍＬ）、そして保持されたラフ ィノーズをアセトニトリル:水（１：１、５ｍＬ）によって溶離した。溶出液の アリコート（５０μＬ）を窒素流の下で蒸発させ、水（１００μＬ）の中で再び 液体状にし、そしてＨＰＡＥＣによって分析した。１５０ｍｇのグラファイト化 カーボンを含有するカラムからアセトニトリル:水の溶出液の中に回収された全 ラフィノースは４１±２ｍｇであった。 グルコースの酸性リバージョン(acid reversion)からのオリゴ糖の精製 オリゴ糖は酸の中でのモノマーの濃厚溶液を加熱することにより合成できる。 グルコース（１ｇ）を１ｍＬの２ＭのＴＦＡの中で１００℃で４時間加熱し、そ してカーボンカラムに適用した。酸とグルコース単糖はカラムから水５ｍＬの中 に洗い出され、そしてＤＰ２又はそれ以上のオリゴマーは３ｍＬの２５％アセト ニトリル水の中に溶出された。 コーンシロップからのオリゴ糖の単離 市販グルコースシロップの水溶液（５ｍＬ中の１０ｎｇ） （図３ａ）を、グ ラファイト化カーボンを含有する抽出カートリッジ（１ｍＬ）に適用した。５床 容量（５ｍＬ）の水による洗浄は塩とグルコース塩だけの溶出をもたらした。１ ０％及び２５％のアセトニリトルを含有する水の３床容量（３ｍＬ）による続く バッチ溶離はＨＰＡＥＣによってモニターされたとき、それぞれＤＰ２〜４のオ リゴ糖（図３ｂ）及びＤＰ６〜１０のオリゴ糖（図３ｃ）の溶離を生じた。 オリゴ糖の部分加水分解後の酸除去 不揮発性の酸をなお含有している多糖の水解物のようなグリカンの酸性溶液は グラファイト化カーボンに適用できる。それから、酸と単糖は水による溶出によ って除去することができ、そして糖フラグメントはトリフルオロ酢酸を添加した 又は添加しないアセトニトリル／水によって先のように溶離された。デキストラ ン５００（１０ｍｇ）を０．１Ｍの塩酸（１００μＬ）に溶解しそして１００℃ で２時間加熱した。水解物を水（５ｍＬ）の中に希釈し、そしてコンディョニン グ済みグラファイト化カーボンカートリッジに適用した。それから、カートリッ ジを水（５ｍＬ）で洗浄してから、ＢＳＷ（１ - ブタノールを飽和させた水） を水で希釈することによって調製した一連の溶離液（各５ｍＬ）によって溶離さ せた。（これら溶離液はＢＳＷを水で１６倍に希釈するまでの２倍毎の希釈に対 応するようにＢＳＷ／２、ＢＳＷ／４、ＢＳＷ／８及びＢＳＷ／１６と標示され ている）（図４）。例えば、ＢＳＷ／８による溶出はＤＰ５、６及び７のオリゴ 糖だけからなる画分を与えるが、ＢＳＷ溶出液は主にＤＰ７〜＞２０のオリゴ糖 からなるということがわかる。 グリカン誘導体（グリコシルピラゾール）の精製 コーンシロップのグリカンヒドラゾンの混合物はヒドラゾンを使用して調製さ れ、そして水溶液中の過剰のペンタン - ２，４ - ジオン（アセチルアセトン） で処理することによってグリコシルピラゾール誘導体の混合物（図５ａ）に転化 さ れた。反応混合物はカーボン吸着剤を含有するカラム又はカートリッジに直接適 用された。試薬は水による溶出によって除去されたが、グリコシルピラゾールは １０％アセトニトリル水及び２５％アセトニトリル水による溶出によって取り出 された（それぞれ、ＤＰＩ〜３及びＤＰ３〜１０） （図５ｃ）。ヒラゾールの 回収はアミノプロピルＨＰＬＣカラム（ライニン(Rainin)）を使用しＵＶ検出に よってモニターされた。 ＨＰＡＥＣからのグルコース - オリゴ糖の脱塩 コーンシロップからのオリゴ糖（ＤＰ６）はカーボパク(CarboPac)ＰＡＩＨＰ ＬＣカラムから、０．２５Ｍの水酸化ナトリウム中での０．２Ｍの酢酸ナトリウ ムの約０．５ｍＬの中に収集された。この画分をグラファイト化カーボン吸着剤 のカラムに直接適用し、カラムを５床容量の水で洗浄した後に、オリゴ糖を３床 容量の２５％アセトニリトル水で溶離した。脱塩された糖の回収はカーボパクＰ ＡＩＨＰＬＣカラムでの再クロマトグラフィーによって証明された（図６）。 酸性Ｎ - アセチルノイラミニルラクトースも異性体から分離され（図２）、 そしてカーボパクＰＡＩＨＰＬＣカラムから収集された。この画分をグラファイ ト化カーボン吸着剤のカラムに直接適用し、カラムを５床容量の水で洗浄した後 、０．０５％ＴＦＡを含有する２５％のアセトニリトルの３床容量でオリゴ糖を 溶離した。脱塩された糖の回収はカーボパクＰＡＩＨＰＬＣカラムでの再クロマ トグラフィーによって証明された（図７）。 糖タンパク質の分析 ヒドラジノリシス後の清浄化 糖タンパク質からＮ-及びＯ - 結合オリゴ糖を取り出すために無水ヒドラジン を使用した。ヒドラジンは還元末端が再生される前に除去する必要がある。今日 までのところ、これは消耗的なペーパークロマトグラフィーを伴っており、又は より最近ではセルロースクロマトグラフィーが多数の研究者による雑多な成功を もって市販キット（オックスフォード グリコシステム）の中に組み込まれてい る。 ヒドラジンはＰＧＣカートリッジから水によって溶離することが示された。モ デルの糖タンパク質（１ｍｇウシ胎児）を無水ヒドラジンの中で９５℃で４時間 加熱することによってヒドラジノリシスを受けさせた。ヒドラジンは蒸発（スピ ードバク(SpeedVac)、セイバント(Savant)）によって除去され、トルエンで一度 洗浄して過剰ヒドラジンを除去し、そして生成物の混合物を１ｍＬの水に溶解し 、そして小さなＰＧＣカラム（床容量１ｍＬ）に適用した。カラムを３床容量の 水で溶離させて残留ヒドラジンを除去し、それから２５％アセトニトリルを含有 する水の３床容量によって中性グリカンを溶離し、それから０．０５％トリフル オロ酢酸を含有する同溶離液によって酸性グリカンを溶離した。これら画分のア ミノ酸分析はヒドラジノリシスから得られたペプチドが０．０５％ＴＦＡの下で の５０％アセトニトリル水によって主に溶離されたことを示した。 アセチル化グリカンヒドラゾンを調製し、そして酢酸銅（II）水溶液による処 理によって還元糖に転化し、そしてこの再生された還元糖をＨＰＡＥＣで分離し た（図８）。 ＰＮＧａｓｅ Ｆによって遊離されたグリカンの脱塩と分画 糖タンパク質からＮ-結合オリゴ糖を遊離させるために最も普遍的に使用され ている方法は、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、エンドＦ及びエンドＨのようなエンドグリコ シダーゼの使用である。通常、反応はグリコシル化されたサイトに対する酵素の アクセスビリティを増加させるために高温で洗浄剤を作用させることによって糖 タンパク質の変性(denaturation)によって高収率で達成される。モデル糖タンパ ク質（５００μｇの、酸性Ｎ - 結合オリゴ糖をもつ３つのサイトからなるウシ 胎児及び中性オリゴ糖の単一サイトを含む卵アルブミン）を、５ｍＭのジチオス レイトールを含有するｐＨ７の１００ｍＭの燐酸塩緩衝液の中のペプチドＮ - グリコシダーゼＦ（５単位、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）で処理して、アスパラギン結合 （Ｎ-結合）グリカンの遊離(release)をもたらした。この酵素反応は１）０．０ ５％の還元されたトリトンＸ - １００（図９）又は２）０．１％ＳＤＳ（図１ ０）のどちらかによるタンパク質の変性の後に実施された。後者では酵素の添加 前に５倍過剰のＮＰ４０を添加した。ＳＤＳはＰＧＣから水中に溶出されるが、 ＳＤＳを結合するタンパク質の存在下ではカーボンカラムの選択性が変化する。 生成されていると推定されるＳＤＳミセルを水で洗除することを可能にするため に、 ＰＧＣカラムにサンプルを適用する前にＮＰ４０又は類似の非イオン性洗浄剤を 過剰に添加することは役に立つ。 インキュベーション混合物をグラファイト化カーボンカラム（床容量１ｍＬ） に適用する。カラムを５床容量で溶離させて緩衝液塩及び洗浄剤を除去し、それ から２５％アセトニトリルを含有する水の３床容量で中性グリカンを溶離し、そ れから０．０５％トリフルオロ酢酸を含有する同溶離液で酸性グリカンを溶離し た。得られた酸性グリカンのプロフィールが示され（図９及び１０）、それは胎 児から遊離されたオリゴ糖の代表的なプロフィールである。 ＰＮＧａｓｅによって遊離されたオリゴ糖のこの清浄化はＣＨＯセルによって 生成された組換えタンパク質の分析に及び低密度リポタンパク質から遊離された 中性及び酸性オリゴ糖の分離にうまく応用された。 タンパク質の吸着（溶液の除タンパク） グリコシルを除去されたタンパク質の運命はＰＧＣカートリッジ上でウシ血清 アルブミン（グリコシル化されてないタンパク質）の挙動をモニターすることに よって検査された。１００ｍＭ燐酸塩緩衝液（１ｍＬ）中のウシ血清アルブミン （ＢＳＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ）の溶液をＰＧＣカートリッジに適用した。２８０ ｎｍにおけるＵＶ吸収による画分のモニターは３床容量の、０％、２５％、５０ ％、１００％のアセトニトリル、又は０．１％ＴＦＡを含有する０％、２５％、 ５０％、８０％のアセトニトリルの使用でタンパク質が溶出されなかったことを 示した。これら条件下で、全てのグリカンが溶出された。タンパク質はビオ - レッド(Bio-Red)ＤＧプロテイン アッセイによって判定したときに５０％プロ パノール、水飽和ブタノール、ブタノール飽和水、１Ｍアンモニア、又は０．１ ＭのＮａＯＨの使用ではカラムから脱着されなかった。従って、ＰＧＣカラムは オリゴ糖の溶液を除タンパクするのに使用できる。 高圧陰イオン交換クロマトグラフィー - ＨＰＡＥＣ - ＰＡＤからのオリゴ糖の オイライン脱塩 - 糖タンパク質オリゴ糖のＥＳ - ＭＳへの応用 酵素によって胎児及び卵アルブミンから遊離されたオリゴ糖をカーボパクＰＡ ＩＨＰＬＣカラムから収集した。胎児のトリシアリル化オリゴ糖異性体（図１０ 参照）は約０．５ｍＬの、０．２５Ｍの水酸化ナトリウム中の０．２Ｍ酢酸ナト リウムの中に収集され、そしてオンラインＨＰＬＣカートリッジ（０．５ｍＬ床 容量）の多孔性グラファイト化カーボンに直接適用された。カートリッジを５床 容量の水で洗浄した後に、オリゴ糖を０．０５％ＴＦＡの下での２５％アセトニ トリルによってエレクトロスプレー質量分析計の中に直接溶出させた。胎児トリ シアリル化オリゴ糖異性体の質量が得られ（２８７９質量）、そして質量スペク トルは一つのＮ - アセチルグルコサミン成分に等しい質量の損失によって立証 される通りアルカリ性クロマトグラフィーで起こる少量のピーリングの証拠を示 した（図１１）。脱塩された糖の回収もまた、カーボパクＰＡ１ＨＰＬＣカラム での再クロマトグラフィーによって証明された。 卵アルブミンから酵素により遊離された中性オリゴ糖の群（図１２）は１ｍＬ の、０．２５Ｍの水酸化ナトリウムの中の０．１Ｍの酢酸ナトリウムの中に回収 され、そしてオンラインＨＰＬＣカートリッジ（床容量０．５ｍＬ）の多孔性グ ラファイト化カーボンに直接適用された。カートリッジは５床容量の水で洗浄し た後に、オリゴ糖を０．０５％ＴＦＡの下での２５％アセトニトリルによってエ レクトロスプレー-質量分析計の中に直接溶出させた。得られた質量スペクトル は卵アルブミンオリゴ糖の不均質性(heterogeneity)を示す（図１３）。 糖タンパク質のセリン - 及びトレオニン-結合グリカンの遊離後の分画 Ｏ-結合オリゴ糖は代表的には、ベータ放出(beta-elimination)により糖タン パク質から化学的に遊離される。モデル糖タンパク質（ウシ下顎ムチン）に水酸 化ナトリウム及び水素化ホウ素ナトリウムの存在下でベータ放出を受けさせた。 反応は希酸による酸性化によって決まり、そして溶液はグラファイト化カーボン カートリッジに適用された。カートリッジは塩を除去するために５床容量で溶離 され、それからグリカンを溶離するために０．０５％トリフルオロ酢酸を含有す る水／アセトニトリル（３：１）の３床容量によって溶離された。β - 放出の 前後における単糖分析はＰＧＣカラムからのオリゴ糖の９９％回収を示した。 オリゴ糖分析に先立つ尿の脱塩と除タンパク ムコ多糖沈着疾患（ＧＭ１）で蓄積するオリゴ糖を含有する尿を、ＨＰＡＥＣ - ＰＡＤによる分析に先立って脱塩した。５ｍＬの尿サンプルをＰＧＣカラム に適用し、塩を水で洗除し、そしてオリゴ糖を２５％アセトニトリルで溶離した 。 溶離された糖をスピード - バクで乾燥し、、水に再溶解し、そしてクロマトグ ラフカラムに直接適用した。結果は図１４に示されており、そしてこの脱塩法を 生物学的流体に対しても応用できることを証明している。 広く記載された通りの本発明の思想及び範囲を逸脱することなく、具体的態様 に示されたような本発明に対して多数の変動及び／又は改変を行ってもよいこと は、当業者には認識されるであろう。従って、本態様は全てに関して例証として 解されるべきであって、限定として解されるべきでない。 参考文献: [1]． Whistler RL and BeMiller JN．Methods in Carbohydrate Chemistry,Vo l．１(1962)(Ed.Whistler RL & Wolfrom ML)APress,NY.pp.42-44 [2]．Knox,JH,Kaur,B.and Millward J．Chromatogr.,352(1986)3-25 [3]．Koizumi,K.,Okada,Y.and Fukuda M． Carbohydr.Res 215(1991)67-80 [4]．Davies,M.,Smith K.D.,Harbin,A.and Hounsell,EF．J.Chromatogr.，609(1 992)125-131 [5]． Davies，M.，Smith K.D.，Carruthers，RA.，Chai，W.，Lawson，AM．an d Hounsell，EF． J．Chromatogr.，646(1993)317-326 [6]． Fan.，JQ.,Kondo,A.,Kato，J．and Lee YC． Anal.Biochem．219（1991 4）224-229 [7]． Patel,T.,Bruce,J.,Merry,A.,Bigge，C.,Wormald,M.,Jaques,A．and Par ekh，R．Biochemistry，32(1993)679-693 [8]．Bertolini,M．and Pigman，W．J．Biol．Chem．242(1967)3776 [9]． Cooper CA.,Packer,NH.and Redmond,JW． Glycoconjugate j．(1994)11 ，163-167 [10]．Tweeddale,HJ.,Bat1ey,M and Redmond,JW．Glycoconjugate J．(1994）11 ，586-592

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 レドモンド，ジョン，ウィリアム オーストラリア国2602 エイシーティ，デ ィクソン，ストックデール ストリート 39 (72)発明者 グーライ，アンドリュー，アーサー オーストラリア国2122 ニューサウスウェ ールズ，イーストウッド，ビミエラ ロー ド 14

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）塩及び／又はポリペプチドを包含するオリゴ糖溶液を、カーボンを 含む固体担体と反応させて、オリゴ糖を実質的に固体担体に結合させ; （ｂ）担体を洗浄して塩及び／又はポリペプチドを除去し; そして （ｃ）結合されたオリゴ糖を担体から溶離する諸工程を含む、塩及び／又はポ リペプチドからオリゴ糖を分離する方法。 ２． 固体担体がグラファイト化カーボンである、請求項１に記載の方法。 ３． 担体がクロマトグラフカラム又はカートリッジに充填されている、請求項 １又は２に記載の方法。 ４． 洗浄工程（ｂ）が水をもってし、そして溶離工程（ｃ）が有機調節剤を包 含する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。 ５． 有機調節剤がアセトニトリルである、請求項４に記載の方法。 ６． 有機調節剤がメタノール、エタノール、プロパノール及びブタノールから なる群から選ばれる、請求項４に記載の方法。 ７． 有機調節剤の濃度が１〜９９％（ｖ／ｖ）である、請求項５又は６に記載 の方法。 ８． 結合したオリゴ糖は溶離工程（ｃ）中に有機調節剤の濃度を変動させるこ とによって取り出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９． 担体に結合された各種オリゴ糖は酸性又は塩基性調節剤と組み合わされた 有機調節剤の各種濃度によって溶離される、請求項１〜８のいずれか一項に記載 の方法。 １０．酸性調節剤が希酸である、請求項９に記載の方法。 １１．希酸がトリフルオロ酢酸である、請求項１０に記載の方法。 １２．トリフルオロ酢酸の濃度が０．０１〜１％（ｖ／ｖ）である、請求項１１ に記載の方法。 １３．酸性又は塩基性調節剤の濃度が０．０１〜５％（ｖ／ｖ）である、請求項 ９に記載の方法。 １４．塩が塩化ナトリウム及び塩化カリウム、苛性アルカリ、陽イオン緩衝剤、 陰イオン緩衝剤、両性イオン緩衝剤、及び界面活性剤である、請求項１〜１３の いずれか一項に記載の方法。 １５．苛性アルカリが水酸化ナトリウムであり、陽イオン緩衝剤がトリスであり 、陰イオン緩衝剤が燐酸塩及び酢酸塩であり、両性イオン緩衝剤がＨＥＰＥＳ及 びＮＯＰＳであり、そして界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）であ る、請求項１４に記載の方法。 １６．オリゴ糖が塩から分離される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方 法。 １７．オリゴ糖がポリプペプチドから分離される、請求項１〜１３のいずれか一 項に記載の方法。