JPH04210698A

JPH04210698A - 生体物質分取法

Info

Publication number: JPH04210698A
Application number: JP2405337A
Authority: JP
Inventors: Atsushi Uno; 敦史宇野; Shinichiro Niwa; 真一郎丹羽; Makoto Nakabayashi; 誠中林; Toshihiko Kishimoto; 利彦岸本; Misako Umemoto; 梅本　みさ子
Original assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Current assignee: Sumitomo Electric Industries Ltd
Priority date: 1990-12-06
Filing date: 1990-12-06
Publication date: 1992-07-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

［０００１１

【産業上の利用分野］本発明は、タンパク質を含む溶液
から特定のタンパク質を分取（分離・精製）する方法に
関し、さらに詳しくは、特定のタンパク質に特異的に親
和性を有する核酸を固定化したメンブランを用いてタン
パク質を分取する方法に関する。［０００２］【従来の技術】従来のタンパク質の分離・精製技術とし
ては、例えば、アフィニティークロマトグラフィーがあ
る〔Ｈ３ＮＥＷＳ、　Ｖｏｌ、　５．　Ｎｏ、　２　（
１９８９）　「蛋白質分離精製−最近の進歩−」など〕
。［０００３］生体内では、酵素と基質、酵素と補酵素、
抗原と抗体、酵素と基質アナローブ、ホルモンとレセプ
ター、酵素と特異的阻害剤などの関係に見られるような
、極めて特異性の高い相互作用が存在する。アフィニテ
ィークロマトグラフィーは、この相互作用を利用して生
体物質の分離、精製、定量を行なものであり、例えば、
酵素と基質間の特異的な複合体形成を利用したもの、抗
原−抗体反応を利用したものなどがあり、いずれも溶質
に対して特異的に相互作用をするリガンドを担体に固定
化して用いている。［０００４］ところで、アフィニティークロマトグラフ
ィーでは、生体物質と特異的な親和力を有するリガンド
（アミノ酸、タンパク質、核酸、糖類など）を適当な担
体に結合させて吸着体を調製し、これをカラムにつめて
使用するが、均一に充填しないと分離能が低下する。し
かも、吸着体に結合したタンパク質を低圧で、溶離液を
用い、塩濃度勾配をかけて解離・溶出させるため、処理
時間が長くなる。［０００５］このように、従来のカラムを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーの技術では、吸着体をカラ
ムに充填するなどの操作に熟練を必要とする上、−度に
大量の試料を処理することができず、タンパク質の分離
・精製処理に長時間を必要とする問題があった。また、
１つのカラムには、１種類の吸着体しか充填することが
できなかったため、多種類のタンパク質を一度に分離・
精製することができなかった。［０００６］

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、タン
パク質を含む混合溶液中から、目的とする特定のタンパ
ク質を選択的に高効率に回収する方法を提供することに
ある。また、本発明の目的は、従来のカラムクロマトグ
ラフィーとは異なる方法により、簡便かつ迅速にタンパ
ク質を分離・精製する方法を提供することにある。［０００７１本発明者らは、前記従来技術の有する問題
点を克服するために鋭意研究した結果、不溶性のメンブ
ラン（天然または合成有機高分子、無機高分子、金属、
セラミックス、結晶板等のメンブラン；膜状体）に、特
定のタンパク質に対して特異的な親和性を有する核酸を
固定化したものと、タンパク質を含有する溶液とを接触
させることにより、特定のタンパク質をメンブランに固
定し、しかる後、メンブランに結合したタンパク質を緩
衝液からなる溶離液の溶媒条件を変えることで可逆的に
解離させると、目的とする特定のタンパク質が効率よく
分取（分離・精製）できることを見出した。［０００８］　このメンブランを利用したタンパク質の
分離システムでは、従来のカラムクロマトグラフィーと
比べて、吸着体の充填や塩濃度勾配による溶出等にかか
る処理時間の短縮をはかることができるのみならず、結
合核酸の種類を変えたメンブランを多重層に構成するこ
とにより、複数のタンパク質を対象とする処理が可能と
なる。本発明は、これらの知見に基づいて完成するに至
ったものである。［０００９］

【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、特定のタンパク質に対して特異的な親和性を有する
核酸を固定化した不溶性のメンブランと、タンパク質を
含有する溶液とを接触させることにより、特定のタンパ
ク質をメンブランに結合させ、しかる後、メンブランに
結合したタンパク質を解離させることを特徴とする生体
物質分取法が提供される。以下、本発明について詳述す
る。［００１０１本発明で用いるメンブランとしては、一般
にメンブランフィルタ−として汎用されているアガロー
スメンブラン、セルロース系メンブラン、ナイロンメン
ブラン、ポリテトラフルオロエチレンメンブラン、ポリ
アクリルアミドメンブラン、ポリウレタンメンブラン、
ポリエチレンメンブラン等の天然または合成有機高分子
メンブラン、もしくはシリコーン等の無機高分子メンブ
ランに、各種官能基（−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基、ＯＨ
基など）が導入されている、もしくは導入することが可
能なものを挙げることができる。また、メンブランとし
て、金属（発泡金属など）、セラミックス、結晶板等の
膜状体のものを、核酸が固定化できるように化学的・物
理的に処理したものも使用することができる。［００１１］メンブランは、標準的な細胞の径が数十μ
ｍであることから、これを分離するためには平均孔径が
１０μｍ以下のものが好ましく、核の径が約数μｍであ
ることから、これを分離するためには平均孔径が１μｍ
以下であることが、分離能力や分離効率からも、より好
ましい。このようなメンブランの孔径は、一定の大きさ
の粒径に調整されている標準ラテックスを用い、分離す
ることで測定することができる。また、メンブランは、
物理的、化学的に安定であり、水や有機溶媒等の使用す
る展開溶媒に不溶性のものであることが必要である。［００１２］核酸とメンブランとの結合法とじては、メ
ンブランの有する官能基（−ＣＯＯＨ基、−ＮＨ２基、
−ＯＨ基など）をそのまま、あるいは活性化して、官能
基（−ＮＨ２、−Ｃｏ○Ｈ等）を持つ核酸と反応させる
方法を用いる。例えば、カルボキシル基を有するメンブ
ランを活性化するには、カルボキシル基の１０〜１００
倍等鳳の縮合剤または活性化剤を加えて処理を行なう。縮合剤としては、水溶性のカルボジイミド、カルボニル
ジイミダゾール、スクシンイミドなどがあり、活性化に
は、エポキシ活性化、ＣＮＢｒ活性化、トレシル活性化
、ジアゾ活性化などがあり、トレシルクロライドなどの
活性化剤を使用する。核酸の固定化は、例えば、核酸の
末端をメンブランに結合させることにより行なわれる。［００１３］メンブランに結合させる核酸は、分離・精
製の目的物質である特定のタンパク質と特異的に結合す
るものを選択して使用する。そして、メンブランに固定
化されている核酸の量（固定化量）は、目的タンパク質
の分取効率、検出、分析面からみて、好ましくは１×１
０８　　分子７０ｍ２以上、さらに好ましくは１×１０
１０分子／ｃｍ２　以上であることが望ましい。［００１４］特定のタンパク質とそれに対して特異的な
親和性を有する核酸の組み合わせは、特に限定されず、
例えば、この技術分野においてよく知られている組み合
わせなどを用いることができる。具体例としては、下記
の組み合わせを挙げることができる。 ■制限酵素Ｅｃｏ　　ＲＩと下記部位を有するＤＮＡ〜
ＧＡＡＴＴＣ〜〜ＣＴＴＡＡＧ〜 ■制限酵素ＢａｍＨＩと下記部位を有するＤＮＡ〜ＧＧ
ＡＴＣＣ〜〜ＣＣＴＡＧＧ〜 ■制限酵素Ｐｓ　　ｔと下記部位を有するＤＮＡ〜ＣＴ
ＧＣＡＧ〜〜ＧＡＣＧＴＣ〜 ■制限酵素Ｈ１ｎ　　ｄＩＩＩと下記部位を有するＤＮ
Ａ〜ＡＡＧＣＴＴ〜〜ＴＴＣＧＡＡ〜 ■タンパク質ＳＰ１と下記部位を有するＤＮＡ〜ＧＧＧ
ＧＣＧＧＧＧＣ〜〜ＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧ〜 ■タンパク質ＡＴＦと下記部位を有するＤＮＡ〜ＧＣＡ
ＣＣＣＴ〜〜ＣＧＴＧＧＧＡ〜目的物質である特定のタンパク質を含む試料溶液を、ノ
ガンドとして特定の核酸を結合したメンブラン（吸着体
）と接触させることにより、目的タンパク質をメンブラ
ンに結合させる。接触させる方法としては、タンパク質
を含む試料溶液とメンブランを容器中で混合する方法、
もしくはメンブランを装着したタンクにタンパク質を含
む試料溶液を送り込み、メンブランの多孔を通過させる
方法などがある。［００１５］メンブランに核酸（ＤＮＡ）を固定化する
ことによって、該ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質
を選択的にメンブランに結合させることができる。この
結合したタンパク質を分離するには、メンブランを洗浄
液で洗浄し、その後、緩衝液からなる溶離液に浸漬して
溶出させればよい。また、一枚のメンブランに複数種の
核酸を固定化した場合は、各核酸を固定した部分を洗浄
後切断するか、あるいは異なる溶離液に順次浸漬して溶
出させればよい。この溶出技術は、例えば、アフィニテ
ィークロマトグラフィーなどでよく知られた技術を適用
することができる。　本発明の方法によれば、目的とす
るタンパク質だけを特異的に分離・精製することができ
る。［００１６１本発明の分取法は、いくつかの態様によっ
て実施することができる。具体的な実施の態様について
、図１ないし図３を参照しながら説明する。［００１７］先ず、図１に示すように、タンク３内の第
−層のメンブランに特定のタンパク質に特異的なりＮＡ
を固定化し、容器１に収容されているタンパク質を含有
する試料溶液をポンプ２によりタンク３内に導入ないし
は圧入する方法がある。試料溶液中に含まれる特定のタ
ンパク質は、それに特異的な核酸を固定化した第−層の
メンブランと接触し、核酸との親和力によってメンブラ
ンに結合される。第−層を通過した試料溶液は、三方コ
ツク５から循環用ポンプ６により、液路４を経てタンク
内を循環させることができ、これにより分離効率を向上
させることができる。なお、第０層は、ゴミやその他の
不純物を除去するためのプレフィルタ−である。このよ
うにしてタンパク質を結合させた後、第−層のメンブラ
ンを溶離液に浸漬して特定のタンパク質を溶出させる。なお、この第−層のメンブランには、複数種の核酸を固
定化し、試料溶液から各核酸に特異的に結合する複数種
のタンパク質を分取することもできる。［００１８］次に、図２に示すように、タンパク質を含
む溶液２１とＤＮＡを固定したメンブラン２４とを混合
する方法によっても、特定のタンパク質を特異的に分取
することができる。混合のための撹拌手段としては、任
意のものが使用でき、図２の撹拌機２２にかえて、例え
ば、マグネットスターラーなどを用いてもよい。［００１９］また、図３に示すように、メンプランを多
重構造にすることによって、−度に複数のタンパク質を
分離することができる。［００２０１多重構造としては、例えば、タンク内の第
−層のメンブランにタンパク質（Ａ）に特異的なりＮＡ
（ａ）を固定化し、第二層のメンブランにタンパク質（
Ｂ）に特異的なりＮＡ　（ｂ）を固定化し、以下同様に
それぞれのタンパク質に特異的なりＮＡを固定した各メ
ンブランを順次装着しておくと、同時に多種類のタンパ
ク質を分離・精製することができる。［００２１１図３のタンク３には、多数のメンブランが
装着されており、第０層は、ゴミやその他の不純物を除
去するためのプレフィルタ−であり、第１層ないし第１
１層は、各種の核酸を固定したメンプランである。容器
１に収容されているタンパク質を含有する試料溶液は、
ポンプ２によりタンク３内に導入ないしは圧入される。試料溶液中に含まれる各種タンパク質は、それぞれに特
異的な核酸を固定化したメンプランと接触し、核酸との
親和力によってメンプランに結合される。各メンプラン
を通過した試料溶液は、三方コック５から循環用ポンプ
６により、液路４を経てタンク内を循環させることがで
き、これにより分離効率を向上させることができる。［００２２］なお、特定のタンパク質を効率よく分離・
精製するために、同じ核酸を固定したメンプランを複数
用いることもできる。また、複数のメンブランの配置は
、図３のような直列の他に、並列的な配置、あるいは直
列と並列とを組み合わせた配置（例えば、図３において
、タンク３の中段から試料溶液を注入する態様など）な
ど、所望に応じて適宜設定することができる。さらに、
タンク３としては、吸引装置を備えた吸引濾過装置が好
適に用いることができる。［００２３］

【実施例】以下に実施例を挙げて、本発明についてさら
に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに
限定されるものではない。［実施例１］核酸を固定するメンブランとして、カルボキシル基が導
入されているポリアクリル酸系のメンプランを用い、核
酸として、ＤＮＡ自動合成機で合成したものを用いた。この核酸と特異的に結合するタンパク白質としては、制
限酵素ＥｃｏＲＩを用いた。［００２４］　　（１）　　　メジブランに固定化する
ＤＮＡは、（ａ）５−Ｘ　　ＣＧＧ　　ＡＴＡ　　ＴＡＴ　　ＧＡ
Ａ　　ＴＴＣＧＣＧ　　ＣＧ３（ｂ）Ｆ　　　ＧＣＣＴ
ＡＴ　　ＡＴＡ　　ＣＴＴ　　ＡＡＧ　　ＣＧＣＧＣ５
＝の配列を持つもので、ＸはＡＢＩ社のアミノリンク２
であり、ＤＮＡ合成機（ＡＢＩ社製）でそれぞれ合成し
た。（ａ）および（ｂ）は別々に合成した後、ＬＭ　　Ｎａ
Ｃ１１００μｍに各々１００μｇずつ溶かし、これを１
０（Ｄｚｌの０　、４　Ｍ　　Ｎ　ａ　ＨＣ０３（ｐＨ
７、５）を加え、９５℃、２分間処理した後、２０分か
けて５５℃まで冷却し、二本鎖として使用した。これは
制限酵素Ｅｃｏ　　ＲＩと特異的に結合するＤＮＡ配列
である。［００２５］　　（２）住友電気工業株式会社製のポリ
テトラフルオロエチレンにポリビニルアルコールとポリ
アクノル酸を混合したシートを照射架橋したもの（３ｃ
ｍｘ３　ｃ　ｍ　；平均孔径０１２２μｍ）に、水溶性
カルボジイミド（２００ｍｇ／ｍｌ濃度；ｐＨ４，０、
水−ＨＣｌ）５ｍｌをゆっくり滴下し、攪拌した。２時
間撹拌後、蒸留水で十分に洗浄した。洗浄したメンプラ
ンに前記二本鎖ＤＮＡ　（６００１１ｇ／ｍ１）５ｍｌ
を加えた。４℃、２４時間撹拌して反応させた後、蒸留水で洗浄し
た。洗浄液を回収し、添加したＤＮＡ量から固定化量を
算出したところ、ｌＸ１０１４分子／Ｃｍ２　の密度で
ＤＮＡがメンブランに固定化できたを確認した。［００２６］　　（３）　　ＤＮＡを固定化したメンブ
ランを吸引濾過装置に配設し、０．２Ｍ　　ＮａＣ１，
５ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭ　　ＤＴＴ、４０ｍＭ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，５）からなる緩衝液５ｍｌ
にＥｃ　ｏＲＩ（１５０ｕｎｉｔ）を加え、吸引濾過装
置に入れた。その後、１５℃で３０分放置後、吸引し、
数回洗浄した後、１．５Ｍ　　ＮａＣ１，５ｍＭ　　Ｅ
ＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
（ｐＨ７，５）からなる緩衝液（溶離液）で溶出した。溶出液を集めて濃縮し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル（１０％）電気泳動法によりタンパク質の分子量を測
定した結果、ＥｃｏＲＩが回収できたことが確認された
。［００２７］

【発明の効果】本発明によれば、核酸をメンプランに固
定化し、−層または、多重層に構成させることによって
、該核酸に特異的に結合するタンパク質の分離・精製を
容易に行なうことができる。また、一枚のメンプランに
複数種の核酸を固定化することにより、あるいは各核酸
を固定化したメンプランを多層構造とすることにより、
複数種のタンパク質を一度に分取することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】タンパク質溶液をメンプランに通過させる方法

【図２】タンパク質溶液とメンプランを混合させる方法

【図３】タンパク質溶液を複数のメンプランに通過させ
る方法

【符号の説明】

１　試料溶液の保存容器２　ポンプ３　タンク４　循環路５　三方コックロ　循環用ポンプ２１　タンパク質溶液２２　撹拌機２３　容器２４　メンプラン。発明者

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】特定のタンパク質に対して特異的な親和性
を有する核酸を固定化した不溶性のメンブランと、タン
パク質を含有する溶液とを接触させることにより、特定
のタンパク質をメンブランに結合させ、しかる後、メン
ブランに結合したタンパク質を解離させることを特徴と
する生体物質分取法。
【請求項２】メンブランが多孔質である請求項１記載の
分取法。
【請求項３】メンブランが、平均孔径１０μｍ以下のも
のである請求項２記載の分取法。
【請求項４】メンブラ
ンに固定化されている核酸の固定化量が１×１０＾８分
子／ｃｍ＾２以上である請求項１記載の分取法。
【請求項５】一枚のメンブランに複数種の核酸を固定化
し、タンパク質を含有する溶液と同時または順次に接触
させることにより、該溶液から各核酸に特異的に結合す
る複数種のタンパク質を分取する請求項１記載の分取法
。
【請求項６】一枚のメンブランに一種類の核酸を固定化
した複数のメンブランを用い、タンパク質を含有する溶
液と同時または順次に接触させることにより、該溶液か
ら各核酸に特異的に結合する複数種のタンパク質を分取
する請求項１記載の分取法。
【請求項７】核酸の固定化が、核酸の末端をメンブラン
に結合させることにより行なわれる請求項１記載の分取
法。