CN1194179A

CN1194179A - 微孔尼龙膜的化学改性及其带组氨酸配基亲和膜的制备

Info

Publication number: CN1194179A
Application number: CN97103649A
Authority: CN
Inventors: 商振华; 周冬梅; 郭为; 于亿年
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 1997-03-26
Filing date: 1997-03-26
Publication date: 1998-09-30
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: CN1093428C

Abstract

一种带组氨酸配基尼龙亲和膜的制备方法,其特征在于用分子量分布为2～80万道尔吨的尼龙微孔膜为原料,按下步骤:1)用盐酸溶液中对尼龙微孔膜进行水解,使膜上的酰胺键转变为氨基;2)用环氧法使水解后的尼龙膜上的氨基与环氧氯丙烷上的氯反应,生成带环氧基的尼龙膜;3)用已结合环氧基的尼龙膜与己二胺共价连接成间隔臂;4)采用戊二醛法使已接上间隔臂的尼龙膜与组氨酸配基共价结合成亲和膜。该亲和膜可用于对溶液中的内毒素进行有效的清除,为内毒素的去除又提供一种有效的新途径。

Description

微孔尼龙膜的化学改性及其带组氨酸配基亲和膜的制备

本发明提供一种微孔尼龙膜的化学改性方法及利用这种改性微孔尼龙膜交联组氨酸制成亲和膜。该亲和膜可用于对溶液中内毒素进行清除。

在生物医药制剂的生产制造过程中，或多或少会带进一些热源性物质，细菌内毒素是其中重要的一种，它是革兰氏阴性菌生长释放或死亡时由外层细胞膜裂解所产生的。它的存在对人体有极大的危害，极微量内毒素进入人体即可导致发烧，血管扩张，腹泄等症状，甚至引起昏厥和死亡。内毒素血症在临床上是一种死亡率很高的极为危险的疾病。内毒素分子不仅结构复杂，种类繁多，而且分子量大，分布范围宽，因此去除各种医用水，医药，生化制剂及血液中的内毒素是一项十分艰巨的任务。以往采用的物理吸附，酸，碱或氧化试剂分解，离子交换或超滤等技术对它进行去除效果都不理想。近年来采用高特异性和选择性的亲和色谱法取得了很大的成功，已经研制成功了几种柱系和色谱介质可用于去除水和一些医药制剂中的内毒素，但是用尼龙66膜经化学改性后制成带组氨酸配基的亲和膜并以该膜用于内毒素的去除的技术尚未见报导。

本发明的目的是提供一种微孔尼龙膜的化学改性方法，及将这种经化学改性的微孔尼龙膜交联组氨酸制成亲和膜。该亲和膜可用于对溶液中的内毒素进行有效的清除，为内毒素的去除又提供一种有效的新途径。

本发明的微孔尼尼膜的化学改性及其带组氨酸配基亲和膜的制备方法按下步骤：

1.用盐酸对尼龙66微孔滤膜进行水解，即使膜上的酰胺键转变为氨基，其反应过程如(I)：

2.水解尼龙膜的活化，即用环氧法使水解后的尼龙66膜上的氨基与环氧氯丙烷上的氯反应，生成带环氧基的尼龙66膜，其反应过程如(II)：

3.活化尼龙66膜与间隔臂的连接，即已结合环氧基的尼龙66膜与己二胺共价连接成间隔臂，其反应过程如(III)：

4.亲和配基在膜上的固载化制成亲和膜，即采用戊二醛法使已接上间隔臂的尼龙66膜与组氨酸配基共阶结合制成亲和膜，其反应过程如(IV)和(V)：

具体地说，上述反应(I)中，是以分子量分布从2万到80万道尔吨的尼龙66膜为原料，在1～6MHCl溶液中于25～40℃下振荡反应10～72小时，使尼龙66膜上的酰胺键充分水解变为氨基，水解后用蒸馏水充分洗涤至中性。上述水解过程中如用浓的HCl溶液可缩短反应时间；反应(II)是在碱性溶液中进行，在50～60℃下，使水解尼龙66膜在搅拌下放入以二甲基亚砜为溶剂的环氧氯丙烷中反应3～5小时，使尼龙膜上的氨基与环氧氯丙烷上的氯反应，生成带环氧基的尼龙66膜，反应结束后先用稀HCl溶液，再用蒸馏水反复将膜冲洗干净。上述反应中可以用戊二醛代替环氧氯丙烷。反应(III)是在乙醇水溶液中进行，用NaOH或HCl将溶液pH值调至11，将经反应(II)处理的膜边搅拌边加入到含己二胺的乙醇水溶液中，于50～60℃下，反应2～4小时，反应结束后先用稀HCl溶液，再用去离子水将膜充分洗净，并用滤纸吸掉膜上残存的水。上述反应中的己二胺也可用乙二胺，辛二胺，葵二胺代替。反应(IV)在NaH₂PO₄缓冲液(pH7.2～7.5)中使戊二醛与已接上间隔臂的尼龙66膜反应，反应温度为20～30℃，反应进行2～4小时使间隔臂上的氨基转变为醛基，反应结束后用缓冲液冲洗膜，再用蒸馏水洗涤干净。上述反应也可以用环氧氯丙烷代替戊二醛进行。反应(V)也在NaH₂PO₄缓冲液中完成，pH值为7.2～7.5，于25～30℃下使组氨酸与用戊二醛活化过的尼龙66膜反应4～6小时，将组氨酸固载到膜上，反应结束后，将膜用蒸馏水冲洗干净，即制成本发明的对内毒素有特异性相互作用的尼龙66亲和膜。

下面通过实施例对本发明的技术给予进一步地说明。

实施例1 尼龙66亲和膜的制备

以平均孔径为0.45μm，厚度为0.12mm，分子量分布从2～80万道尔吨的尼龙66膜为原料，在2MHCl溶液中于35℃下振荡反应50小时，完成尼龙66膜的水解反应(I)，其后用蒸馏水充分洗涤直至中性，剪裁成直径为50mm的膜。

在50ml水中加12gNaOH搅拌匀均后加入100ml二甲基亚砜、20ml环氧氯丙烷，0.5gKBH₄，搅拌均匀后，分张边搅拌边加入50张水解后的尼龙66膜，在60℃下反应3小时，完成反应(II)，其后先用0.01mol/L稀HCl，再用蒸馏水分张反复冲洗膜。

配制80ml含50％乙醇水溶液，加入1g己二胺，搅拌溶解后用0.1mol/LNaOH或0.1mol/L HCl溶液将溶液pH值调至11，分张边搅拌边加入上述(II)反应后得到的尼龙66膜，于50℃下振荡反应2小时，反应(III)结束后先用0.01NHCl，再用去离子将膜彻底洗净并用滤纸吸掉膜上残存的水。

在80ml 0.05mol/L NaH₂PO₄缓冲液(pH7.2～7.5)中加入75g25％戊二醛溶液，搅拌均匀后，分张加入上述反应(III)处理的尼龙66膜，于25℃下振荡反应3小时，完成反应(IV)，先用0.1mol/L NaH₂PO₄缓冲液分张冲洗3次，再用蒸馏水洗涤膜。

在80ml 0.1mol/NaH₂PO₄(pH7.2～7.4)缓冲中加入0.5g组氨酸，0.4gKBH₄搅拌均匀，于30℃下边搅拌边加入上述反应(IV)处理后的尼龙66膜，在振荡下反应5小时即可完成反应(V)，将膜取出，用蒸馏水分张冲洗干净就可制得本发明的尼龙66亲和膜。该膜固载化亲和配基的含量为50～100μmol/g，脱附常数为3.0×10^-8mol/L，该介质适于作亲和纯化。

实施例2 医用水中内毒素的去除

用实施例1所制备的50张尼龙66亲和膜组装成膜分离器，让1升内毒素浓度为1.3eu/ml，在流量为0.5～2ml/分下通过该分离器，收集并用三肽紫外吸收定量显色测定法测出通过膜分离器后水中内毒素浓度为0.03eu/ml，内毒素的去除率在95％以上。

实施例3 对含氨基酸的医用注射液中内毒素的去除

利用实例2的膜分离器，由Gly、Thr、Val、Mat、Leu、Phe、Lys等人体必需氨基酸组成的医用注射液500ml，使其含有内毒素220eu，在0.5～1.5ml/分流量下通过例2所述的亲和膜分离器，分别测定膜后收集液中内毒素和各种氨基酸的含量，结果表明对内毒素的去除率在75％以上，对氨基酸的回收率在90％以上。

实施例4 对白蛋白、溶菌酶等溶液中的内毒素的去除

分别让浓度为5mg/ml、1mg/ml的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶溶注入(它们中所含内素素的浓度为100eu/ml)通过由直径50mm，30张尼龙66组氨酸亲和膜装配的膜分离器，在溶液盐浓度为0.1～0.2mol/L，pH值为3～8，流量为0.5～2ml/分的实验条件下通过膜分离器，分别测定收集液中内毒素及BSA、溶菌酶的浓度，内毒素的去除率分别为82％和85％，BSA及溶菌酶的回收率分别可达95％和90％。

利用本发明方法制备的尼龙66亲和膜在溶液盐浓度0.1～0.2mol/L，pH值3～8的溶液中，对多种医药制剂中的内素素具有较佳的去除效果。

实施例5 尼龙66亲和膜的再生

实例2～4所用的尼龙66亲和膜可用含0.2mol/L的氢氧化钠和0.5％，W/W的脱氧胆酸钠无热源水溶液进行洗涤，使亲和介质得到再生，再生后的尼龙亲和膜同样进行实例2～4去除内毒素的分离过程可达到同样的效果，且再生过程可反复进行。

比较例

生物技术和应用生物学杂志(1988年第10卷134页)报导了日本H.Matsumae等人用瑞典Pharmacia公司生产的琼脂糖Sepharose4B为原料，经化学改性后制成的带组氨酸亲和配基的柱亲和色谱填料，配基含量为0.2～0.5mg/g，用此亲和介质填装的亲和色谱柱对水中内毒素的去除率为90％左右，对牛血清白蛋白，溶菌酶等生物制剂中内毒素的去除率为80％左右，它们的回收率分别为90％和86％。与膜亲和色谱相比，柱亲和色谱的主要缺点是难以实现规模化、连续化、自动化操作，并有可能使生物大分子失活。

Claims

1.一种带组氨酸配基尼龙亲和膜的制备方法，其特征在于用分子量分布为2～80万道尔吨的尼龙微孔膜为原料，按下步骤：

1)用盐酸溶液中对尼龙微孔膜进行水解，使膜上的酰胺键转变为氨基；

2)用环氧法使水解后的尼龙膜上的氨基与环氧氯丙烷上的氯反应，生成带环氧基的尼龙膜；

3)用已结合环氧基的尼龙膜与己二胺共价连接成间隔臂；

4)采用戊二醛法使己接上间隔臂的尼龙膜与组氨酸配基共价结合成亲和膜。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤：

1)是在1～6MHCl溶液中于25～40℃下振荡反应10～72小时，使尼龙膜上的酰胺键水解变为氨基，水解后用蒸馏水充分洗涤至中性；

2)是在碱性溶液中进行，在50～60℃下，使水解尼龙膜在搅拌下放入以二甲基亚砜为溶剂的环氧氯丙烷中反应3～5小时，使尼龙膜上的氨基与环氧氯丙烷上的氯反应，生成带环氧基的尼龙膜，反应结束后先用稀HCl溶液，再用蒸馏水反复将膜冲洗干净；

3)在乙醇水溶液中进行，用NaOH或HCl将溶液pH值调至11，将经反应(II)处理的膜边搅拌边加入到含己二胺的乙醇水溶液中，于50～60℃下，反应2～4小时，反应结束后先用稀HCl溶液，再用去离子水将膜充分洗净，并用滤纸吸掉膜上残存的水；

4)是在NaH₂PO₄缓冲液(pH7.2～7.5)中使戊二醛与已接上间隔臂的尼龙膜反应，反应温度为20～30℃，反应进行2～4小时使用隔臂上的氨基转变为醛基，反应结束后用缓冲液冲洗膜，再用蒸馏水洗涤干净；然后在NaH₂PO₄缓冲液中，pH值为7.2～7.5，于25～30℃下使组氨酸与用戊二醛活化过的尼龙膜反应4～6小时，将组氨酸固载化到膜上，反应结束后，将膜用蒸馏水冲洗干净，制成尼龙亲和膜。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2)用戊二醛代替环氧氯丙烷进行反应。

4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3)用乙二胺，辛二胺或葵二胺代替己二胺进行反应。