KR20020000143A - 외상의 치료 - Google Patents
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Abstract
가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 함유하는 조성물의 외상 치료 유효량을 이환된 영역에 투여하는 것을 포함하는, 각막 창상 또는 내인성 외상과 같은 외상을 입은 영역의 치료 방법을 제공한다.
Description
조직 외상 또는 창상에 대한 다양한 치료법이 당업계에 알려져 있다. 그러나, 특히 예를 들면 각막 궤양형성 또는 박리에 대해서는, 각막에 대한 영구적인 손상을 효과적이고 경제적으로 감소시키거나 예방하는 비침습성 방법은 거의 없다. 따라서, 각막에 대한 이러한 손상의 흔한 결과는 이환된 눈의 부분 또는 전체적인 실명이다. 새로운 비침습성 치료는 환영받게 될 것이다.
내부 수술 이후, 체벽과 내부 기관 사이와 같은 내부 기관 및 조직에서의 유착의 형성은 심각한 의료 문제이다. 유착 형성을 억제하기 위한 내인성 외상의 신규한 방법과 치료가 요구된다.
치료 개선이 얻어진 다른 창상으로는 피부 창상, 예를 들면 욕창성 궤양, 정맥성 궤양, 화상 또는 욕창을 들 수 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 무엇보다도 이환된 영역에 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 함유하는 조성물의 외상 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 외상, 특히 각막 창상 및 내인성 외상을 입은 영역의 치료 방법에 관한 것이다.
한 면에서, 본 방법은 병원균과 관련된 감염을 수반하는 것을 포함한 각막 궤양, 각막상피 박리, 및 각막에 대한 화학적 및 물리적 상해의 치료를 다룬다. 다른 면에서, 본 방법은 내부 외과적 창상의 치료를 다룬다.
한 실시태양에서, 본 방법은 내부 기관과 조직을 덮고 기관 및 조직을 포함하고 있는 강(腔)을 덮는 막에 대한 외상, 예를 들면 막을 통한 절개의 치료를 제공한다. 특정 실시태양에서, 상기 막은 장막, 예를 들면 복막, 심막, 심외막 및 흉막이다. 다른 실시태양에서, 본 방법은 내피를 포함한 상피 및 뇌막에 대한 외상을 치료한다. 또다른 실시태양에서, 본 방법은 건(腱), 건초(腱硝), 신경 및 신경초에 대한 내인성 외상의 치료를 제공한다.
바람직한 실시태양에서, 본 방법은 마이크로겔을 함유하는 조성물의 유효량을 내인성 외상을 입은 영역에 가함에 의한, 유착을 일으키기 쉬운 내인성 외상의 치료에 관한 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법의 실행에 사용된 마이크로겔을 함유하는 조성물은 또한 프로테아제, 예를 들면 세린 프로테아제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 프로테아제는 키모트립신, 트립신, 콜라게나제 및 엘라스타제 활성 중 2가지 이상의 활성을 갖는다. 각막 궤양, 각막상피 박리, 또는 각막에 대한 화학적 또는 물리적 상해일 수 있는 각막 창상에 대한 치료인 특히 바람직한 실시태양에서, 프로테아제는 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 (Panaeus vanameii) 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 (Panaeus monodon) 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 (Uca pugilator) 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 (Kamchatka crab) IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 (Crayfish) 프로테아제 1, 연어(Salmon) 효소 1, 대서양 대구(Atlantic cod) I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소이다.
본 발명의 방법은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가
i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는
ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 사용하여 실행할 수 있다. 바람직한 관능기는 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택된다. 바람직한 전구체기는 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 사용하여 실행할 수 있는 마이크로겔은 다가음이온성 중합체를 포함한다. 바람직한 다가음이온성 중합체는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 단량체의 혼합물의 중합반응에 의해 제조될 수 있다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및-X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 바람직한 실시태양에서, R1, R2및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X는 직접 결합 또는 C1-C3알킬렌이다. 또다른 바람직한 실시태양에서, R2및 R3은 수소이고, R1은 수소 또는 메틸이고, X는 직접 결합이다. 더욱 더 바람직한 실시태양에서, Y는 -C(O)OR4{여기서, R4는 수소 또는 메틸, 바람직하게는 수소임}이다.
특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법에 사용된 마이크로겔의 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 가교결합제와 에틸렌계 불포화 단량체의 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 이중 결합의 몰분율은 0.02 이하, 바람직하게는 0.01 이하이다. 바람직한 에틸렌계 불포화 가교결합제는 수크로스의 트리알릴 에테르, 보다 바람직하게는 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에 사용된 마이크로겔은 마이크로겔의 마크로점도 대 마이크로점도의 비가 10,000 이하이다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 유착의 형성을 야기시키기 쉬운 외상을 입은 영역에 투여함으로써 상기 외상을 치료하는 방법을 제공한다. 외상이 복막에 대한 것일 때, 가교결합된 다가음이온성 중합체 0.5 내지 2.5 중량%를 함유하는 마이크로겔 200 내지 300 ㎖가 대표적인 유효량이지만, 담당의는 외상의 위치, 크기 및 심함에 따라 이 양을 변화시킬 수 있다는 것을 알 것이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가 i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는 ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하고, 여기서 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 전체 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하이고, 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하인 조건 중의 적어도 하나가 적용되는 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 이환된 영역에 투여하는 것을 포함하는 창상의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 관능기는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택되고, 전구체기는 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된다.
바람직한 창상 치료 방법은 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 단량체를 갖는 혼합물로부터 제조된 1종 이상의 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 사용한다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 특정 실시태양에서, R1, R2, R3은 수소이고, X는 직접 결합이고, Y는 COOH이다. 바람직한 실시태양에서, 마이크로겔은 다작용성 단백질도 또한 함유하는 조성물 중에 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 키모트립신, 트립신, 콜라게나제 및 엘라스타제 활성 중 2가지 이상을 포함하는 활성을 갖는 프로테아제를 포함하는 조성물 유효량을 이환된 영역에 투여하는 것을 포함하는, 각막 창상, 특히 병원균과 관련된 것을 포함하는 각막 궤양, 각막상피 박리 또는 각막 궤양을 야기시키기 쉬운 화학적 또는 물리적 상해의 치료 방법을 제공한다. 바람직하게는, 프로테아제는 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소이다. 감염과 관련된 각막 궤양은 본 실시태양의 특히 바람직한 표적이다. 바람직한 실시태양에서, 각막 창상을 치료하는데 사용된 조성물은 또한 마이크로겔도 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가
i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는
ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 이식을 받은 영역에 및 이식가능한 장치의 표면에 가하는 것을 포함하는, 이식가능한 장치의 이식 후의 유착의 형성을 감소시키기 위한 수술 이식물의 처리 방법을 제공한다. 몇몇 실시태양에서, 가교결합된 다가음이온성 중합체는 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물 및 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제의 혼합물로부터 제조된다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 이식물의 처리 방법에 사용된 하이드로겔은 프로테아제를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 이식가능한 장치의 처리 방법에 사용된 마이크로겔은 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하인, 에틸렌계 불포화 가교결합제를 함유하는 혼합물로부터 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함한다. 바람직하게는, 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 생물학적 시료를 기계적으로 파괴시키지 않고서 담수를 사용하여 생물학적 시료로부터 다작용성 효소를 단리하는 방법을 제공한다. 또다른 실시태양에서, 다작용성 효소의 단리 방법은 생물학적 시료의 담수 추출물을 리간드, 바람직하게는 아미노페닐보로네이트를 갖는 친화도 컬럼에 가하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 각막 창상 및 내인성 외상을 포함하는 외상의 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용되는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔의 용도를 제공한다. 각막 창상은 감염될 수 있는 각막 궤양, 각막상피 박리, 또는 각막에 대한 화학적 또는 물리적 상해를 포함한다. 수술적 상해는 단지 물리적 상해의 한 예일 뿐이다. 외상은 내부 기관 또는 조직을 덮거나 또는 하나 이상의 기관 또는 조직이 위치하는 강을 덮는 막에 대한 외상을 포함한다. 막의 예로는 복막, 심외막, 심막, 및 흉막을 들 수 있다. 막의 다른 예는 내피를 포함하는 상피, 및 뇌막이다. 내인성 외상은 또한 건 또는 건초, 또는 신경 또는 신경초에 대한 외상을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유착의 형성 또는 재형성을 예방하는데 사용하기 위한, 단백질, 특히 하이드롤라제도 또한 포함할 수 있는 조성물의 제조에 사용되는 마이크로겔의 용도를 제공한다. 단백질이 사용될 때 이것은 바람직하게는 프로테아제, 보다 바람직하게는 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 및 엘라스타제 활성 중의 2가지 이상을 포함하는 활성을 갖는 프로테아제이다. 특히 바람직한 단백질은 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소이다. 동일한 마이크로겔 및 단백질이 각막 창상, 특히 감염될 수 있는 각막 궤양을 치료하는데 사용될 수 있는 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
각막 창상과 내인성 외상 치료에 유용한 조성물의 제조에 사용될 수 있는 바람직한 마이크로겔은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가
i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는
ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함한다. 바람직한 관능기는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택된다. 바람직한 전구체기는 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시태양에서, 각막 창상 및 내인성 외상을 치료하기 위한, 단백질을 함유할 수 있는 조성물의 제조에 사용되는 마이크로겔은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물의 혼합물의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함한다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접적으로 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 보다 바람직한 실시태양에서, R1, R2및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X는 직접 결합이다. 특히 바람직한 실시태양에서, R2및 R3은 수소이고, R1은 수소 또는 메틸, 바람직하게는 메틸이고, X는 직접 결합이고, Y는 -COOH이다. 특히 바람직한 실시태양에서, 제조에 사용된 마이크로겔의 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 이중 결합의 몰분율은 0.02 이하이다. 바람직하게는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 에틸렌계 이중 결합의 몰분율은 0.01 이하이다. 수크로스의 트리알릴 에테르 및 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르가 적합한 가교결합제이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 단백질, 특히 하이드롤라제를 함유할 수 있는 유착의 예방 또는 최소화를 위한 조성물의 제조에 사용되는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔의 용도를 제공한다. 바람직하게는 마이크로겔은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가
i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는
ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하고,
iii) 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 전체 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하이거나, 또는
iv) 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하인 조건 중의 적어도 하나가 적용된다.
상기 실시태양에서, 관능기는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택되고, 전구체기는 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된다. 바람직하게는 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 화합물 중의 적어도 하나는 하기 화학식으로 표시될 수 있는 구조를 갖는다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 바람직하게는, R1, R2및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X는 직접 결합이고, Y는 C(O)OR4이다. 보다 바람직하게는, R1, R2및 R3은 수소이고, R4는 수소이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 각막 창상 치료용 조성물의 제조에 사용되는 단백질의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 단백질은 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 이식가능한 장치의 수술적 이식 후의 유착의 예방 또는 감소를 위한, 단백질을 함유할 수 있는 조성물의 제조에 사용되는 마이크로겔의 용도를 제공한다. 마이크로겔은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가
i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는
ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 관능기는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택된다. 바람직한 전구체기는 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된다.
특히 바람직한 실시태양에서, 단백질을 함유할 수 있는, 이식가능한 장치의 수술적 이식 후의 유착을 예방 또는 최소화하기 위한 조성물의 제조에 사용되는 마이크로겔은 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물의 혼합물의 중합반응으로부터 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함한다.
(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y
식 중, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,
X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,
R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접적으로 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다. 보다 바람직한 실시태양에서, R1, R2및 R3은 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X는 직접 결합이다. 특히 바람직한 실시태양에서, R2및 R3은 수소이고, R1은 수소 또는 메틸, 바람직하게는 메틸이고, X는 직접 결합이고, Y는 -COOH이다. 특히 바람직한 실시태양에서,제조에 사용된 마이크로겔의 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 이중 결합의 몰분율은 0.02 이하이다. 바람직하게는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 에틸렌계 이중 결합의 몰분율은 0.01 이하이다. 수크로스의 트리알릴 에테르 및 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르가 적합한 가교결합제이다.
본 발명의 이들 및 다른 면들이 아래에서 논의된다.
본 발명은 창상, 예를 들면 각막 궤양형성 및 내인성 외상을 치료하기 위한, 특정 효소와 함께 또는 그 없이 마이크로겔 물질의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각막 창상의 치료 및 유착 방지를 위한 임의의 제약학상 허용되는 담체 중의 효소의 용도에 관한 것이다.
도 1은 제2 이소폼("p31")의 DNA 서열(서열 3)과 함께 정렬시킨 크릴 유래 (krill-derived) 다작용성 단백질의 제1 이소폼("p62")의 DNA 서열(서열 1)을 나타낸다.
도 2는 제2 이소폼("p31")의 아미노산 서열(서열 4)과 함께 정렬시킨 크릴 유래 다작용성 단백질의 제1 이소폼("p62")의 아미노산 서열(서열 2)을 나타낸다.
도 3은 제1 이소폼("p62")의 DNA 서열(서열 1)과 함께 정렬시킨 크릴 유래 다작용성 단백질의 제3 이소폼("p5.1a")의 DNA 서열(서열 5)을 나타낸다.
도 4는 제2 이소폼("p31")의 아미노산 서열(서열 4)와 제1 이소폼("p62")의 아미노산 서열(서열 2)과 함께 정렬시킨 제3 이소폼("p5.1a")의 아미노산 서열(서열 6)을 나타낸다.
도 5는 제1 이소폼("p62")의 아미노산 서열(서열 1)과 함께 정렬시킨, 수개의 단백질, 즉 인자 VII, 트롬빈, 칼리크레인, 리물러스(Limulus) 프로응혈(pro-clotting) 효소, 플라스민, 헵신 및 인자 XII의 아미노산 서열들을 나타낸다.
도 6은 p62(서열 1), p13(서열 7), p912(서열 9), p5.1b(서열 11) 및 p31(서열 3)에 대한 핵산 서열들 사이의 서열 비교 뿐만 아니라 정렬된 펩티드 서열(각각 서열 2, 8, 10, 12 및 4)에 대한 서열 비교를 나타낸다. p62에 대한 개방 해독틀 (open reading frame)에서의 핵산 서열 차이를 밑줄로 표시하고, 아미노산 서열에서의 차이는 상이한 잔기를 인용하여 표시한다.
도 7은 p62(서열 2), p13(서열 8), p912(서열 10), p5.1b(서열 12) 및 p31(서열 4)에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열들 사이에서의 서열 비교를 나타낸다.
도 8은 p62(서열 2), p912(서열 10), p5.1a(서열 6) 및 p31(서열 4)에 의해 코딩된 폴리펩티드 서열들 사이에서의 서열 정렬을 예시한다.
본 출원의 목적상 아래 열거되는 용어들은 각각 하기 의미들을 갖는다.
ㆍ산 가는 건조 물질 1 그램을 중화시키는데 필요한 밀리그램 단위의 수산화칼륨의 양을 말한다. 물질이 1 중량% 이하의 물, 유기 용매 또는 유기 단량체를 함유하는 경우 그 물질은 건조한 것이다.
ㆍ효소 활성 세그먼트는 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 또는 엑소 펩티다제 활성 중 적어도 하나를 포함하는 활성을 갖는 다작용성 단백질의 세그먼트를 의미한다.
ㆍ산 가:"유효량"의 의미는 임상학자들이 잘 알고 있을 것이지만, (1) 치료하고자 하는 질환 또는 피해야할 상태의 1개 이상의 증상을 감소시키거나, 완화시키거나 또는 제거하는데, (2) 치료하고자 하는 질환 또는 피해야할 상태를 치료하는 것과 관련된 약물할적 변화를 유발하는데, (3) 질환 또는 상태의 발생 빈도를 막거나 또는 저하시키는데, (4) 감염제에 의한 감염 또는 재감염을 억제하거나 또는 예방하는데, (5) 비감염성 질환 (예를 들면 세포 유착 현상을 차단함으로써 치료할 수 있는 질환)의 발생을 막는데, (6) 창상의 치료 속도 (예를 들면, 창상을 치료하는데 걸리는 평균 시간)를 증가시키는데, (7) 창상 치료로부터 야기되는 흉터 자국의 양을 감소시키는데, 또는 (8) 유착의 형성 또는 재형성을 억제하거나 또는 막는데 효과적인 양을 포함한다.
ㆍ하이드로겔은 선형이거나 분지될 수 있거나, 공유적으로 가교결합되거나, 이온적으로 가교결합되거나, 물리적으로 가교결합되거나 또는 수소 결합에 의해 가교결합될 수 있는, 친수성 중합체의 물과의 혼합물이다.
ㆍ하이드롤라제는 아미드, 에스테르 또는 에테르 결합과 같은 탈수 반응에 의해 형성된 결합을 분해시키는 효소를 의미한다. 용어는 트립신 및 키모트립신과 같은 프로테아제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
ㆍ동일성은 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 서열들 또는 상기 서열들의 열 (string)을 비교하여 알아보았을 때 2개 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들 또는 이들의 일부분들 사이의 관계이다. "동일성"은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 개별 소단위들의 비교에 관한 것인 반면에, 관련된 용어 "유사성"은 단지 특정 위치에서의 동일성의 차이가, 상이한 아미노산 소단위가 유사하거나 또는 상이한 화학적 특성을 갖는지 여부에 따라 보다 큰또는 보다 적은 유사성을 야기시킬 수 있는 경우의 폴리펩티드의 해당 소단위에서의 차이에 관한 것이다. 문헌[Computational Molecular Biology,Lesk. A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988;Biocomputing: Informatics and Genome Projects,Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje, G., Academic Press, 1987; andSequence analysis Primer,Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAMJ. Applied Math., 48:1073 (1988)]에 기재되어 있는 것을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 공지된 방법에 의해 누구나 용이하게 동일성 또는 유사성 %를 계산할 수 있다.
동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 시험한 서열들 사이에서 최대한의 일치를 제공하도록 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법은 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램으로 분류된다. 2개의 서열들 사이의 동일성 및 유사성을 결정하는데 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법으로는 GCG 프로그램 팩키지 [Devereux, J. 등,Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)], BLASTP, BLASTN, 및 FASTA [Atschul, S.F. 등,J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990)]를 들 수 있으나 이들로 제한되지는 않는다. BLAST X 프로그램은 NCBI[BLAST Manual,Altschul. S. 등, NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul. S. 등,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)] 및 다른 공급원들로부터 대중적으로 입수할 수 있다. 또한 공지된 스미스 워터맨(Smith Waterman) 연산법을 사용하여 동일성을 결정할 수도 있다.
폴리펩티드 서열 비교에 바람직한 파라미터들로는 하기하는 것을 들 수 있다: (1) 연산법: Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970); (2) 비교 매트릭스: 일치= +10, 불일치= 0; (3) 갭 페널티: 50; 및 (4) 갭 길이 페널티: 3. 이들 파라미터들과 함께 유용한 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group; 미국 위스콘신주 매디슨)으로부터 "갭(gap)" 프로그램으로 대중적으로 입수할 수 있다. 상기 파라미터들은 핵산 비교를 위한 디폴트(default) 파라미터이다.
바람직한 폴리펩티드 실시태양은 추가로 폴리펩티드 기준 서열, 예를 들면 서열 2 또는 그의 일부분, 보다 구체적으로는 그의 AA64-300과 적어도 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 포함하며, 이 때 폴리펩티드의 서열은 기준 서열과 동일하거나 또는 기준 서열과 비교하였을 때 특정 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 변화는 1개 이상의 아미노산 결핍, 치환 (보존적 및 비보존적 치환을 포함) 또는 삽입을 포함하는 군으로부터 선택되고, 이 변화는 기준 폴리펩티드 서열의 아미노- 또는 카르복시-말단 위치에서 또는 이들 말단 사이의 임의의 위치에서, 기준 서열 중의 아미노산들 사이에서 개별적으로 또는 기준 서열 내에서 1개 이상의 인접한 군으로서 산재되어 일어날 수 있다. 아미노산 변화의 수는 기준 서열 중의 아미노산의 총 수에 각각의 동일성 %의 수치를 곱하고 이 곱한 값에서 상기 기준 서열 중의 아미노산의 총 수를 빼거나 또는 하기 식에 의해 결정된다:
na≤ xa- (xaㆍy)
식 중, na는 아미노산 변화 수이고, xa는 기준 서열 또는 그의 일부분 중의 아미노산의 총 수이고, y는 60% 동일성의 경우 0.60, 70% 동일성의 경우 0.70, 80% 동일성의 경우 0.80, 85% 동일성의 경우 0.85, 90% 동일성의 경우 0.90, 95% 동일성의 경우 0.95, 97% 동일성의 경우 0.97, 100% 동일성의 경우 1.00이고, xa및 y의 임의의 비정수 곱은 이것으로부터 xa를 빼기 전에 가장 가까운 정수로 반올림한다. 다시 말하지만, 2개의 서열 열 (문의 열 및 기준 열) 사이의 관련성은 기준 서열과 동일한 문의 서열이라 말하는 식으로, 또는 동일하지 않다면 기준 서열에 대응하는 전체 길이에 걸쳐, 핵산 서열이 기준 서열의 매 100개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기에 대하여 평균 30개 (또는 20, 10, 5, 2 또는 1개) 이하의 치환, 결핍 또는 삽입을 갖는다는 식으로 말해질 수 있다.
ㆍ이소폼은 동일한 유기체 내에서 실질적으로 동종 단백질의 자연적으로 발생되는 서열 변이체를 의미한다. 바람직하게는, 이소폼은 기준 서열과 약 80% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 동일성을 공유한다.
ㆍ크릴-유래 다작용성 단백질은 "다작용성 단백질의 바람직한 특성"이라 제목붙여진 부분에서 설명되는 단백질의 특성을 갖는 크릴로부터 단리된 단백질과 동일한 서열을 갖는 다작용성 단백질을 의미한다. 이 단백질은 또한 "크릴 유래 다작용성 하이드롤라제"로도 언급되며, 이 단백질의 모든 이소폼을 포함한다. 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 서열 12 또는 이들의 다른 이소폼 또는 이들의 키메라 폴리펩티드가 크릴 유래 다작용성 단백질의 예이다.
ㆍ마이크로겔은 각각 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하고 중성 pH에서 그의 수성 팽윤된 상태에서 0.1 내지 1000 μm의 크기를 갖는 별개의 입자들의 점탄성 덩어리를 의미한다. 수성 팽윤된 다가음이온성 중합체 입자들은 70% 이상의 물을 갖고, 가교결합은 이온, 공유 또는 수소 결합을 통해서이다.
ㆍ마이크로점도는 예를 들면, 그의 전체 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 인용되어 있는 문헌[R.Y. Lochhead 등, "Poly(acrylic acid) Thickeners: The Importance of Gel Microrheology and Evaluation of Hydrophobically Modified Derivatives as Emulsifiers" inPolymers in Aqueous Media,pp. 113-147, 1989]에 기재되어 있는 임의의 방법에 의해 측정된다. 상기 한 방법은 예를 들면 대략 10 ㎚ 및 100 ㎚가 중심이 되는 미세구조체에 대하여 미세확산이 측정될 수 있도록 하여, 이분포양식의 금 졸로 미세확산을 측정한다.
ㆍ다작용성 단백질은 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 또는 엑소 펩티다제 활성 또는 아시알로 GM1세라마이드 결합 활성 중의 1가지 이상을 포함하는 활성, 및 크릴 유래 다작용성 단백질의 1개 이상의 세그먼트와 실질적인 상동성을 갖는 단백질을 의미한다.
ㆍ중성 관능기는 산 또는 염기에 의해 적정되지 않는 관능기를 의미한다.
ㆍ핵산은 본 발명의 핵산 서열 실시태양들이 바람직하게는 데옥시리보핵산 서열, 바람직하게는 2가닥 데옥시리보핵산 서열이다. 그러나, 이들은 또한 리보핵산 서열 또는 핵산의 수소 결합 및 염기쌍 특성을 보존하지만 예를 들면 뉴클레아제에 영향을 받기 쉬운 성질에서 천연 핵산과 상이하도록 디자인된 화합물을 의미하는 핵산 유사물일 수도 있다.
ㆍ생리학적 pH는 6.5와 7.5 사이의 pH를 의미한다.
ㆍ다가음이온성 중합체는 생리학적 pH에서 음으로 하전된 관능기, 예를 들면 카르복실레이트 음이온으로 되는 이온화가능한 관능기, 예를 들면 카르복시기를 갖고 아크릴 주쇄를 갖는 중합체를 의미한다. 다가음이온성 중합체 1 그램은 KOH로 적정될 수 있는 관능기를 0.001 몰 이상 갖는다. 이온화가능한 관능기는 중합체 주쇄에 직접 화학적으로 결합될 수 있거나 또는 측기 또는 측쇄에 화학적으로 결합되어 이것이 다시 주쇄에 화학적으로 결합될 수 있다. 카르복시폴리메틸렌은 이온화가능한 관능기가 주쇄에 직접 결합되어 있는 다가음이온성 중합체의 한 예이다.
ㆍ기준 단백질 또는 서열은 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 단백질 서열 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10, 또는 12에서 발견되는 잔기 차이 또는 확대 중의 한 가지 이상에 의해 상이한 서열을 의미한다. 기준 단백질은 기준 단백질 서열을 갖는 단백질이다. 도 6을 참고하면, 기준 단백질의 예는 (a) 잔기 128이 세린인 것을 제외하고는 서열 2의 AA64-300의 서열을 갖는 단백질, 또는 (b) Leu1앞에 세린이 있는 것을 제외하고는 서열 2의 서열을 갖는 단백질이다. 바람직한 실시태양에서, N-말단은 서열 10 및 12로부터 추가의 서열, 예를 들면 NH2-Ala, NH2-IleAla, NH2-ArgIleAla, NH2-SerArgIleAla (서열 44), NH2-ArgSerArgIleAla(서열 45), NH2-GlyArgSerArgIleAla (서열 45) 또는 NH2-ProGlyArgSerArgIleAla (서열 46)을 갖는다. 기준 핵산 서열은 서열 1의 대응하는 코딩 영역 또는 이들과 서열 1, 5, 7, 9 또는 11에서 발견되는 뉴클레오티드 차이 또는 확대 중의 하나에 의해 상이한 서열이다.
ㆍ실질적인 상동성은 약 60% 이상의 서열 동일성 또는 유사성, 예를 들면 60% 서열 동일성을 의미한다.
ㆍ다작용성 하이드롤라제의 유닛 ("U")은 본 명세서에서 크릴 광범 특이성 세린 프로테아제 및 관련 효소에 관한여 사용될 때, 25℃에서 분 당 기질 1 μmol의 가수분해를 촉매하는 효소의 양으로 정의되는데, 여기서 숙시닐-ala-ala-pro-phe-p-니트로아닐리드 (시그마 케미칼 캄파니 (Sigma Chemical Co.; 미국 미저리주 세인트 루이스))가 기질이고 가수분해는 410 ㎚에서의 흡광도 변화를 통해 모니터된다.p-니트로아닐리드의 흡광 계수 ε는 8800 M-1㎝-1이고, 따라서 샘플의 dA/분을 U/분으로 변환시키기 위한 곱셈 인자는 샘플 20 ㎕가 사용될 때 5.68이다.
본 발명은 포유동물, 사람, 식용 동물, 예를 들면 소, 돼지, 양, 염소 등, 애완 동물, 예를 들면 개, 집고양이, 말 등, 및 외래 동물, 예를 들면 코끼리, 원숭이, 큰 고양이, 고래 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 후생동물의 구조상의 막에 대한 창상 및 다른 외상의 치료 방법을 제공한다. 용어 막은 광범위하게 사용되고 조직 경계 및 조직 표면, 예를 들면 경수막 및 건의 표면; 각막의 전방의 제한되는 영역; 그들의 초 내의 건을 포함하는, 내부 기관을 덮거나 또는 기관이 위치하는 강의 안에 덧대어진 막; 및 내부 및 외부 상피 및 중피를 포함한다. 용어 상피는 본 명세서에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 단순 상피, 중층 상피 및 이행 상피, 뿐만 아니라 장막의 내피를 말하는 것으로 이해할 수 있을 것이다. 각막의고유질상의 표피 및 결막 상피는 외부 상피이다. 내부 상피는 때로는 내피로 나타내어지는 표면, 예를 들면 복막, 흉막 및 심막, 및 내장, 체강벽 등과 같은 내부 구조 및 기관을 덮는 유사 막을 포함한다.
용어 외상은 임의의 창상, 상해 또는 막 또는 조직 표면에 대한 유해한 자극을 포함하기 위한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 치료되는 외상은 막 또는 조직 경계의 파괴를 야기시키거나 또는 야기시키지 않을 수 있다. 창상은 질환 상태, 예를 들면 혈관 부전증 또는 병원균과 관련된 감염, 화상 (열 또는 화학적)으로부터, 또는 사고 또는 수술에 의한 막 또는 조직 표면에 대한 외부 힘의 인가로부터 야기될 수 있다. 유해한 자극은 열 또는 부식 화학약품, 예를 들면 산 및 부식제의 작용, 뿐만 아니라 수술 동안 기관의 처치를 포함한다.
용어 각막 창상은 각막에 대한 임의의 상해, 예를 들면 병원균에 의한 감염, 각막상피 박리, 각막 궤양, 또는 사람, 식용 동물, 예를 들면 소, 돼지, 양, 염소 등, 애완 동물, 예를 들면 개, 집고양이, 말 등, 및 외래 동물, 예를 들면 코끼리, 원숭이, 큰 고양이, 고래 등을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 포유동물에서 각막 궤양을 야기시킬 수 있는 상해를 포함하기 위한 것이다. 각막 궤양을 야기시킬 수 있는 상해는 화학적, 예를 들면 부식 화학약품에 대한 노출일 수 있거나, 또는 물리적, 예를 들면 각막이식술 또는 각막절개술에서와 같이 수술 절개 또는 외부 물체에 의한 충격일 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들면, 각막 조직의 궤양형성 및 다른 상해, 뿐만 아니라 경피 창상, 예를 들면 욕창, 정맥성 궤양, 화상 또는 욕창의 치료에 특히 유용하다. 본 발명의 방법에 따른 각막 궤양의 치료는 검사하지 않고 두었을 경우 천공으로 이어질 수 있는 궤양의 성장을 지연시키거나 또는 억제한다. 본 발명의 방법에 따른 각막 궤양의 치료는 또한 기회주의적 감염의 위험을 감소시키면서 각막 또는 피부의 그의 외상전 상태로의 회복 속도인 치료 속도를 개선시키고, 흉터 조직의 형성을 막거나 또는 감소시킨다. 본 발명의 치료 방법의 바람직한 표적은 감염, 예를 들면 헤르페스 바이러스 (HSV)에 의해 야기된 바이러스 감염 또는 소에서 각막 궤양형성을 야기시키는 모락셀라 보비스 (Moraxella bovis)에서와 같이 슈도모나스 또는 모락셀라 (Moraxella) 종 중의 하나와 같은 세균 감염과 관련된 각막 궤양이다. 한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 마이크로겔, 예를 들면 가교결합된 카르복시폴리메틸렌으로부터의 마이크로겔을 함유하는 조성물 유효량을 각막의 이환된 영역에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법에 의한 경피 상처의 치료는 바람직하게는 마이크로점도에 대한 마크로점도의 비가 10,000 이하이고, 또한 보다 바람직한 실시태양에서 다작용성 크릴 유래 하이드롤라제를 함유하는 마이크로겔을 경피 창상을 입은 영역에 도포하는 것을 포함한다. 치료 담당의는 경피 창상을 입은 영역이 크기, 위치 및 창상의 심함에 따라 변하지만, 창상 그 자체 및 창상 주위의 영역 ㎝ (예를 들면 3 ㎝)을 포함한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 방법은 마찬가지로 유착, 예를 들면 내부 외과적 창상을 포함하는내인성 외상을 야기시키는 수술 과정 후에 복막과 내장 사이에 또는 복막의 인접하지 않는 영역들 사이에 주로 형성되는 유착의 발생 또는 심함을 예방 또는 감소시키는데 특히 유용하다. 유착은 병렬된 상태임에도 불구하고 보통 서로에 대하여 자유로운 이동을 갖는 2개의 조직 표면 사이의 섬유 밴드로서 처음 나타나는 흉터 조직이다. 유착은 상해 또는 유해한 자극이 1개 또는 2개의 대향하는 표면들의 일체성을 손상시킨 후 회복 과정의 결과로서 일어난다. 유해한 자극은 외상 (수술 및 사고에 의한 것 모두 포함), 감염, 및 회복 반응을 이끄는 염증을 유발할 수 있는 임의의 물리적 또는 화학적 약제를 포함한다. 유착이 이환된 표면들 사이에서의 정상적인 이동을 방해할 때, 아래에 위치하는 기관의 기능장해 또는 통증이 일어날 수 있다. 유착은 이 단계에서 쉽게 파괴되는 피브린으로 주로 이루어진 얇은 필름상 스트랜드로 시작된다. 시간이 지남에 따라 이들은 조직화되어 콜라겐을 저장시키고 맥관형성하게 된다. 이 단계에서는 단지 수술적 분할만이 유착되는 구조들을 분리시키게 된다. 이것은 속박된 기관의 기능이 외상을 입거나 또는 생육성이 위험할 때 필요하게 된다. 본 발명의 방법은 수술후의 유착의 형성을 예방하는 것에 관한 것이기 때문에, 복막의 유착과는 별도로 다른 타입의 유착에 적용할 수 있다. 예를 들면, 유착분해 (adhesiolysis), 건 수술, 흉부 수술, 복부 수술, 눈 또는 귀 수술, 척추 수술, 신경 수술, 골반 수술, 산부인과 수술 후, 뿐만 아니라 두개, 뇌 및 척수에 대한 수술 후의 유착의 형성 또는 재형성의 예방에 적용할 수 있다.
본 발명의 방법은 마이크로겔, 다작용성 하이드롤라제 또는 이들 둘을 모두포함하는 조성물의 외상 치료 유효량을 이환된 영역에 가함으로써, 외상, 예를 들면 외과적 절개, 또는 각막 궤양 또는 상해 중의 또는 부근의 이환된 영역을 치료하는 것을 포함한다. 하이드롤라제는 프로테아제, 특히 다작용성 크릴 유래 세린 프로테아제일 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 프로테아제, 바람직하게는 다작용성 크릴 유래 프로테아제를 함유할 수 있는 마이크로겔을 포함하는 조성물로 각막 창상 또는 수술 창상을 입은 영역을 치료하는 것을 포함한다.
당업계의 숙련인은 임의의 타입의 외상을 입은 영역(이환된 영역)이 외상의 성질, 크기 및 위치에 의존하게 된다는 것을 알 수 있을 것이다. 예로서, 각막 창상의 경우, 이환된 영역은 눈의 전체 노출된 표면일 수 있다. 외상이 체강과 관련된 내부 외과적 상처일 때, 이환된 영역은 수술 절개 (창상)가 이루어진 체강 중의 기관 또는 조직의 표면을 포함한다. 복강절개술의 경우, 이환된 영역은 전체 복강 및 복강 내에 위치하는 기관이고, 흉강절개술의 경우, 이환된 영역은 전체 흉강 및 흉강 내에 위치하는 기관이다. 건 수술의 경우, 이환된 영역은 절개 및 건초의 절개로부터 1 또는 2 내지 15 ㎝ 확대부를 포함하고, 건 및 그의 초를 둘러싸고 있는 조직의 표면을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명은 유효량의 마이크로겔을 이환된 영역에 가함으로써 외상 후 유착 형성을 감소시키기 위하여 내인성 외상을 입은 영역을 치료하는 것을 포함한다. 마이크로겔은 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함한다. 대표적으로는, 마이크로겔 중의 다가음이온성 중합체의 양은 0.5 내지 2.5 중량%이다. 바람직한 실시태양에서, 마이크로겔은 1%의 가교결합된 다가음이온성 중합체를 갖는다.
한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 하이드롤라제, 바람직하게는 프로테아제, 가장 바람직하게는 다작용성 크릴 유래 세린 프로테아제를 함유할 수 있는 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 이환된 영역에 가함으로써, 욕창, 정맥성 궤양, 화상 또는 욕창과 같은 경피 창상의 이환된 영역을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 본 실시태양의 조성물의 유효량은 괴사조직제거(debridement)를 촉진시키고, 악취 및 원하지 않는 누액, 및 경피 창상 내의 감염을 막고, 단지 세척하여 드레싱하였을 경우보다 빠르게 치료될 수 있도록 하는데 충분한 양이다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 크릴 유래 프로테아제, 바람직하게는 프로테아제, 보다 바람직하게는 다작용성 크릴 유래 프로테아제를 함유할 수 있는 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 가함으로써, 내인성 외상에 의해 외상을 입은 복막, 심외막, 심막, 또는 흉막의 이환된 영역을 치료하는 것을 포함한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 프로테아제, 바람직하게는 크릴 유래 프로테아제를 함유할 수 있는 상기한 마이크로겔을 포함하는 조성물 유효량을 가함으로써, 유착의 형성을 감소시키거나 또는 예방하기 위하여 수술 또는 상해에 의해 외상을 입은 척추, 뇌막, 예를 들면 경수막, 또는 신경 및 신경초 영역을 치료하는 것을 포함한다. 별법으로는, 상기 이환된 영역은 당업계에 공지되어 있는 임의의 제약학상 허용되는 부형제 담체 중의 하이드롤라제, 바람직하게는 다작용성크릴 유래 하이드롤라제로 치료될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 내인성 외상, 예를 들면 건형성술에서와 같은 수술 창상에 의해 이환된 건과 그의 초 영역을 치료하는 것을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 크릴 유래 다작용성 프로테아제 유효량을 이환된 영역에 가함으로써, 유착의 형성을 감소시키기 위하여 내인성 외상을 입은 영역을 치료하는 것을 포함한다. 크릴 유래 다작용성 프로테아제는 당업계에 공지된 임의의 제약학상 허용되는 부형제 중에서 이환된 영역에 가해질 수 있다. 제약학상 허용되는 부형제는 약물학적 활성 물질, 예를 들면 본 발명의 다작용성 프로테아제의 투여를 위한 담체로서 작용하지만, 투여하는 동물의 신체 기능 또는 활성 물질의 작용을 방해하지 않는다. 등장 식염수는 제약학상 허용되는 부형제의 한 예이다. 제약학상 허용되는 부형제는 몇 개만을 언급하자면 덱스트란, 염화칼슘, 글리신, 시트르산 및 소르비톨과 같은 당업계에 공지된 부형제를 가질 수 있다.
가교결합된 다가음이온성 중합체를 함유하는 본 발명의 조성물은 또한 장, 흉부, 두개, 건 및 산부인과 수술에 의해 이환된 영역에 유착의 형성 또는 재형성을 예방하거나 또는 감소하기 위하여 가해질 수도 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 약 0.1 ㎜ 내지 약 5 ㎜ 사이의 두께를 갖는 조성물을 포함하는 코팅을 수술 이식물의 표면에 도포함으로써, 이식물을 둘러싸는 조직의 상이한 영역들 사이에서 또는 이식물과 이식물을 둘러싸는 조직의 영역 사이에서의 유착 형성을 감소시키기 위하여 마이크로겔을 포함하는 조성물로 수술 이식물을 처리하는 방법을 제공한다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 수술 이식물은 관절 및 뼈 인공기관, 예를 들면 내이, 두개판, 및 심장 보조조정기의 인공기관, 약물 전달 이식물 및 지속 카테테르를 포함한다.
본 발명의 방법에 사용된 마이크로겔을 형성하는 가교결합된 다가음이온성 중합체는 생리학적 조건 하에서 음이온 형태로 이온화될 수 있는 관능기 및 비환식 주쇄를 갖는 가교결합된 중합체를 제공하는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 사용된 다가음이온성 중합체는 음으로 하전될 수 있는 이온화가능한 관능기를 갖는 1개 이상의 단량체 및 에틸렌계 불포화 가교결합제를 포함하는 혼합물의 중합반응에 의해 얻어질 수 있다. 대표적으로는, 이온화가능한 관능기는 염기 적정가능한 관능기이다. 카르복시기는 염기 적정가능한 관능기의 한 예이다. 다가음이온성 중합체는 또한 이온화가능한 관능기로 가수분해되어, 이것이 다시 음으로 하전될 수 있는 전구체 관능기를 갖는 전구체 중합체로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, 카르복실레이트 에스테르는 카르복시기에 대한 전구체이고, 이것은 염기로 처리하였을 때 음으로 하전된 카르복실레이트 음이온으로 된다. 전구체 중합체는 적어도 1종이 음으로 하전될 수 있는 관능기에 대한 전구체를 갖는 1종 이상의 단량체를 포함하는 혼합물의 중합반응에 의해 얻어질 수 있다. 전구체 기는 예를 들면 가수분해, 또는 전구체기의 화학적 구조의 고찰로부터 당업계의 통상의 숙련인에게 명백해질 임의의 다른 수단에 의해 음으로 하전될 수 있는 관능기로 전환될 수 있다. 전구체기의 전환은 본 발명의 조성물의 투여 전에, 투여시에 또는 투여 후에 일어나도록 만들 수 있다.
본 발명의 실행에 유용한 다가음이온성 중합체의 주쇄는 하기 화학식 I의 1개 이상의 단량체의 중합반응으로부터 유도될 수 있는 반복 단위를 포함하며, 이때 하기 화학식에서 나타낸 이중 결합은 적어도 유리 라디칼 중합반응에 의한 중합반응을 하게 된다.
상기 화학식 I에서, R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 (C1-C6알킬), 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, 히드록시알킬, 알콕시알킬, 할로알킬, 시아노알킬, 시클로알킬, 카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, 카르복시아릴로부터 선택될 수 있거나, 또는 R1, R2및 R3은 또한 아래에서 정의되는 바와 같은 -X-Y 기일 수 있다. 상기한 리스트 중에서 알킬 및 알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 시클로알킬기는 바람직하게는 적어도 하나가, 시클로알킬기의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬 고리 내의 탄소 원자들의 총수임}가 헤테로원자로 치환되도록 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되는 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는다.
화학식 I에서, X는 직접 결합이거나, 또는 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것이 바람직한 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기이다. 화학식 I에서, X는 또한 페닐렌, 바람직하게는 O, S 및 N으로부터 독립적으로선택된 2개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 아릴렌이고, 단, Y 및 R3R2C=C(R1)-이 헤테로원자에 결합되지 않는다. 페닐렌, 옥사졸릴렌, 이속사졸릴렌, 피리다지닐렌, 피리미디닐렌이 바람직한 아릴렌의 예이다.
화학식 I에서, Y는 -C(O)OR4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, 저급 알킬, 특히 C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이다. Y 기는 단량체 중에 존재할 수 있거나, 단량체는 Y에 대한 전구체 기를 포함하며, 이것은 전구체 기를 갖는 단량체로부터 제조된 중합체 상의 후중합 반응으로 형성된다. 예로서, 예를 들면 메틸 메타크릴레이트로부터 유도된 메틸 카르복실레이트 기를 갖는 중합체는 물과 반응하여 카르복시기 (Y=-COOH)를 갖는 중합체를 제조할 수 있다.
상기 화학식에서, 아릴은 페닐 또는 O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 Q-2개 {여기서, Q는 고리 중의 원자의 총수임} 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기를 의미한다.
적합한 단량체의 예로서, 몇 개를 언급하자면 아크릴산, 메타크릴산, 알릴 술폰산, 이타콘산, 말레산 또는 그의 무수물, 이타콘산, 시트라콘산을 들 수 있다. 물과 마이크로겔을 형성하는 다가음이온성 중합체를 제조하는데 사용될 수 있는 많은 다른 단량체들은 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 후앙 (Huang) 등의 미국 특허 제4,509,949호에 기재되어 있다.
마이크로겔을 형성할 수 있는 가교결합된 다가음이온성 중합체와 관련하여,용어 백본 및 주쇄는 상호교환가능하게 사용되며, 가교결합제로부터 유도되지 않은 중합체 사슬 부분을 말함을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 방법에 사용된 다가음이온성 중합체는 화학식 I로 나타내어지는 단지 1개의 단량체만으로부터 유도된 반복 단위를 갖는 단일중합체일 수 있거나, 또는 임의의 수의 화학식 I의 단량체들의 혼합물의 중합반응으로부터 유도된 멀티중합체일 수 있다. 공중합체, 삼원중합체, 사원중합체 및 다른 멀티중합체는 화학식 I의 단량체와 공중합할 수 있는 이온화가능한 기 또는 그의 전구체, 예를 들면 스티렌을 함유하지 않는 단량체로부터의 반복 단위를 포함할 수 있고, 단, 이 때, 최종 중합체는 중합체 1 그램 당 (상업적으로 허용되는 건조물 기준) 0.001 몰 이상, 바람직하게는 0.0014 몰 이상, 보다 바람직하게는 0.01 몰 이상의 염기 적정가능한 관능기를 갖는다. 염기 적정가능한 관능기는 KOH로 적정될 수 있는 관능기, 예를 들면 카르복시기이다.
바람직한 실시태양에서, 다가음이온성 중합체는 가교결합되어 물과 혼합되었을 때 마이크로겔을 형성한다. 바람직한 가교결합된 다가음이온성 중합체는 화학적으로 가교결합된다. 화학적 가교결합은 이온 또는 공유 결합일 수 있으며, 바람직하게는 공유 결합에 의한 것이다. 가교결합은 다가음이온성 중합체가 제조될 때 도입될 수 있거나, 또는 다가음이온성 중합체가 제조된 후에 도입될 수 있다.
바람직하게는, 공유 결합에 의한 가교결합은 화학식 I로 나타내어지는 단량체와 동일한 메카니즘, 바람직하게는 유리 라디칼 메카니즘에 의해 중합되는 2개 이상의 에틸렌계 불포화 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 1개 이상의 가교결합제를 사용하여 다가음이온성 중합체가 제조될 때 도입된다. 다가음이온성 중합체가 제조될 때 도입될 수 있는 가교결합제의 예는 디비닐 벤젠 및 다가 알콜의 알케닐 에테르, 예를 들면 특히 알드리히 케미칼(Aldrich Chemical)로부터 입수할 수 있는 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르 (카탈로그 25-172-0)이다. 상업적으로 입수할 수 있는 에틸렌계 불포화 에테르 또는 3개 이상의 히드록실기를 갖는 다가 알콜의 에스테르는 대표적으로 히드록실기들 중의 일부가 유도되지 않을 수 있는 혼합물로서 제공된다. 본 명세서에서 특정 에테르화 또는 에스테르화도를 언급할 때, 예를 들면 트리- 또는 테트라-는 나타낸 에테르화도 또는 에스테르화도보다 낮거나 또는 높은 에테르화된 또는 에스테르화된 다가 알콜 소량을 포함하는 것으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 에테르화된 또는 에스테르화된 다가 알콜의 상업적으로 중요한 혼합물을 말하는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, 이중 결합의 특정 몰분율에 대한 기준은 이러한 유도반응도에서의 공지된 변화 때문에 예측될 수 있는 변화를 포함하는 것으로 이해될 수 있을 것이다.
바람직하게는, 가교결합제의 양은 낮게 유지된다. 바람직한 가교결합된 다가음이온성 중합체는 물과 마이크로겔을 형성하고, 상기한 타입의 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제 및 화학식 I의 1종 이상의 단량체의 혼합물의 중합반응에 의해 제조된다. 사용된 가교결합제 또는 가교결합제들의 양은 물과 합하였을 때 마이크로겔을 형성하는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하는데 효과적인 양이다. 에틸렌계 불포화 가교결합제를 사용하여 다가음이온성 중합체의 제조시에 가교결합을 형성할 때, 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제의 에틸렌계 이중결합은 바람직하게는 1종 이상의 단량체 및 1종 이상의 가교결합제의 혼합물 중의 모든 에틸렌계 불포화 이중 결합의 0.02 몰분율 미만, 바람직하게는 0.01 몰분율 미만이 된다. 대표적으로는, 에틸렌계 불포화 가교결합제는 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 모든 에틸렌계 이중 결합의 0.001 몰분율 이상이 된다. 이들 몰분율은 에틸렌계 불포화 가교결합제 중의 에틸렌 결합의 공칭 수에 기초하여 계산되고, 상기한 바와 같이 상업적으로 입수할 수 있는 에틸렌계 불포화 가교결합제의 분자 당 이중 결합의 평균 수에 있어서의 공지된 변화에 대하여 조정된다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 방법의 실행에 사용된 다가음이온성 중합체는, 중합체가 상업적으로 허용되는 "건조" 제제, 예를 들면 중합체 및 예를 들면 2% 이하의 수분, 잔류 용매 또는 잔류 단량체를 함유하는 제제 중에 있을 때, 약 100 이상, 보다 바람직하게는 약 200 이상, 더욱 바람직하게는 약 400 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 600 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 700 이상의 산 가를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 다가음이온성 중합체는 상업적으로 허용되는 건조 제제 중에서 중합체 1 그램 당 0.001 몰 이상, 바람직하게는 0.0014 몰 이상, 보다 바람직하게는 0.014 몰 이상의 염기 적정가능한 관능기를 갖는다.
다가음이온성 중합체는 바람직하게는, 0.5% w/v 중화 수용액 (예를 들면, pH 6 내지 8) 중에서, 마크로점도의 척도인 브룩필드 (Brookfield) RVF 또는 RVT 점도 값이 약 2,000 cP 이상, 보다 바람직하게는 약 4,000 cP 이상 (25℃에서 20 rpm)이다. 이들 점도 파라미터들은 중합체의 산 형태에 대한 것이다 [중합체 용액의 마크로점도 (브룩필드 점도) 및 마이크로점도에 대해서는 R.Y. Lochhead 등,Polymers in Aqueous Media,pp. 113-147, 1989 참조]. 그러나, 특정 바람직한 실시태양에서, 마크로점도는 마이크로점도보다 약 100,000 배 이하, 바람직하게는 약 10,000 배 이하 더 크다.
특정 실시태양에서, 마이크로겔은 1 내지 500 μm 사이의 입자 크기를 가질 수 있다. 다른 실시태양에서, 마이크로겔은 10 내지 500 μm 사이의 입자 크기를 가질 수 있다.
특정 실시태양에서, 가교결합된 다가음이온성 중합체는 아크릴산의 가교결합된 단일중합체 또는 공중합체, 예를 들면 비에프 굿리치 캄파니(BFGoodrich Company), 스페셜티 폴리머즈 앤드 케미칼즈 디비젼 (미국 오하이오주 브렉스빌)이 상표명 카르보폴 (Carbopol) 하에 판매하고 있는 중합체, 예를 들면 카르보폴 971P, 카르보폴 934P 및 카르보폴 974P (바람직한 순서대로 기재함, 즉 934P보다 971P가 더 및 974P보다 934P가 더 바람직함)이다. 이들 타입의 중합체는 실질적으로 비환식 지방족 백본을 갖고, 카르복시폴리메틸렌 또는 카르보머로 명명되어 왔고, 이것은 임의의 적합한 수의 단량체들로 이루어질 수 있으며, 특정 치료에서는 창상을 입은 영역에 가해지는 제제 당 가변성 갯수의 단량체들 또는 균일한 갯수의 상기 단량체들로 이루어질 수 있다. 추가로, 카르복시폴리메틸렌은 폴리메틸렌 백본에 부착된 가변적 갯수의 카르복실기를 가질 수 있다. 가교결합제로서, 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르 (다른 단량체들을 기준하여, 0.1% 내지 2.5%)가 적합하다.
적합한 염은 마이크로겔과 혼합될 수 있으며, 이들의 적합성은 마이크로겔 그자체가 마이크로겔이 접촉하게 되는 외상을 입은 각막, 복막 또는 임의의 다른 조직에 해를 야기시키지 않는다는 요구조건에 의해 결정된다. 적합한 염으로는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 특히 생리학적 농도로 제공될 때의 염화 나트륨 또는 칼륨을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 방법의 실행에 사용된 조성물은 글리세롤, 상기한 카르복시폴리메틸렌, 및 증류수를 포함할 수 있고, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 알킬 아민, 예를 들면 디이소프로판올아민 (DIPA) 등과 같은 염기를 사용하여 pH에 관하여 조절한다. 적합한 농도의 글리세롤의 모액은 증류수로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 87% (w/w) 글리세롤 용액이고, 나머지는 증류수이다. 수산화나트륨과 같은 적합한 염기 용액의 모액 또한 증류수로 제조될 수 있으며, 예를 들면 10% (w/w) 수산화나트륨 용액이고, 나머지는 물이다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 모액의 적절한 희석물을 제조함으로써, 본 발명의 방법의 실행에 유용한 마이크로겔은 바람직하게는 하기 범위의 상기한 성분들의 최종 농도를 갖는다: (1) 글리세롤, 약 0 내지 약 60%; (2) 카르복시폴리메틸렌, 약 0.1% 내지 약 10% (w/w), 보다 바람직하게는 약 0.4% 내지 약 7%, 더욱 더 바람직하게는 약 1% 내지 약 5%; 제제의 나머지는 증류수이다. 수산화나트륨 10% 모액은 pH 조절에 사용되어, 본질적으로 중성으로 제조된 pH, 보다 바람직하게는 약 7 내지 약 7.8의 pH, 더욱 더 바람직하게는 약 7.2 내지 약 7.6의 pH를 생성시킨다.
아래에서 설명되는 다작용성 하이드롤라제를 포함하고자 할 때, 마이크로겔은 또한 동결 건조시에, 또는 증류수를 이용한 이들의 재구성시에, 또는 이 두 가지 경우 모두에서 다작용성 하이드롤라제를 보호하기 위한 부형제와 함께 제조될 수 있다. 상기 부형제의 예로는, 염화칼슘, 글리신, 시트르산, 소르비톨 및 덱스트란을 들 수 있다. 동결 건조를 의도할 때 예를 들면, 상기한 다작용성 하이드롤라제 50 유닛 (유닛은 상기에서 정의하였음)을 함유하는 바이알은 바람직하게는 주어진 농도 범위 내에서 하기하는 부형제들을 포함한다: (1) 염화칼슘, 약 0.6 mM 내지 약 1 mM; (2) 글리신, 0 내지 약 12 mM 이하, 바람직하게는 약 6 mM 내지 약 10 mM, 가장 바람직하게는 약 8 mM; (3) 시트르산, 0 내지 최대 약 12 mM, 바람직하게는 약 6 mM 내지 약 10 mM, 가방 바람직하게는 약 8 mM, (4) 소르비톨, 약 100 mM 내지 약 200 mM, 바람직하게는 약 150 mM 내지 170 mM, 가장 바람직하게는 약 160 mM, 및 (5) 덱스트란, 약 1% 내지 약 10 중량%, 바람직하게는 약 7% 내지 약 8 중량%, 가장 바람직하게는 6 중량%.
본 발명의 바람직한 실시태양은 임의적으로는 적합한 다작용성 하이드롤라제와 혼합된 상기한 마이크로겔을 이용한 창상, 특히 경피 창상의 치료를 제공한다. 다작용성 하이드롤라제는 바람직하게는 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및 엑소 펩티다제 활성으로 이루어진 군으로부터의 1종에 대응하는 단백질분해 활성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 다작용성 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 2가지 이상; 더 바람직하게는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상; 더욱 더 바람직하게는 상기 단백질분해 활성들 중의 4가지 이상, 및 가장 바람직하게는 상기한 모든 단백질분해 활성을 갖는다.
본 발명의 방법의 면에서 사용된 조성물은 치료하고자 하는 영역에 관하여 국소 적용하기 위한 것이다. 별법으로는, 전신 및 경구 치료 방식 또한 의도할 수 있다. 마이크로겔은 페이스트, 젤리, 또는 예비수화되거나 또는 동일 장소에서 체액에 의해 수화될 수 있는 시트로서 적용될 수 있다.
내인성 외상, 예를 들면 유착을 일으키기 쉬운 내부 외과적 창상을 입은 영역에 국소 투여하는 경우, 마이크로겔은 페이스트, 젤리, 또는 부을 수 있는 액체 제제로 투여될 수 있다. 내인성 외상 치료의 경우, 다작용성 크릴 유래 단백질은 제약학상 허용되는 부형제, 예를 들면 등장 식염수 중에서 투여될 수 있다. 다작용성 단백질은 또한 마이크로겔을 포함하는 조성물 중에 내부 외과적 창상을 입은 영역에 투여될 수도 있다. 바람직한 실시태양에서, 다작용성 단백질은 마이크로겔을 함유하는 조성물 중에서 수술 창상을 입은 영역에 투여된다. 특히 바람직한 마이크로겔은 가교결합된 다가음이온성 중합체를 함유한다. 가교결합된 카르복시폴리메틸렌이 바람직한 가교결합된 다가음이온성 중합체이다.
막, 예를 들면 복막, 흉막 또는 심막에 대한 외상의 치료 또는 내부 기관에 대한 외상의 치료 방법은 외상 부위 및 이환된 영역에 본 발명의 조성물을 수술적으로 투여하는 것을 포함한다. 수술적 유착의 형성 또는 재형성을 억제하기 위한 처리는 수술적으로 수행된다.
각막 창상의 치료는 표준 제약학적 관행에 따라 임의의 제약학상 허용되는 부형제 중의 하이드롤라제를 사용하여 행할 수 있다. 부형제는 마이크로겔일 수 있다. 치료는 눈에 점적액 또는 겔을 가하여 행한다. 눈 투여의 경우, 연고 또는점적할 수 있는 액체를 당업계에 공지된 눈 전달 시스템, 예를 들면 어플리케이터 또는 눈 드러퍼 (dropper)에 의해 전달될 수 있다. 상기 각막 창상 치료용 조성물은 점액의사물 (mucomimetics), 예를 들면 하이알루론산, 콘드로이틴 술페이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 또는 폴리비닐 알콜, 방부제, 예를 들면 소르브산, EDTA 또는 벤질크로늄 염산염 및 사용가능한 양의 희석제 및(또는) 담체를 포함할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 눈에 투여하고자 하는 다작용성 단백질을 함유하는 조성물은 마이크로겔, 특히 상기한 타입의 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔을 포함한다.
예를 들면 헤르페스 각막염 감염에 의해 야기되는 것과 같은 각막 궤양의 치료 방법은 바람직하게는 상기한 다작용성 하이드롤라제를 포함하는 조성물을 이환된 눈에 투여하는 것을 포함하는데, 이 때 다작용성 하이드롤라제 각막 궤양 치료 유효량이 투여되며, 다작용성 하이드롤라제는 바람직하게는 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 또는 엑소 펩티다제 활성 중의 2가지 이상을 갖고, 기준 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기한 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상 및 기준 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 갖는다. 더욱 더 바람직하게는, 상기한 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상 및 기준 서열과 약 90% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 더욱 더 바람직하게는, 상기한 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상 및 기준 서열과 약 90% 이상의 서열 유사성을 갖는다. 더욱 더 바람직하게는, 상기한 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상 및 기준서열과 약 95% 이상의 서열 유사성을 갖는다.
유착의 예방에 관한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 코르티손과 같은 코르티코스테로이드 단독 또는 항히스타민제와의 혼합물을 이용한 외상을 입은 막의 예비치료 또는 동시 치료를 모두 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 면에서 사용된 다작용성 하이드롤라제는 바람직하게는 크릴 유래 하이드롤라제, 예를 들면 프로테이나제이다. 보다 바람직하게는, 다작용성 하이드롤라제는 비효소적 작용, 뿐만 아니라 효소적 작용을 가질 수 있는 다작용성 단백질의 일부분이다. 남극 크릴을 포함하는 갑각강이 본 발명의 다작용성 단백질의 유용한 공급원이다. "다작용성 활성"을 갖는 단백질은 본 명세서에서, 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 또는 엑소 펩티다제 활성, 또는 아시알로 GM1세라마이드 결합 활성 중의 1가지 이상을 포함하는 것으로 정의된다. 크릴 유래 다작용성 단백질의 정제에 대해서는, 아래 및 예를 들면 본 명세서에서 참고문헌으로 인용하고 있는 발명의 명칭이 "Multifunctional Enzyme"이고 발명자가 드페이어(deFaire) 등인 미국 특허 출원 제08/600,273호 (1996년 2월 8일 출원)를 참조할 수 있다.
상기한 하이드롤라제는 상기 단백질분해 활성들 중의 3가지 이상 및 기준 서열과 약 90% 이상의 서열 유사성을 갖는다.
내부 표면에 대한 치료를 포함하는 국소 치료의 경우, 투여 당의 다작용성 크릴 유래 단백질의 바람직한 적합한 투여량은 대표적으로 크림, 연고, 마이크로겔등과 같은 담체 0.5 내지 5 ㎜의 층이 도포될 때 약 0.01 U/㎖ 내지 약 10 U/㎖ 범위이고, 보다 바람직하게는 약 0.01 U/㎖ 내지 1.0 U/㎖, 더욱 더 바람직하게는 약 0.2 U/㎖이다. 이 투여량 범위는 겔, 연고, 크림, 액체, 스프레이, 에어로졸 등과 같은 부형제에 적용된다. 창상 괴사조직제거와 같은 몇몇 실시태양에서, 보다 큰 투여량이 처음부터 사용될 수 있다. 로젠지는 바람직하게는 약 0.01 U 내지 약 10 U, 보다 바람직하게는 약 0.01 U 내지 약 1.0 U, 더욱 더 바람직하게는 약 0.2 U를 전달하도록 디자인된다. 모두 외부 치료의 경우, 단백질 조성물은 일반적으로 1일 당 약 1회 내지 약 10회, 바람직하게는 약 2회 내지 약 5회 투여된다. 이들 값은 물론, 의료 업계의 통상의 숙련인이 인식할 수 있는 바와 같이 질환의 타입 및 심함, 환자의 연령, 체중 및 의학적 상태를 포함하는 많은 인자들에 따라 변할 수 있다. 실질적으로 보다 높은 투여량이 상당한 부작용없이 사용될 수 있을 것으로 생각된다. 일반적으로, 다작용성 단백질은 유효량으로 투여되게 된다.
사람이 바람직한 치료용 개체이다. 그러나, 다작용성 단백질은 본 명세서에 비추어 당업계의 통상의 숙련인이 알 수 있을 바와 같이, 동물, 바람직하게는 포유동물을 치료하기 위하여 많은 수의학적 면에서 사용될 수 있다.
투여하고자 하는 조성물은 바람직하게는 생리학적으로 적합한 pH, 예를 들면 pH 6.5 내지 pH 7.5로 완충된다. 효소가 조성물 중에 포함될 때, 염 및 안정화제는 효소를 안정화시키거나 또는 활성을 증가시키는데 효과적인 양으로 첨가될 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서, 본 발명에 사용된 다작용성 하이드롤라제는 바람직하게는 상기한 단백질분해 활성 및 기준 서열과 약 60% 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 보다 바람직하게는, 다작용성 하이드롤라제는 상기한 기준 서열과 약 70% 이상의 서열 동일성 또는 유사성, 더 바람직하게는 상기한 기준 서열과 약 80% 또는 85% 이상의 서열 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는 상기한 기준 서열과 약 90% 또는 95% 이상의 서열 동일성 또는 유사성, 및 가장 바람직하게는 상기한 기준 서열과 약 97% 이상의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 상기 나타낸 유사성 %도 바람직하지만, 동일성 %가 더욱 바람직하다.
서방형 제제, 리포좀 제제 및 중합체 매트릭스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 많은 다른 투여 부형제를 당업계의 통상의 숙련인은 명백하게 알 수 있다.
다작용성 하이드롤라제 또는 다른 약제, 예를 들면 상기한 항생제와 함께 또는 항생제 없이 마이크로겔을 투여함으로써 외상을 치료하는 방법은 바람직하게는 적합한 시간 동안에 행해지며, 시간의 적합성은 이환된 조직 및 치료하고자 하는 상태의 종류 및 심함의 관찰로부터 숙련된 담당의가 알 수 있을 것이다. 치료는 바람직하게는 적어도 이환된 창상의 치료가 완료될 때까지, 보다 바람직하게는 적어도 그 후 추가로 5일 동안 투여된다. 각막 창상은 2 내지 35일 동안 치료될 수 있다. 다른 경우, 치료는 약 10일 이상 동안, 보다 바람직하게는 약 20일 이상 동안, 더욱 바람직하게는 약 28 또는 35일 이상 동안 행해진다. 마이크로겔 및 다작용성 하이드롤라제를 함유하는 조성물을 이용한 경피 창상의 치료는 7 내지 42일 동안일 수 있다. 치료는 바람직하게는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 눈으로의 국소 투여 방법을 사용하여 1일 당 1회 이상의 투여를 통해, 보다 바람직하게는 1일 당 2회 내지 약 6회 이하의 투여를 통해 수행된다.
상기한 다작용성 하이드롤라제는 약 20 kd 내지 약 40 kd의 바람직한 분자량을 갖고, 보다 바람직하게는 분자량은 약 26 kd 내지 약 32 kd이다.
바람직한 다작용성 하이드롤라제는 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II를 들 수 있으나, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기한 특정 효소들은 각각 하기하는 펩티드 서열들을 포함한다: 파내우스 바나메이 1, I-V-G-G-V-E-A-T-P-H-S-W-P-H-Q-A-A-L-F-I-D-D-M-Y-F(서열 13);파내우스 바나메이 2, I-V-G-G-V-E-A-T-P-H-S-X-P-H-Q-A-A-L-F-I (서열 14);파내우스 모노돈 트립틱 I-V-G-G-T-A-V-T-P-G-E-F-P-Y-Q-L-S-F-Q-D-S-I-E-G-V (서열 15);파내우스 모노돈 키모트립틱-1,I-V-G-G-V-E-A-V-P-G-V-W-P-Y-Q-A-A-L-F-I-I-D-M-Y-F (서열 16);파내우스 모노돈 키모트립틱-2, I-V-G-G-V-E-A-V-P-H-S-W-P-Y-Q-A-A-L-F-I-I-D-M-Y-F (서열 17);우카 푸길라터 효소 I, I-V-G-G-V-E-A-V-P-N-S-W-P-H-Q-A-A-L-F-I-D-D-M-Y-F (서열 18);우카 푸길라터 효소II, I-V-G-G-Q-D-A-T-P-G-Q-F-P-Y-Q-L-S-F-Q-D (서열 19); 캄차카 게 IA, I-V-G-G-Q-E-A-S-P-G-S-W-P-X-Q-V-G-L-F-F (서열 20);캄차카 게 IIA, I-V-G-G-T-E-V-T-P-G-E-I-P-Y-Q-L-S-L-Q-D (서열 21);캄차카 IIB, I-V-G-G-T-E-V-T-P-G-E-I-P-Y-Q-L-S-F-Q-D (서열 22);캄차카 IIC, I-V-G-G-S-E-A-T-S-G-Q-F-P-Y-Q-X-S-F-Q-D (서열 23);가재 프로테아제 1, I-V-G-G-T-D-A-T-L-G-E-F-P-Y-Q-L-S-F-Q-N (서열 24);연어 효소 1, I-V-G-G-Y-E-C-K-A-Y-S-Q-A-Y-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y-C (서열 25);대서양 대구 I, I-V-G-G-Y-E-C-T-K-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y-C (서열 26);또는 대서양 대구 II, I-V-G-G-Y-E-C-T-R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S-G-Y-H-Y-C (서열 27).
본 발명의 면에 사용된 가장 바람직한 다작용성 하이드롤라제는 크릴 다작용성 하이드롤라제의 정제된 제제인 PHM-101이다.
본 발명의 방법은 적합한 항생제를 이용한, 이환된 조직의 전치료 또는 동시 치료를 포함할 수 있다. 적합한 항생제는 생리학적 조건 중에 놓여졌을 때 그의 효능을 보유하는 것이다. 몇몇 항생제, 예를 들면 시프로플록사신을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는 항생제가 조직에 대한 국소적 용도에 바람직하다. 항생제는 다작용성 하이드롤라제와 함께, 또는 없이 마이크로겔을 이용한 치료에 포함될 수 있다.
본 발명은 다작용성 단백질을 코딩하는 핵산에 결합되는 핵산을 포함하는 핵산 (예를 들면 리보핵산 또는 데옥시리보핵산) 및 폴리펩티드 및 그의 유사물의 용도, 뿐만 아니라 제약학상 조성물, 유전자 치료법 및 다작용성 단백질에 대한 항체 및 항혈청을 제공한다. 핵산 및 폴리펩티드의 일부는 자연적으로 발생되는 변이체 (이소폼)인 반면, 나머지들은 자연적으로 발생되지 않는 (즉, 유전자조작된) 변이체이다.
1. 핵산
본 명세서에서 발표한 핵산 서열들은 본 발명의 면에서 사용된 다작용성 단백질을 코딩한다. 발표된 핵산은 상기한 다작용성 단백질의 생성에 유용한 것으로 생각된다. 따라서, 상기 핵산은 바람직하게는 한 가닥 및 두 가닥 데옥시리보핵산 (DNAs), 가장 바람직하게는 두 가닥 데옥시리보핵산이다. 그러나, 이들은 또한 비제한적으로 리보핵산 (RNAs), 뿐만 아니라 하이브리드 RNA:DNA 두 가닥 분자일 수도 있다.
다작용성 단백질을 코딩하는 핵산은 다작용성 단백질 발현 유기체 중에서 발견되는 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는, 다작용성 단백질을 코딩하는 천연 또는 합성의 모든 다작용성 단백질 코딩 핵산, RNA, DNA 또는 cDNA 또는 그의 상보적 스트랜드를 포함한다. 재조합 발현 목적을 위하여, 합성 다작용성 단백질 코딩 핵산을 디자인하는데 있어서 유리하게는 상기 핵산이 발현되어야 하는 유기체에 대한 코돈 사용 선호도가 고려된다.
본 발명의 핵산 서열은 예를 들면 크릴 유래 단백질의 몇가지 이소폼 중의 하나를 코딩할 수 있다. 서열 2, 4 및 6은 중복 아미노산에 있어서 서로 약 88-89% 동일성을 공유하는 3개의 이소폼을 나타낸다. 예를 들면, 제1 이소폼의 DNA 서열, 서열 1을 약 88% 동일한 뉴클레오티드를 공유하는 제2 이소폼의 DNA 서열, 서열 3을 비교하는 도 1을 참조할 수 있다. 또한, 약 89% 동일한 뉴클레오티드를 공유하는 제1 이소폼 (서열 1) 및 제3 이소폼의 DNA 서열 (서열 5)의 비교를 제공하는 도 3을 참조할 수 있다.
이들 이소폼은 모두 개시 코돈 메티오닌이 부족하다. 또한, 이들 3개의 이소폼 중 2개는 시그널 서열로서 작용할 수 있는 소수성 서열, 즉 제1 이소폼 (서열 2)의 아미노산 잔기 1 내지 11인 LLLALVAAASA (서열 28) 및 제3 이소폼 (서열 6)의 아미노산 잔기 1 내지 19인 PGRSRIALLLALVAATASA (서열 29)를 함유한다. 막을 통한 미완성 폴리펩티드의 전좌에 기여하는 "시그널"펩티드로서 작용하기 위해 중요한 특징은 잘 특성화되어 있어 (예를 들면, von Heijne,Curr. Opin. Cell Biol.2: 604-608, 1990; von Heijne,J.Mol.Biol. 184: 99-105, 1985; von Heijne,J.Mol.Biol. 173: 243-251, 1984 참조), 필요에 따라 재조합 방법을 사용하여 시그널 펩티드 기능을 개선시킬 수 있다. 본 발명의 소수성 리더 서열 내로 치환되거나 이들과 교환될 수 있는 이들 본 하이네 (von Heijne)로부터의 서열들은 본 명세서에서 참고로 인용된다.
이들 2개의 이소폼은 추가로 프로단백질 (pro-protein) 세그먼트를 함유한다. 프로단백질 세그먼트는 전구체 단백질 중에는 존재하지만, 성숙 당백질 중에는 없는, 소수성 세그먼트 이외의 단백질 세그먼트이다. 특정 이론으로 제한되고자 함이 아니라, 프로단백질 세그먼트의 적어도 일부분이 여전히 성숙 단백질에 부착될 수 있는 것이 가능하다. 추가로, 크릴 유래 다작용성 단백질은 디술파이드 결합에 의해 연결된 2개의 사슬을 가질 수 있다. 예를 들면, 프로단백질 세그먼트 중의 시스테인은 성숙 단백질 중의 디술파이드 결합에 참여할 수 있다.
제1 이소폼에서, 프로단백질 세그먼트는 예를 들면, 제1 이소폼, 서열 2의 아미노산 잔기 12 내지 63에 대응하는 하기하는 서열을 갖는다: AEWRWQFRHPTVTPNPRAKNPFRVTKSSPVQPPAVRGTKAVENCGPVAPRNK (서열 30). 제3 이소폼은서열 6 중의 아미노산 잔기 20 내지 71에 대응하는 하기하는 서열을 갖는 프로단백질 세그먼트를 갖는다: SEWRWQFRHPTVTPNPRANNPFRPSKVAPVQPPAVRGTKAVENCGPVAPKNK (서열 31). 이들 폴리펩티드의 잔류 아미노산 서열 (소수성 세그먼트 및 프로단백질 세그먼트 이외의)은 성숙 당백질을 나타낸다. 약 89% 동일한 아미노산을 공유하는 제1 이소폼 및 제2 이소폼의 아미노산 서열의 비교를 제공하는 도 2를 참조할 수 있다. 추가로, 모든 3개의 이소폼의 아미노산 서열들의 비교를 제공하는 도 4를 참조할 수 있다.
본 발명의 추가의 실시태양은 바람직하게는 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 하기하는 예들은 서열 2의 프로단백질 세그먼트로부터 유도되고, 바람직하게는 성숙 단백질 중에 존재하는 폴리펩티드이다. 특정 이론으로 제한되고자 함이 아니라, 이들 폴리펩티드는 예를 들면 성숙 단백질일 수 있는, 제2 아미노산 사슬에 디술파이드 결합을 통해 연결되는 제1 아미노산 사슬의 적어도 일부분을 형성할 수 있다. 예를 들면, 특정 바람직한 실시태양에서, 핵산은 폴리펩티드 서열, 예를 들면 AVENCGPVAPR (서열 32), AVENCGPVAPRNK (서열 33), GTKAVENCGPVAPR (서열 34), GTKAVENCGPVAPRNK (서열 35), SSPVQPPAVRGTKAVENCGPVAPR (서열 36), SSPVQPPAVRGTKAVENCGPVAPRNK (서열 37), 또는 AVENCGPVAN (서열 38), 또는 기준 서열들 중의 하나의 대응하는 서열로 나타낸 바와 같이 이들과 상이한 서열을 추가로 코딩한다. 특정 이론으로 제한되고자 함이 아니라, 상기 열거한 폴리펩티드 (서열 32-38)는 디술파이드 결합을 통해 성숙크릴 유래 다작용성 단백질의 나머지 부분에 연결될 수 있다. 예를 들면, 이들 서열들 (서열 32-38) 중의 하나에 존재하는 시스테인 잔기는 예를 들면, 성숙 단백질 중의 시스테인, 예를 들면 서열 2의 잔기 171에서의 시스테인에 대응하는 시스테인과 함께 디술파이드 결합에 참여할 수 있다. 그러므로 이들 서열들 (서열 32-38) 중의 적어도 하나가 본 발명의 바람직한 실시태양에 존재한다. 예를 들면, 서열 2의 아미노산 서열과 함께 정렬시킨, 수 개의 단백질, 즉 인자 VII, 트롬빈, 칼리크레인, 일본 참게 [타키플레우스 트리덴타투스 (Tachypleus tridentatus)]로부터 유도된 리물러스 (Limulus) 프로응혈 효소, 플라스민, 헵신 및 인자 XII의 아미노산 서열들을 나타내는 도 5를 참조할 수 있다. 리물러스 단백질 및 헵신을 제외하고는 크릴 유래 다작용성 단백질과 정렬시킨 모든 단백질들은 인체 혈액 응고 경로에 관여한다.
임의의 특정 이론으로 제한되고자 함이 아니라, 크릴 유래 다작용성 단백질은 서열 2, 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 것보다 다소 더 큰 N-말단을 포함한다. 그러나, 실시예에서 예시하는 바와 같이, 작용 효소는 본 명세서에서 열거한 서열들로부터 구성될 수 있다.
본 발명의 핵산은 예를 들면, 상기 이소폼으로부터 키메라 폴리펩티드를 형성하는 것에 기초하여 유전자조작된 다작용성 단백질을 코딩할 수 있다. 자연적으로 발생되는 한 이소폼의 프로단백질 세그먼트 또는 소수성 세그먼트는 임의로 자연적으로 발생되는 다른 이소폼 또는 이소폼들의 성숙 단백질 서열과 일치될 수 있다. 예를 들면, 서열 2의 성숙 단백질 세그먼트는 아미노산 63 내지 300인 것으로 생각되어 진다. 예를 들면, 서열 4는 서열 2의 성숙 단백질 세그먼트의 길이의 약75%의 성숙 단백질 서열을 갖는 제2 이소폼의 부분적인 서열이다. 그러므로, 본 발명의 특정 실시태양은 기재한 폴리펩티드들 중 1개 이상이 정렬된 다른 세그먼트들과 교환되는 키메라 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들면, 서열 4의 N-말단은 서열 2에서 발견되는 성숙 단백질의 길이의 나머지 25%, 즉 아미노산 64 내지 116에 연결된다. 본 발명의 다른 실시태양에서, 가정적 키메라 서열은 서열 4의 아미노산 서열과 함께 서열 2의 단백질의 처음 63개의 아미노산을 포함한다. 예를 들면 서열 4와 함께 서열 2를 정렬시킨 도 2를 참조할 수 있다.
예를 들면, 폴리펩티드들 중의 하나는 N-말단에 펩티드 서열, 예를 들면 MPGRSRIALLLALVAATASA (서열 39) 또는 M(X)NPGRSRIALLLALVLAATASA (서열 40) 또는 MPGRSRIALLLALVAAASA (서열 48) 또는 M(X)NPGRSRIALLLALVLAAASA (서열 49) {여기서, n은 1 내지 16, 바람직하게는 1 내지 12, 별법으로는 1 내지 6이고, 각 X는 독립적으로 소수성 리더 서열의 특성에 일치하도록 선택된 아미노산을 나타냄}을 첨가함으로써 번형시킬 수 있다. 임의의 다른 작용 시그널 서열, 예를 들면 문헌[von Heijne,J. Mol. Biol.184: 99-105, 1985]에 인용된 것들 중의 하나도 또한 본 발명의 단백질의 엑스포트 버젼 (export version)을 제조하는데 사용될 수 있다. "ASA" 뒤에 위치한 서열은 한 바람직한 실시태양에서, 시그널 서열이 세포 과정 동안에 분해될 수 있도록 한다. 서열 2, 6, 8, 10 및 12에서 발견된 리더 서열로부터 유도된 서열 39 및 40은 문헌[von Heijne,J. Mol. Biol.184: 99-105, 1985]에 기재된 최소한의 특징을 갖는다: 잔기 -1 내지 -5에서의 c-영역; -6 내지 -14 서열중의 7개 이상의 잔기의 h-영역, 이 때 h-영역 중의 소수성 잔기들 사이에 Ser, Gly, Thr 또는 Pro 잔기가 없음 (비록 1개 정도는 가끔 허용될 수도 있음); 및 1개 이상의 잔기의 양으로 하전된 n-영역. n-영역은 평균 1.7개의 양으로 하전된 잔기를 갖기 쉬우며, 이 규칙과 일관되게, 상기한 서열의 것은 2개의 상기 잔기를 갖는다. 이들 영역을 아래에서 서열 2 및 6으로부터 유도된 서열로 예시한다:
문헌[von Heijne,J. Mol. Biol.184: 99-105, 1985]의 표 2는 상기 서열이 동정된 다른 시그널 서열과 함께 얼마나 잘 행동하는지를 예시한다. 다른 바람직한 절단 관련 특성들이 이들 서열에 적용된다. 문헌[von Heijne,J. Mol. Biol.173: 243-251, 1984]을 참고할 수 있다. 예를 들면, 절단된 서열은 상기한 바와 같이 -1 및 -3 위치에서 Ala의 강한 우세를 갖는다. 큰 극성 잔기 및 하전된 잔기는 상기한 바와 같이 +1 내지 +5 서열 중에 풍부하다. 알라닌은 상기한 바와 같이 -2, +2 및 +5 위치에서 두드러지게 감소된다.
특정 이론으로 형성되고자 함이 아니더라도, 각각 글루타민, 메티오닌, 라이신 및 아스파라긴을 포함하는, 서열 2의 아미노산 잔기 68에 대응하는 위치에서 상이한 아미노산을 갖는 약 4 내지 5개 이상의 이소폼이 있는 것으로 생각된다. 상기 이소폼 및 다른 동종 폴리펩티드는 하기하는 기술을 사용하여 단리될 수 있다.
다작용성 단백질 코딩 핵산의 유전자조작된 변이체를 구성하기 위하여, 임의의 이소폼의 원 서열을 출발 지점으로 사용하여 특정 요구에 적합하도록 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 특정 실시태양에서, 핵산 서열은 서열 2의 아미노산 1-63을 포함하는, 성숙 단백질 중에 없는 아미노산 서열의 5' 부분을 코딩하는 서열을 포함할 필요는 없다. 따라서, 본 발명의 특정 실시태양에서, 코딩된 폴리펩티드는 단지 성숙 단백질과 동종이거나 또는 성숙 단백질의 서열만을 갖고, 세포 과정 동안에 제거되는 N-말단 부분에 대응하는 세그먼트, 즉 소수성 세그먼트 및 프로단백질 세그먼트는 갖지 않는다.
그럼에도 불구하고, 본 발명의 핵산의 바람직한 실시태양에서, 서열 2의 아미노산 1-63을 포함하는, 성숙 단백질 중에 없는 아미노산 서열의 N-말단 부분을 코딩하는 서열이 핵산 서열 중에 포함된다.
합성 다작용성 단백질을 형성하는 아미노산 서열은 바람직하게는 크릴 유래 다작용성 단백질의 효소적으로 활성 세그먼트, 예를 들면 서열 2의 아미노산 64-300, 특히 세린 프로테아제의 촉매 메카니즘과 관련된 잔기 104에서의 히스티딘, 잔기 151에서의 아스파르트산 및 잔기 246에서의 세린을 포함한다. 따라서, 단백질은 비록 소수성 서열 및 프로단백질 세그먼트가 존재하는 것이 바람직할지라도, 세포 과정이 일어나기 전에 크릴 유래 단백질 중에 존재하는 소수성 서열 또는 프로단백질 세그먼트를 포함할 필요가 없다.
바람직하게는, 핵산은 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질, 예를 들면 서열 2, 4, 6, 8, 10 또는 12의 폴리펩티드 또는 서열 2의 아미노산 서열 64-300 또는 다른 자연적으로 발생되는 이소폼 또는 기준 서열과 약 60% 이상의 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는 약 85% 이상의 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성 또는 유사성, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하게 된다. 더욱 더 바람직하게는, 핵산은 크릴 유래 다작용성 단백질 또는 기준 서열과 약 60% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 70% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 85% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하게 된다.
추가로, 본 발명은 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질과 약 70% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 결합하는 핵산을 포함하는 단리된 핵산을 포함한다. 더욱 더 바람직하게는, 핵산은 크릴 유래 다작용성 단백질과 약 80% 이상의 동일성 또는 유사성, 및 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성 또는 유사성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 결합한다. 더욱 더 바람직하게는, 핵산은 크릴 유래 다작용성 단백질, 또는 기준 서열들 중의 하나의 폴리펩티드와 약 70% 이상의 아미노산 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 아미노산 동일성 또는 유사성, 및 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 아미노산 동일성을 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 결합된다. 크릴 유래 다작용성 단백질과 동종인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 결합하는 핵산은 예를 들면, 추가의 다작용성 단백질을 동정하기 위하여 또는 다작용성 단백질 발현을 측정하기 위하여 프로브로서 사용될 수 있다.
서열 2의 폴리펩티드의 성숙 단백질은 진뱅크 (Genbank; 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)), 데이타베이스 획득 번호 X66415가 제공한 서열에 따른 새우 페내우스 반나메이 중의 키모토립신 유사 세린 프로테이나제와 약 61% 동일하고, 진뱅크, 데이타베이스 획득 번호 U49931이 제공한 서열에 따른 꽃발게 우카 푸길레이터 중의 콜라겐분해 세린 프로테이나제와 약 60% 동일하다. 서열 2의 프로단백질의 아미노산 서열은 새우 페내우스 반나메이 중의 키모토립신 유사 세린 프로테이나제의 전구체와 약 53% 동일하고, 꽃발게 우카 푸길라터 중의 콜라겐분해 세린 프로테이나제의 전구체와 약 51% 동일하다. 바람직하게는, 다작용성 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 페내우스 반나메이 또는 우카 푸길라터 중의 상기한 프로테이나제들과 약 70% 미만이 동일하다.
다작용성 단백질을 코딩하는 핵산 외에, 본 발명은 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질과 상동성이거나 또는 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질과 동일성 %를 공유하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 추가로, 본 발명은 아시알로 GM1세라마이드 결합 활성을 제공하는 단백질 부분 또는 단백질의 효소적으로 활성 부분과 같은 다작용성 단백질의 일부분 또는 그의 변이체를 코딩하는 핵산을 포함한다.
본 발명은 또한 하기하는 활성들 중의 1가지 이상을 갖는 크릴 유래 다작용성 단백질을 코딩하는 핵산에 관한 것이다: 키모트립신, 트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및 헥소펩티다제 활성 또는 아시알로 GM1세라마이드 결합 활성. 바람직하게는, 코딩된 폴리펩티드는 세포-표면 유착 분자를 제거하거나 또는 불할성화시키는데 효과적이게 되고, 가장 바람직하게는, 코딩된 폴리펩티드는 제약학상 효과적이게 된다.
다작용성 단백질의 활성 세그먼트 또는 세그먼트들을 동정하기 위하여, 한 방법은 다작용성 단백질 cDNA를 취하고, 예를 들면 S1 뉴클레아제, Bal 31 또는 멍 빈 (Mung Bean) 뉴클레아제에 의한 5' 또는 3' 단부에서의 세그먼트들이 결핍된 결실 돌연변이를 생성시키는 것이다 (후자의 방법은 시판되는 결실 클로닝 키트와 관련하여 스트라타진(Stratagene; 미국 캘리포니아주 샌 디에고))으로부터 입수할 수 있는 문헌에 기재되어 있다). 별법으로는, 결실 돌연변이는 다작용성 단백질 cDNA의 제한 단편들을 서브클로닝시켜 구성한다. 결실 구성물은 발현 벡터 내로 클로닝되어 그들의 다작용성 활성에 대하여 시험된다.
이들 구조 유전자는 돌연변이유발 방법, 예를 들면 문헌[Adelman 등,DNA2: 183, 1983]에 기재되어 있는 방법 또는 합성 핵산 스트랜드의 사용을 통해 변화될 수 있다. 돌연변이 유전자 생성물을 용이하게 다작용성 활성에 대하여 시험할 수 있다.
핵산 서열은 예를 들면 유용한 제한 부위를 포함시키기 위하여 추가로 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Maniatis 등,Molecular Cloning, a Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press, 1989)]을 참고할 수 있다. 상기 제한 부위는 "카셋트", 또는 제한 효소 및 연결 반응을 사용하여 용이하게 치환된 핵산 서열 영역을 생성시키는데 사용될 수 있다. 카셋트를 사용하여 돌연변이된 다작용성 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 합성 서열들을 치환시킬 수 있다.
다작용성 단백질 코딩 서열은 예를 들면 본질적으로 또는 완전히 합성적일 수 있다. 예를 들면, 문헌[Goeddel 등,Proc. Natl. Acad. Sci, USA,76, 106-110, 1979]을 참조할 수 있다. 재조합 발현의 목적일 경우, 합성 다작용성 단백질 코딩 핵산을 디자인하는데 있어서 유리하게는 핵산이 발현되어야 하는 유기체에 대한 코돈 사용 선호도를 고려한다. 핵산 코드가 변질성이기 때문에, 수많은 핵산 서열들을 사용하여 동일한 아미노산 서열을 생성시킬 수 있다.
추가로, 변화된 아미노산 서열의 경우, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로부터 서열을 결실시키거나 또는 이들 서열을 돌연변이시키고 이들 결실된 또는 돌연변이된 서열들에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 기능을 확인하기 위한 수많은 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명은 또한 다작용성 단백질 활성을 보유하는 폴리펩티드를 코딩하는 다작용성 단백질 핵산의 돌연변이된 또는 결실된 형태에 관한 것이다.
자연적으로 발생되는 이소폼의 보존적 돌연변이가 유전자조작된 변이체의 경우에 바람직하다. 상기 보존적 돌연변이는 하기하는 군들 중의 하나 내에서 한 아미노산을 다른 것으로 교환시키는 돌연변이를 포함한다:
1. 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성 잔기: Als, Ser, Thr, Pro 및 Gly;
2. 극성, 음으로 하전된 잔기 및 그들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln;
3. 극성, 양으로 하전된 잔기: His, Arg 및 Lys;
4. 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및
5. 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp
보존적 치환의 바람직한 리스트는 다음과 같다.
선택된 치환의 타입은 슐쯔(Schulz) 등 (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978. pp. 14-16)이 개발한 상이한 종들의 동종 단백질들 사이에서의 아미노산 치환 빈도수 분석에, 초우 및 패스맨 (Chou and Fasman,Biochemistry13.211, 1974)이 개발한 구조 형성 포텐셜의 분석에, 또는 슐쯔 등 (Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978. pp. 109-130)이 재검토한 다른 상기 방법, 및 카이트 및 두리틀(Kyte and Doolittle,J.Mol.Biol. 157: 105-132, 1982)이 개발한 단백질 중의 소수성 패턴 분석에 기초할 수 있다.
2. 폴리펩티드
본 발명의 면에서 사용된 폴리펩티드는 다작용성 단백질 발현 유기체로부터 정제된 폴리펩티드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는, 다작용성 활성을 갖는천연 또는 합성의 모든 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질 또는 그들의 유전자조작된 변이체의 실질적으로 순수한 이소폼을 포함하는 폴리펩티드, 보다 바람직하게는, 서열 2, 서열 4, 서열 6, 서열 8, 서열 10 또는 서열 12를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 추가로, 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 32-38의 아미노산 서열들 중의 1개 이상을 포함한다.
기준 단백질 또는 다작용성 단백질, 및 그들의 이소폼 및 그들의 일부분 외에, 본 발명은 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질과 동종이거나 또는 기준 단백질 또는 크릴 유래 다작용성 단백질과 일정 동일성 %를 공유하는 폴리펩티드의 용도를 포함한다. 추가로, 본 발명은 기준 단백질 또는 다작용성 단백질 또는 그의 변이체의 일부분, 예를 들면 아시알로 GM1세라마이드 결합 활성을 제공하는 단백질 부분 또는 단백질의 효소 활성 부분을 포함한다.
추가로, 본 발명은 다작용성 활성을 보유하는 다작용성 단백질의 유전자조작된 변이체를 포함한다. 특정 실시태양에서, 이들 유전자조작된 변이체는 예를 들면, 서열 4의 N-말단 단부에서 약 63개 이하의 아미노산 잔기가 부족하다.
바람직하게는, 변이체는 크릴 유래 다작용성 단백질, 예를 들면 기준 서열의 폴리펩티드, 또는 다른 이소폼, 또는 서열 2의 아미노산 서열 64-300과 약 60% 이상의 동일성 또는 유사성, 보다 바람직하게는 약 70% 이상의 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는약 85% 이상의 동일성 또는 유사성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성 또는 유사성, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성 또는 유사성을 가질 수 있다. 더욱 더 바람직하게는, 유사체는 기준 서열의 폴리펩티드와 약 70% 이상의 동일성, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 약 85% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성, 및 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 동일성을 공유하게 된다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 서열 2 또는 다른 기준 서열의 성숙 단백질의 약 237개 이상의 아미노산들의 연속 스트레치의 서열을 갖는다.
상기한 폴리펩티드들의 아미노산 유사체들도 또한 본 발명에 포함된다.
바람직하게는, 효소는 간단히 적합한 생물학적 원, 예를 들면 크릴로부터 단리된다. 그러나, 다른 기술, 예를 들면 재조합 기술이 사용될 수 있다.
추가로, 본 발명은 상기한 바와 같은 가수분해 효소를 각각 치료 유효량의 중합체 마이크로겔, 효소 및 마이크로겔과의 혼합물로 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 혼합물 중에서, 효소 또는 마이크로겔의 유효량은 다른 약제 (효소 또는 마이크로겔)의 존재와는 무관하게 효과적인 양일 수 있거나 또는 전체 혼합물이 유효량으로 존재하는 경우 한 약제가 다른 약제의 효능을 향상시키는 양일 수 있다.
3. 바람직한 정제 방법
본 발명은 또한 다작용성 단백질이 유래되는 해수 갑각강으로부터의 상피에 대한 외상을 치료하기 위한 상기 방법에 사용되는, 다작용성 단백질의 신규한 단리 방법을 제공한다. 비록 본 명세서의 다른 곳에서 기재된 바와 같이 다른 수생 (바람직하게는 갑간강) 원천들이 동정되어 있지만, 바람직하게는 다작용성 하이드롤라제의 원천은 크릴이다. 하이드롤라제의 단리 방법은 바람직하게는 약 10분 내지 약 3시간, 보다 바람직하게는 약 30분 내지 약 2시간, 더욱 더 바람직하게는 약 45분 내지 약 90분 동안, 상수를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는, 해수보다 실질적으로 낮은 삼투성을 갖는 물인 담수 중에서의 추출과 같이 동물로부터 단백질을 추출하는 것을 포함한다. 이어서 조 추출물을 바람직하게는 침강, 원심분리, 여과 등 중의 1가지 이상을 통해서와 같이 표준 수단을 통해 불용성 물질로부터 분리시킬 수 있다. 이어서 청징화된 조 추출물을 바람직하게는 임의의 잔류 입상 물질, 예를 들면 바이러스 입자 및 원천 동물로부터 동시추출되었을 수 있었던 세포 파편을 제거하기 위한 방법을, 예를 들면 미세여과 방법을 통해 행한다. 추가로 청징화된 조 추출물을 이어서 바람직하게는 표준 단백질 정제 과정의 다양한 방법, 예를 들면 시차 여과, 시차 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 분자 체질 등을 행한다. 본 발명의 면에 사용된 다작용성 하이드롤라제를 단리하기 위한 바람직한 방법은 다작용성 단백질에 결합하기 적합한 리간드를 포함하는 친화도 컬럼을 사용하는 것을 포함한다. 특히, 리간드는 바람직하게는 보로네이트 유도체, 보다 바람직하게는 페닐보로네이트 종, 더욱 더 바람직하게는 아미노페닐보로네이트 종이고, 이들은 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있다. 예를 들면, 다작용성 하이드롤라제를 단리하기 위한 본 발명의 방법에 사용된 리간드는, 다른 성분들이 예를 들면 본 명세서에서 기재한 바와 같이 크릴로부터 유래된 다작용성 하이드롤라제의 특이적 결합을 실질적으로 방해하지 않는 한, 각 경우에 일킬(C1-C8), 아릴 (C5-C7), 클로로, 플루오로, 알콕시 (C1-C8) 및 다른 성분들을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는 다른 성분들이 부착되어 있을 수 있다. 특이적 결합을 실질적으로 방해하지 않는다는 것은, 상기한 첨가된 종이, 이에 의해 상기 결합이 약 20% 초과, 보다 바람직하게는 약 10% 초과 만큼 감소되지 않는 정도로 상기 특이적 결합을 실질적으로 방해하지 않는다는 것을 의도한다.
추가로, 본 발명은 크릴 유래 다작용성 단백질의 실질적으로 순수한 이소폼 또는 이들의 유전자조작된 변이체를 포함하는 폴리펩티드 유효량 및 제약학상 허용되는 담체, 특히 마이크로겔인 담체를 포함하는 동물 치료용 제약 조성물을 제공한다. 보다 바람직하게는, 폴리펩티드는 기준 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 바람직하게는 서열 32-38의 아미노산 서열들 중의 1개 이상을 포함한다.
4. 폴리펩티드 합성 방법
한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 유전자 융합을 사용하여 하기하는 바와 같이 제조된다. 예를 들면, 말토스 결합 단백질 ("MBP")과의 융합을 사용하여 이. 콜리 (E. coli)와 같은 원핵세포 중에서 다작용성 단백질의 발현 및 정제를 용이하게 할 수 있다. 하이브리드 단백질은 예를 들면 결합 단백질의 기질을 사용하는 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 예를들면,Gene67: 21-30 (1998)를 참조할 수 있다. 말토스 결합 단백질을 포함하는 융합 폴리펩티드를 사용할 때, 가교결합된 아밀로스 친화도 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단백질을 정제할 수 있다.
주어진 다작용성 단백질 또는 그의 유사체에 특이적인 cDNA를 또한 표준 수단을 사용하여 예를 들면 시판되는 벡터 상에서 발견되는 글루타티온 s-트랜스퍼라제 ("GST")에 대한 cDNA에 연결될 수 있다. 상기 벡터에 의해 발현된 융합 폴리펩티드는 다작용성 단백질 또는 유사체 및 GST를 포함하며, 정제를 위해 처리될 수 있다.
융합 폴리펩티드의 MBP 또는 GST 부분이 기능을 방해하지 않는 경우, 이것은구조화되지 않은 영역, 예를 들면 MBP 또는 GST 및 다작용성 단백질 사이의 링커에 우선적으로 공격하는 부분적인 단백질분해 소화에 의해 제거된다. 링커는 예를 들면 초우 및 패스맨 (Chou and Fasman,Biochemistry13.211, 1974)이 개발한 2차 구조 형성 포텐셜에 대한 규칙을 사용하여 구조를 결핍시키도록 디자인될 수 있다. 링커는 또한 표적 아미노산 예를 들면 트립신, 아르기닌 및 라이신 잔기를 포함하도록 다지안된다. 예를 들면, 링커는 소 엔터 오키나제의 표적 서열 (인비트로겐 (Invitrogen; 미국 캘리포니아주 칼스바드))으로부터 이용할 수 있는 재조합 소단위]인 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (서열 41)을 포함할 수 있다. 링커를 생성시키기 위하여, 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 표준 합성 방법은 표준 서브클로닝 방법과 함께 사용된다. GST 또는 MBP 이외의 다른 융합 파트너가 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 융합 폴리펩티드는 인비트로겐으로부터 입수할 수 있는 벡터, 예를 들면 융합 폴리펩티드와 같은 티오레독신을 포함하는 TRX-Fus 벡터에서 발견되는 바와 같을 수 있다.
추가로, 다작용성 단백질은 융합 파트너를 사용하지 않고서도 핵산으로부터(세포 기계에 의해) 직접적으로 합성될 수 있다. 예를 들면, 서열 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 서열을 갖는 적절한 발현 벡터 내로 서브클로닝되어 적절한 유기체 중에서 발현된다. 크릴 유래 다작용성 단백질에 대한 항체를 사용하여 정제를 용이하게 할 수 있다.
필요에 따라 추가의 정제 기술, 예비 전기영동, FPLC (파마시아(Pharmacia; 스웨덴 업살라)), HPLC (예를 들면 겔 여과, 역상 또는 온화하게 소수성 컬럼을 사용), 겔 여과, 시차 침전 (예를 들면, "석출 침전"), 이온 교환 크로마토그래피, 및 친화도 크로마토그래피 (친화도 리간드로서 RE1 듀플렉스 뉴틀레오티드 서열을 사용하는 친화도 크로마토그래피를 포함)이 적용된다.
폴리펩티드 또는 핵산은, 관심을 갖는 핵산의 분자 클로닝이 예를 들면 세포로부터 다작용성 단백질 핵산을 취하고 이것을 다른 핵산으로부터 단리시킨다는 점에서 본 발명의 방법에 따라 "단리된다". 이 단리된 핵산을 이어서 예를 들면 효모 또는 세균일 수 있는 숙주 세포 내로 삽입시킬 수 있다. 폴리펩티드 또는 핵산은 이것이 주로 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 각각 없는 경우 본 발명에 따라 "실질적으로 순수한" 것이다. 거대분자, 예를 들면 핵산 또는 폴리펩티드는 이것이 조성물 중의 주어진 거대분자의 약 50 중량% 이상을 구성하는 경우, 우세하게 다른 폴리펩티드 또는 핵산이 없다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 또는 각각 핵산은 주어진 그의 조성물 중에 존재하는 전체 폴리펩티드 또는 핵산의 약 60 중량% 이상, 보다 바람직하게는 역 80%, 더 바람직하게는 약 90%, 더욱 더 바람직하게는 약 95% 및 가장 바람직하게는 약 100%를 구성한다. 상기 조성물은 본 명세서에서실질적으로 순수한, 60% 순수한, 80% 순수한, 90% 순수한, 95% 순수한, 또는 100% 순수한 폴리펩티드 또는 핵산인 것으로 말해진다.
5. 다작용성 단백질의 바람직한 특성
유파우시아 (Euphausia) 속 [예를 들면, 수페르바 (superba,), 크리스탈로피아스 (crystallorphias), 프리기도 (frigida),트리아칸타 (triacantha), 벨란티니 (vellantini), 로우기로스트리스 (lougirostris), 루센스 (lucens), 시밀리스 (similis), 스피니페라 (spinifera), 레쿠르바 (recurva등)], 메가닉티파네스 (Meganyctiphanes) 속 [예를 들면 노르베기카 (norvegica) 등] 및 타이사노에싸 (Tysanoessa) 속 [예를 들면 마쿠루라 (macurura), 비시나 (vicina), 그레가리아 (gregaria) 등]의 크릴을 비제한적으로 포함하는 크릴이 크릴 유래 다작용성 단백질의 바람직한 원천이다.
바람직하게는, 단백질은 소듐 도데실 술페이트 ("SDS") 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 ("PAGE")으로 측정하였을 때, 약 20 kd 내지 약 40 kd, 보다 바람직하게는 약 26 kd 내지 약 32 kd, 가장 바람직하게는 약 29 kd의 분자량을 갖는다. 추가로, 단백질은 바람직하게는 크릴 유래 다작용성 단백질과 실질적인 상동성을 갖는다. 바람직하게는 단백질은 세포 표면 수용체, 예를 들면 폴리펩티드 또는 당지질과 선택적으로 반응성이다.
프로테아제 활성은 예를 들면 30℃에서 카제인 (농도 1% w/v)과 함께 단백질 제제를 인큐베이팅시키고, 아미노산 또는 펩티드의 방출 (색도계로 측정할 수 있을 정도의 아미노기의 증가에 의해 측정될 수 있음)을 측정함으로써 결정될 수 있다.카제인 유닛은 문헌(Biochem. J., 173: 291-298, 1978)에 정의되어 있다 (기질로서 아조카제인을 사용함).
별법으로는, 트립틱 프로테아제 활성은 티로신-아르기닌-메틸-에스테르 ("TAME")에 대하여 측정될 수 있다. 또는, 트립틱 활성은 기질로서 벤조일-Val-Gly-Arg-p-No2-아닐리드를 사용하여, 예를 들면 문헌(Biochemical J., 185: 423-433, 1980)의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 키모트립틱 활성은 기질로서 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NO2-아닐리드 및 문헌(J.Biol. Chem., 269: 19565-19572, 1994)의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 엘라스타제 활성은 기질로서 Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-p-NO2-아닐리드 및 문헌(J.Biol. Chem., 269: 19565-19572, 1994)의 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
HL60 세포를 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제로 예비처리하였을 때, 이들의 TNF 자극된 내피 세포와의 결합은 약 60% 넘게 억제된다. 바람직하게는, 본 발명의 다작용성 단백질을 이용한 HL60 또는 내피 세포의 처리는 TNF 자극된 내피 세포에 대한 HL 60 세포 결합을 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 40% 이상, 더 바람직하게는 약 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 80% 이상 억제시키게 된다. 별법으로는, 다작용성 단백질은 바람직하게는 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제의 유착 억제 활성의 약 30% 이상을 갖는다. 보다 바람직하게는, 다작용성 단백질은 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제의 유착 억제 활성의 약 60% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상 및 더욱 더 바람직하게는 약 100% 이상을 갖는다.
본 발명의 다작용성 단백질은 세포 생육성에 영향을 주지 않고서, 세포 표면 유착 분자, 예를 들면 ICAM-1(즉, CD54), ICAM-2, VCAM-1, CD4, CD8, CD28, CD31,CD44 및 아시알로 GM1세라마이드를 효과적으로 제거하거나 또는 불활성화시킨다. 이 유착 부위 제거 또는 불활성화 현상은 다작용성 단백질이 이에 대하여 치료제 또는 예비치료제로서 효과적인 현상의 비록 전부는 아니지만 다수에 대한 단백질 효능에 대한 적어도 부분적인 근거를 제공하는 것으로 생각된다. 다른 세포 표면 수용체, 예를 들면 T-세포 수용체, I군 주 조직적합성 복합체 또는 인테그린 (Integrin) CD11 및 CD18은 다작용성 단백질에 의한 제거 또는 불활성화 대하여 실질적으로 내성인 것으로 밝혀졌다.
창상을 치료하기 위하여 다가음이온성 중합체와 함께 사용된 하이드롤라제는 바람직하게는 특정 세포 표면 유착 분자들 중의 1종 이상, 예를 들면 ICAM-1(즉, CD54), ICAM-2, VCAM-1, CD4, CD8, CD28, CD31,CD44 및 아시알로 GM1세라마이드를 세포 생육성에 영향을 주지 않고서 소화시키는 프로테아제이다. 바람직하게는, 프로테아제는 이들 세포 표면 유착 분자의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 모두를 소화시킨다. 특히, 프로테아제는 바람직하게는 상기한 프로테아제, 특히 다작용성 프로테아제이다.
실시예 1: PHIM 폴리펩티드의 클로닝
PHIM 폴리펩티드를 정제하고 폴리펩티드를 발명의 명칭이 "MultifunctionalEnzyme"이고 발명자가 드페이어 등인 미국 특허 출원 제08/600,273호 (1996년 2월 8일 출원)에 기재된 바와 같이 부분적으로 서열화하였다. 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 부분 아미노산 서열에 기초하여 구성하였다. 프라이머는 하기하는 서열을 가졌다: CACGCCTACCCITGGCA (서열 42) 및 GTGTTGGACTCGATCCAGATC (서열 43). 프라이머를 사용하여 람다 zap cDNA 합성 키트 (스트라타진 (미국 캘리포니아주 샌 디에고))를 사용하여 람다 zap 중에 구성된 크릴 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다. 3개의 양성 클론을 프로브로서 PCR 단편을 이용한 스크리닝을 통해 동정하였다. 프로브로서 사용된 PCR 단편은 하기하는 변화를 갖는 서열 1의 217 내지 881 서열이었다: 219에서, T에서 C; 222에서, T에서 C; 228에서, C에서 G; 270에서, T에서 A; 330에서, G에서 A; 417에서, C에서 A; 534에서, T에서 C; 741에서, C에서 T; 및 825에서, C에서 G. 3개의 양성 클론을 서열화하였더니, 제1 클론은 서열 1을 제2 클론은 서열 2를 및 제3 클론은 서열 7을 생성시켰다. 3개의 이소폼은 모두 개시 코돈 메티오닌이 없다.
실시예 2: 재조합 다작용성 단백질 효소의 발현
재조합 다작용성 단백질을 노바겐(Novagen; 영국 옥스포드 아빙돈)이 제공하는 pET23c 벡터의 BamHI 및 Xho I 부위를 사용하여, 하기하는 바와 같이 이. 콜리 중에서 발현시켰다. pET23c 벡터는 발현된 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 유전자 10개의 꼬리를 포함한다. 추가로, pET 벡터는 재조합 다작용성 단백질을 박테리오파아지 T7 전사 및 번역 시그널의 조절 하에 위치시킨다. 일단 비발현 숙주인 이. 콜리 MC1061 중에 형성되면, 이어서 플라스미드를 lacUV5 조절 하에서 T7 폴리머라제 유전자의 염색체 복제물을 갖는 발현 숙주 이. 콜리 BL21 (DE3) pLYS S로 전달시켰다. 파장 600에서 0.5의 광밀도로 1 mM IPTG를 첨가하여 발현을 유발시켰다. 1.0의 광밀도에서 2시간 후에 세포를 수확하였다. 재조합 단백질은 용해물 중에 불용성이었고, 수확 후에, 세척하여 6 M 요소 중에 용해시켰다. 재조합 단백질의 리폴딩을 100 mM 트리스 HCL pH 9.5, 100 mM CaCl2, 0.3 mM 산하된 글루타티온 및 3 mM 감소된 글루타티온을 함유하는 완충제를 사용하여 200배 희석시킨 후에 4℃에서 밤새 교반시켜 수행하였다.
실시예 3
아미노산 56 내지 300 및 중지 코돈 (서열 1 및 4)을 코딩하는 p62 클론으로부터의 단편을 잘라내어 pET-23c 발현 벡터 내에 삽입시켰다. 이 클론은 가벼운 사슬에 대한 디술파이드 연결을 형성하는데 필요한 시스테인을 배제시킨다는 것에 주목한다. 코딩된 단백질은 이. 콜리 균주 BL21(DE3)pLYs S 중에 발현되었고, 이것은 불용성 물질을 생성시켰다. 불용성 물질을 6 M 요소 중에 용해시키고, 0.1 mM CaCl 및 산화된/환원된 글루타티온을 함유하는 pH 9.5로 완충된 수용액 내로의 200배 희석으로 리폴딩하였다. 생성된 용액을 농축시켜 재조합 단백질을 회수하였다.
재조합 단백질은 모델 기질인 숙시닐-ala-ala-pro-phe-p-아닐리드를 절단시키는 것으로 나타났으며, 이에 의해 그의 단백질 분해 활성을 입증하였다. 단백질분해 활성은 프로테아제 억제제 Eglin에 의해 억제되었다.
실시예 4
본 발명의 면에서 사용된 크릴로부터 유래된 다작용성 하이드롤라제는 남극 크릴 종인 유파우시아 수페르바(Euphausia superba)로부터 얻는다. 바람직한 추출, 정제 및 벌크 활성 제제로의 제형화 방법은 아래에서 개략적으로 설명되는 4단계 방법에 의해 달성된다. PHM-101의 활성은 실시예 7에 기재한 방법에 따라 모니터한다. 하기 방법으로부터 얻은 다작용성 하이드롤라제 생성물을 PHM-101로 표시하였고, I-V-G-G-N/M-E-V-T-P-H-A-Y-P-W-Q-V-G-L-F-I-D-D-M-Y-F (서열 52)의 N-말단 서열을 나타낸다.
크릴 잡이 및 공급.본 발명에 사용된 크릴은 설립된 일본 어업 회사인 니스이 (Nissui)가 공급하였다. 상하는 것 (소화 효소에 의한 자기분해)을 막기 위하여, 선상에서 크릴을 해수로 세척하고, 약 12.5 ㎏을 포함하는 플라스틱 백에 포장하여, 잡은 날짜를 나타내는 라벨을 붙인 상자 (1 상자 당 2개의 백) 내에 넣고, -40℃의 온도에서 속성 냉동시켜서 추출하기 위해 해동할 때까지 이렇게 저장하였다. 바람직한 면에 따르면, 12월 및 1월이 소화 효소 활성이 최대이고 지질 함량이 가장 적어 추출을 가장 효율적으로 할 수 있게 만드는 시기인 것으로 나타났기 때문에, 단지 12월 및 1월에 잡은 크릴만을 사용하였다.
PHM-101 추출, 정제 및 제형화.제조 방법은 표준 단백질 분리 및 정제 기술 및 장치를 사용하였다.
동결된 크릴의 4개의 25 ㎏ 상자를 대량 동결기 저장소로부터 체스트 동결기로 이동시켰다. 크릴이 양호한 상태인 것을 확인 한 후에, 이들을 그들의 외부 상자로부터 꺼내어 트레이 중에 넣고 4℃의 냉실에서 밤새 서서히 녹게 하였다. 다음날 아침, 이제 부분적으로 녹은 크릴을 그들의 플라스틱 백으로부터 제거하여, 작은 덩어리로 분리시키고, 추출 탱크 중의 상수 400 리터에 첨가하였다. 여기서 재료를 모든 얼음 및 덩어리가 없어질 때까지 적어도 1시간 동안 부드럽게 교반하였다. 방법의 여러 단계에서 분석하기 위한 샘플을 취하여 무기한 또는 적어도 공정의 만족스러운 완료시까지 저장하였다.
이어서 조 추출물을 조대한 회전 드럼 체를 통해 통과시킴으로써 고상 폐기물로부터 분리시켰다. 이 미세한 추출물을 이어서 키큰 단열 침강 탱크로 펌핑ㅅ키고, 여기서 밤새 정치시켜 보다 무거운 성분들이 바닥으로 가라앉게 하였다.
다음날 아침 상징액을 단열 보유 탱크 내로 흘려보내고, 여기서부터 미세여과 리그 (rig)로 펌핑시키고 침강물은 버렸다.
사용된 미세여과 리그는 밀리포어(Millipore) 제품의 장치의 표준 부품이고, 제약학적 가공처리를 위해 특이적으로 디자인되었다. 본질적으로 이 리그는 상징액을 2 미크론 필터 배열을 통해 펌핑시켜 입상 부스러기를 제거하고, 따라서 제1 크로마토그래피 컬럼에 가하기 위한 투명한 용액을 제공한다. 미세여과된 추출물을 깨끗한 방 영역으로 펌핑시키고, 여기서 단열 보유 탱크 중에서 밤새 저장시켰다.
본 방법의 제1 정제 단계는 파마시아 (스웨덴 업살라)로부터 구입한 표준 DEAE-세파로스 10 리터를 함유하는 축방향으로 흐르는 컬럼을 사용하는, 표준 음이온 교환 크로마토그래피 단계이었다. 컬럼을 시간 당 약 120 리터의 유속 및 20 mM 트리스-HCl 완충제, pH 7.5 (완충제 A)의 5배 이상의 컬럼 부피를 사용하여 평형화시켰다. 미세여과된 추출물을 적절한 부피, 농도 및 염 함량으로 하는데 필요한 각종 표준 준비 단계 후에, 미세여과된 추출물을 전체적으로 음의 전하를 갖는 분자와 선택적으로 결합하도록 디자인된 평형화된 DEAE-세파로스 컬럼 상으로 완충제 A를 사용하여 펌핑시켰다. 10 +/- 3 컬럼 부피의 10 mM 트리스-HCl, 0.30 M NaCl 완충제, pH 7.5 (완충제 B)를 시간 당 120 리터 흘려보낸 후에, 원하지 않는 분자들이 통과되어 나오면 버렸다. 컬럼을 약 4 컬럼 부피의 10 mM 트리스-HCl, 0.50 NaCl 완충제, pH 7.5 (완충제 C)로 시간 당 50 리터의 속도로 컬럼을 세척하여, PHM-101을 선택적으로 치환시켜 컬럼으로부터 3개의 분획물로 수거하였다. 이것을 DEAE-용출물이라 한다. 다른 원하지 않는 분자들이 뒤에 남았다. 이들 원하지 않는 분자들은, 또한 5 컬럼 부피의 10 mM 트리스-HCl, 1.00 M NaCl 완충제, pH 7.5 (완충제 D)에 이어 2 컬럼 부피의 1 M NaOH를 시간 당 약 120 리터의 유속으로 흘려보내 컬럼이 약 1 내지 약 24시간 동안 임의의 흐름 없이 정치하도록 한 다음 10 컬럼 부피의 증류수로 세척하고, 마지막으로 컬럼을 상기한 바와 같은 완충제 A로 평형화시켜 컬럼을 재사용을 위해 준비하도록 만듦으로써, 컬럼으로부터 세척하여 버렸다. 대표적으로는, 상기 컬럼은 세파로스를 대체하기 전에 10회 재사용가능하다.
정제 과정에서의 제2 단계는 친화도 컬럼 크로마토그래피 단계로서, 이것은 각종 효소의 특정 화학기에 대한 기질-결합 선호도를 이용한다. 사용된 컬럼은 구조 아미노페닐보로네이트를 갖는 리간드가 부착된 세파로스 500 ㎖로 충전된 표준 축방향 크로마토그래피 컬럼으로 이루어진다. 별법으로는, 예를 들면 상업적으로 입수할 수 있는 아가로스 6XL과 같은 아가로스 크로마토그래피 재료가 사용될 수 있다. 분 당 약 250 ㎖의 유속을 사용하여, 컬럼을 10 +/- 5 컬럼 부피의 완충제 C로 평형화시켰다. 그 후에, DEAE-용출물을 PHM-101과 같은 세린-프로테아제 효소와 특이적으로 결합하는 친화도 컬럼 상에 분 당 약 200 ㎖의 유속을 사용하여 펌핑시키고, 이렇게 부하된 컬럼을 계속해서 10 +/- 5 컬럼 부피의 완충제 C로 세척하였다. 컬럼을 (1) 분 당 약 200 ㎖의 속도의 10 +/- 5 컬럼 부피의 50 mM 트리스-HCl, 5 mM CaCl2완충제, pH 7.5 (완충제 E) 및 (2) 분 당 약 100 ㎖의 속도의 1+/- 0.8 컬럼 부피의 10 mM 글리신-시트레이트, 1.0 mM CaCl2완충제, pH 7.4 (완충제 F)를 이용한 컬럼으로 추가 세척에 의해 제거된 것을 포함하여 컬럼과 결합하지 않는 오염물을 폐기물로 버렸다. 이어서 컬럼을 분 당 약 100 ㎖의 속도의 약 4 컬럼 부피의 10 mM 글리신-시트레이트, 1.0 mM CaCl2, 200 mM 소르비톨 완충제, pH 7.4 (완충제 G)로 세척하여 PHM-101 함유 용액을 치환시켜 수집하였다. 다른 원하지 않는 분자들은 뒤에 남았다. 이들 원하지 않는 분자들은 이어서 하기한 일련의 세척을 사용하여 컬럼으로부터 세척하였다: 세척 1, 5 컬럼 부피의 30% v/v 2-프로판올, 0.2 M NaOH에 이어 5 컬럼 부피의 정제수, 분 당 250 ㎖; 세척 2, 5 컬럼 부피의 0.1 M HCl에 이어 5 컬럼 부피의 정제수, 분 당 250 ㎖; 세척 3, 5 컬럼 부피의 50 mM NaOH에 이어 5 컬럼 부피의 정제수, 분 당 250 ㎖; 및 세척 4, 5 컬럼 부피의 25% 에탄올/75% 0.1 M NaCl, 분 당 250 ㎖. 대표적으로는, 상기 컬럼은 세파로스를 대체하기 전에 10회 재사용가능하다.
PHM-101 용액의 생체부담(bioburden)을 최소화시키기 위하여, 무균 취급 기술을 사용하여 멸균 캐비넷 중에서 2회 여과시켰다. 첫번째는 바이러스를 제거하도록 디자인된 단계로서 상업적으로 입수가능한 바이러스 필터, 즉 상기 목적으로 디자인된 플라노바(Planova) 15 바이러스 필터를 사용한다. 두번째는 여과된 PHM-101 용액을 이를 통해 통과시키기 위하여 진공 펌프를 사용하는, 상업적으로 입수할 수 있는 2 미크론 필터를 사용한다. 각 여과 전 및 후에, 각 필터 유닛의 일체성을 시험하여, 2개의 시험을 모두 통과한 경우에만 물질을 방출시켰다. 여과된용액을 멸균 용기에 무균적으로 충전시키고, 멸균 캐비넷으로부터 제거하기 전에 라벨링하고, 여과된 PHM-101 용액의 저장을 위해 따로 치워둔 체스트 동결기 중에 저장하였다.
동결된 여과된 PHM-101 용액을 이어서 해동시켜 각 바이알이 PHM-101 활성 50 유닛을 함유하도록 바이알 내로 분취시켰다. 이들 유닛은 상기에서 정의한 바와 같다. 본 명세서의 다른 부분에서 설명한 바와 같이 효소를 보호하기 위하여 첨가될 수 있는 각종 부형제들이 첨가된 분취된 PHM-101 제제를 이어서 표준 방법에 따라 동결시키고 동결 건조시켰다.
동결건조된 PHM-101의 제조 동안에 행한 분석은 신속한 공정내 분석이었고, 하기하는 바와 같이, 각 단계 동안에 공정의 효능을 조절하고 모니터하는데 사용되었다:
활성 (PHM-101의)을 공정 전반에 걸쳐 분석하여 제조되는 물질의 양 및 작용성을 확인하였다. 활성은 표준 분석을 사용하여, 키모트립신 유사 효소의 공지된 기질인 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe의p-니트로아닐리드 에스테르와의 반응 속도를 모니터함으로써 측정하였다.
단백질 함량은 브래드포드(Bradford) 방법과 같은 공지된 표준 방법으로 공정 중의 각 단계에서 측정하였다. 효소가 단백질이기 때문에, 이것은 제조되는 물질의 양 및 질을 모니터하는 다른 수단이다. 활성 값을 이 값으로 나누면 특이적 활성으로 불리는 순도 및 작용성의 유용한 척도를 생성시킨다.
PHM-101 제제의 단백질 오염물 또는 펩티드 분해 생성물을 표준 SDS-폴리 아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 시험하였다.
모노-Q FPLC (파마시아)는 혼합물의 성분들을 그들의 상대 전하에 의해 분리시키는 상업적으로 입수할 수 있는 분석 크로마토그래피 컬럼이다. 분취액을 컬럼을 통해 분석하고, 용출된 단백질을 단백질의 자외선 흡수 특성을 통해 검출하였다. 순수한 분자는 1개의 날카로운 대칭적 피크는 나타냈다. 다른 피크들은 오염물의 존재 (불순물 또는 분해 생성물)를 의미한다.
실시예 5
각막 창상의 치료 방법에 관한 본 발명의 한 실시태양을, 뉴질랜드산 토끼인 알비노 (2-3 ㎏)를 사용하여 마취시킨 토끼의 각막을 실험적으로 알칼리 화상 창상을 야기시킨 후 하기되는 본 명세서에서 기재한 바와 같이 대조용 및 본 발명의 치료를 하여 시험하였다.
40마리의 뉴질랜드산 토끼인 알비노 (2-3 ㎏)를 표준 방법을 사용하여 정맥내 페놀바르비탈로 마취시켰다. 7 ㎜의 여과지 디스크를 제1 경우에는 4N 수산화나트륨 용액으로 습윤시켜, 각막의 주변부, 결막 또는 눈꺼풀에는 가지 않도록 주위하면서 1분 동안 각막의 중심부에 가하였다. 이어서 화상을 입은 각막을 0.9% 염화나트륨으로 자극하였다. 끝이 면으로 된 어플리케이터로 상피를 제거하고, 시프로플록사신 점적액 [오큐플렉스(Ocuflex)]을 방울방울 떨어뜨렸다.
동물들을 무작위로 2개의 군을 나누어 각 동물을 28일 동안 프로테아제 PHM-101 (실시예 4에 따라 제조됨) 또는 프로테아제가 없는 마이크로겔로 국소적으로 치료하였다. 가면을 쓴 관찰자가 임상학적 파라미터들을 상세히 기록하기 위하여매일 세극등 생체현미경검사법을 수행하였다.
프로테아제 PHM-101은, 1개의 바이알을 멸균수 2 ㎖로 재구성하여 그 용액을 하기 실시예 6의 방법에 따라 카르보폴 (등록상표) 974P로 제조한 마이크로겔 10 ㎖에 첨가하여 제조하였다. 항생제 10분 뒤에 재구성한 겔 50 mcL을 1일 4회 투여하였다. 상기한 바와 같이, 한 군의 동물 (겔만 투여하는 군)은 효소를 함유하지 않는 마이크로겔로 치료하였다. 치료는 상처를 낸 다음날에 시작하여 28일 동안 계속하고, 완전히 치료되지 않은 경우에는 1 주일의 치료후 관찰 기간을 두었다. 모든 40 마리의 투끼에 대한 수술후 치료는 각막에 대한 2차 세균 감염을 예방하기 위하여 각막이 재상피형성될 때까지 매일 4회의 국소 항생제 (시프로플록사신) 사용을 포함하였다.
잔류 상피 결함 크기, 기질 궤양형성 정도 및, 치료 종반에는 기질 불투명화 정도를 포함하는 특정 임상학적 파라미터들을 상세하게 기록하기 위하여 매일 세극등 생체현미경검사법으로 토끼를 관찰하였다. 남아있는 상피 결함의 크기는 생체현미경의 한쪽 눈 중의 그리드를 사용하여 평가하였다. 궤양형성 및 기질 불투명화 (흉터자국) 신혈관신생 정도는 0 내지 4+ (보통 내지 심함)의 주관적인 척도로 평가하였다. 관찰자가 특정 토끼가 프로테아제 또는 겔만 투여하는 군인지를 알 수 없도록 관찰하였다.
28일에, 치료된 상피 결함을 갖는 동물을 모두 죽여서 그들의 각막을 조직병리학적 연구를 위해 수거하였다. 나머지 동물들은 치료없이 1주일 동안 관찰한 다음 35일에 죽여서 조직병리학적 관찰을 위하여 각막을 수거하였다.
28일까지, 효소 치료된 눈의 7/20이 각막 궤양을 가진 한편, 슬라시보 치료된눈의 6/18이 각막 궤양을 가졌다. 35일까지 (치료 종료 후 어느 날), 나머지 효소 치료된 눈의 2/20이 궤양화되었고, 플라시보 치료된 각막의 6/18이 궤양화되었다. 본 연구는 치료를 하지 않은 군과 식염수만으로 치료한 군을 포함하지 않았다. 그러나, 이러한 동물 모델에 대한 공개된 많은 문헌은 1N 알칼리 화상 (본 실시예에서 사용한 4N 알칼리 화상보다 훨씬 덜한 화상)을 사용한 동일한 모델 중에서, 눈의 약 75%가 궤양을 나타냈다고 말하고 있다.
본 실시예는 각막 파괴가 감소되거나 또는 없어진, 알칼리 화상 유발 각막 궤양형성의 다작용성 프로테아제 요법의 이점을 입증하는 결과를 제공한다. 본 실시예는 또한, 비록 마이크로겔을 다작용성 프로테아제와의 혼합물로 투여하였을 때만큼 두드러지게는 아니지만 각막 파괴의 감소를 야기시킨 마이크로겔만을 단독으로 사용한 것의 이점도 입증한다.
실시예 6
본 실시예는 본 발명에 사용된 하이드로겔 및 마이크로겔의 제조 방법을 기재한다. 마이크로겔은 그 자체로 사용하거나 또는 역시 본 명세서에서 기재한 다른 약제, 예를 들면 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제와의 혼합물로 사용된다.
이를 위해 사용된 화학약품 및 재료는 글리세롤 (머크(Merck; 독일 다름스타트) 제품), 카르보폴 (등록상표) 다가음이온성 중합체 (비에프굿리치 캄파니, 스페셜티 포리머즈 앤드 켐칼즈(미국 오하이오주 브렉스빌) 제품), 디이소프로판올아민 (알드리히(Aldrich)), 증류수 및 10% 수산화나트륨이었다. 성분 화학약품의 최종농도는 글리세롤 모액 23.5% w/v (87% w/w), 소정의 다가음이온성 중합체 0.8% w/v, 및 pH를 7.4로 조절하고 소정의 부피로 만들기 위해 사용된 증류수 및 수산화나트륨 (10%) 또는 디이소프로판올 아민이었다.
표준 멸균 방법을 사용하여, 카르보폴 소량을 프로펠러 교반기로 서서히 교반하면서 증류수와 혼합하였다. 분말이 용해될 때까지 교반을 계속하였다. 임의의 연행된 공기는 압력 (물 작동 진공 게이지)을 감소시켜 제거하였다. 글리세롤을 서서히 교반하면서 첨가하고 pH를 측정하여, 10% NaOH 용액 또는 디이소프로판올 아민을 사용하여 조성물을 pH 7.4로 조절하였다. 셀화가 일어나서 투명한 무색 마이크로겔을 생성시켰다. 얻어진 마이크로겔을 4℃에 저장하였다.
중량 대 중량으로 양을 측정하는 것을 제외하고는 동일한 방법을 사용하여, 하기 10 g 배치를 제조하였다.
| 배치 1 | |
| 잔탄검* | 0.6g |
| 글리세롤 | 2.058g |
| 수산화나트륨 펠릿 | 충분량 |
| 멸균수 | 충분량 |
| 배치 2 | |
| 카르보폴 934P | 0.08g |
| 글리세롤 | 2.058g |
| 수산화나트륨 (10% w/w) | 충분량 |
| 멸균수 | 충분량 |
| 배치 3 | |
| 카르보폴 934P | 0.04g |
| 글리세롤 | 2.058g |
| 40% w/w 디이소프로판올아민 | 충분량 |
| 멸균수 | 충분량 |
| 배치 4 | |
| 카르보폴 971P | 0.25g |
| 글리세롤 | 2.058g |
| 40% w/w 디이소프로판올아민 | 충분량 |
| 멸균수 | 충분량 |
| 배치 5 | |
| 카르보폴 974P | 0.08g |
| 글리세롤 | 2.058g |
| 40% w/w 디이소프로판올아민 | 충분량 |
| 멸균수 | 충분량 |
| * 몬산토 (Monsanto)가 공급한 켈트롤 (Keltrol)-T 브랜드 |
실시예 7
숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐라이드 (시그마 케미칼 캄파니 (미국 미저리주 세인트루이스)) 및 하기 화학약품, 재료 및 방법을 사용하여 크릴 광범 특이성 세린 프로테아제 활성을 일반적으로 평가하였다.
분석 완충제는 0.25 M HEPES (HEPES 5.96 g/100 ㎖) 및 1 mM CaCl2(1M CaCl2모액 100 ㎕/100 ㎖)로 이루어진다. HEPES 및 CaCl2를 증류수 약 50 ㎖ 중에서 합하고, 4M NaOH로 pH를 7.2로 조절하고, 증류수를 더 첨가하여 100 ㎖로 만들어서 용액을 제조하였다. HEPES는 매 1℃에 대하여 -0.015 pH 만큼씩 온도에 따라pH를 변화시킨다. 그러므로, 완충제의 pH를 평가 온도 (25℃)에서 조절한다.
기질 모액은 디메틸술폭시드 (DMSO) 중에 용해된 25 mM 숙시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로아닐라이드 (156.2 ㎎/10 ㎖)이다. 기질은 물을 함유하는 DMSO 중에 용해되지 않는다. 그러므로, DMSO는 건조제와 함께 용기 중에 저장한다. 건조 DMSO는 16-19℃에서 고체로 된다.
증류수 중에서 그의 희석액을 제조함으로써 효소 용액을 제조하였다. 효소가 얼음 상에 또는 냉장고 중에 저장된 경우, 평가하기 전에 효소 용액을 실온에서 적어도 10분 동안 평형화시킨다.
분석은 25℃에서 온도조절장치된 1 ㎖ 폴리카보네이트 큐벳 중에서 수행하였다. 시간에 따른 410 ㎚에서의 흡수도 변화를 모니터하였다. 분 당 형성된 생성물 μmole 단위의 반응속도를 곡선 A410 대 시간 (분)의 경사로부터 계산하였다.
분석 완충제 920 ㎕ 및 기질 모액 60 ㎕를 피펫을 통해 큐벳에 넣음으로써 평가분석을 수행하였다. 분석 완충제-기질 모액을 큐벳 교반기로 앞뒤로 철저하에 교반하여 기질 용액이 완충제와 완전히 혼합되도록 하였다 (용액 중의 큐벳 교반기를 회전시키거나 소용돌이치게 하는 것은 철저한 혼합을 위해서는 불충분하였다). 교반기를 큐벳 중에 정치시키고, 이것을 3분 이상 동안 25℃의 수욕 중에서 선반 (rack)에 위치시켰다. 인큐베이션 시간 종반에, 큐벳을 페이퍼 타월로 바깥을 건조시키고 온도조절장치된 큐벳 홀더 중에 위치시켰다. 이어서 효소 용액 20 ㎕를 높은 정확도로 20 ㎕를 전달시키는 액체 측정 장치를 사용하여 큐벳에 첨가하였다 (해밀톤 주사기, P20 길슨 피펫 또는 저부피 레이닌 자동 피펫을 사용하였다). 사용된 모든 피펫은 잘 검정하였고, 부피에 있어서의 1 ㎕ 오차는 최종 결과에 있어서 5% 오차를 발생시킬 수 있다.
효소를 큐벳 교반기를 사용하여 (앞뒤로만 교반시키고, 회전시키지는 않음) 기질 용액과 철저하게 혼합시키고, 샘플실을 닫고, 2분 20초 기간에 걸친 시간에 따른 흡수도를 측정함으로써 측정을 시작하여 각 20초마다 6회 이상 경사 판독값을 얻었다. 각 반응의 처음 20초는 래그(lag) 시간인 반면, 다음의 6번의 20초 기간의 경사는 기록하였다. dA/분 단위의 최고 경사치를 제공하는 2개의 연속적인 판독값을 선택하여 반응 속도로 나타냈다. 2개의 값의 평균을 계산하여 5.68을 곱하여 U/㎖ 단위의 용액 활성 농도를 얻었다.
본 명세서에서 서열 번호로 언급한 핵산 또는 아미노산 서열은 다음과 같다:
실시예 8
하기 실시예는 본 발명의 대표적인 마이크로겔 제제에 의한 외과적 유착의 감소를 예시한다. 본 발명의 조성물을 실시예 6에 기재한 바와 같이 제조하였다.
이들 조성물을 다음과 같이 토끼 측벽 모델에서의 유착 형성을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다.
동물: 암컷 뉴질랜드 화이트 토끼 2.4-2.7 ㎏ (아이리쉬 팜즈(Irish Farms; 미국 캘리포니아주 노르코))를 사용하기 적어도 2일 전에 격리시켰다. 토끼를 12:12 명:암 사이클로 우리에 가두고 물과 음식은 자유로이 이용할 수 있게 하였다.
측벽 모델: 토끼를 케타민 염산염 55 ㎎/㎏과 롬펌(Rompum) 5 ㎎/㎏의 혼합물로 근육내 마취시켰다. 멸균 수술을 위해 준비한 후, 중선 개복수술을 행하였다. 맹장과 내장을 끄집어 내고, 손가락으로 압력을 가하여 전체 표면에서 장막하 출혈을 일으켰다. 이어서 손상을 받은 장을 소반점 출혈이 관찰될 때까지 4".4×4겹 멸균 거즈로 가볍게 문질렀다. 이어서 맹장과 내장을 다시 정상 해부학적 위치로 복귀시켰다. 오른쪽 복부 측벽 상에서 복막과 횡복근의 3×5 ㎝ 영역을 제거하였다. 본 발명의 효소가 없는 마이크로겔 12 ㎖를 상해 부위에 분포시켰다. 절개부를 3-0 덱슨(Dexon) II로 2층으로 밀봉하였다. 1주 후 동물을 죽여서 유착에 관여한 측벽 상해 영역의 %를 측정하였다. 또한, 유착의 점착력을 하기 시스템을 사용하여 점수매겼다:
0 = 유착 없음
1 = 가벼운 쉽게 분할가능한 유착
2 = 보통의 유착; 분할가능하지 않으며, 기관을 인열시키지 않는다
3 = 치밀한 유착; 분할가능하지 않으며, 제거시 기관을 인열시킨다.
결과를 하기 표 1에 제공하였다. 유착의 발생 빈도, 면적 또는 점착력의 감소가 유리한 것으로 간주되었다. 각 조성물을 10마리의 토끼에서 시험하였다.
| 조성물 | A | B | C | D | E | Fδ |
| 사용된 카르보폴 | 971P | 974P | 934P | 934P* | 잔탄 | 없음 |
| 유착을 나타낸 집단 % | 10 | 80 | 20 | 40 | 40 | 100 |
| 형성된 유착의 평균 면적 | 10 | 50 | 25 | 50 | 22.5 | 88 |
| 형성된 유착의 평균 점착력 | 1 | 1.3 | 1.5 | 1 | 1 | 2 |
| * 934P*는 중화에 사용된 염기의 종류와 양에 있어서 934P와 상이하다. 934P는 NaOH로 중화되는 반면, 934P*는 디이소프로판올아민으로 중화되었다.δ 대조용 |
실시예 9
하기 실시예는 본 발명의 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제가 포함된 본 발명의 대표적인 마이크로겔 제제에 의한 유착 감소를 예시한다. 본 발명의 조성물은 충분량의 다작용성 크릴 유래 하이드롤라제, PHM-101을 마이크로겔 제제에 첨가한 것을 제외하고는 실시예 6에 기재한 바와 같이 제조하였다. 카르보폴 974P를 모든 제제에 사용하였다. 겔 조성물의 pH를 앞의 실시예에서와 같이 7.4로 조절하였다. 다른 모든 첨가제들을 또한 플라시보 (블랭크) 제제에도 포함시켰다.
토끼 측벽 모델 실험을 실시예 8에 기재한 바와 같이 수행하였다. 결과를 아래 표 2에 제공하였다.
| 군 | A | B | C | D | E | F* |
| 하이드롤라제 양 (U/㎖) | 0 | 8.33 | 0.17 | 4.16 | 1.04 | 0 |
| 유착을 나타낸 집단 % | 60 | 70 | 33 | 70 | 50 | 100 |
| 유착의 평균 면적 (%) | 33 | 76 | 23 | 49 | 22 | 80 |
| 형성된 유착의 평균 점착력 | 1 | 1.3 | 1 | 1 | 1 | 1.9 |
| * 대조군: 효소 또는 다가음이온성 중합체 없음 |
실시예 10
하기 실시예는 본 발명의 크릴 유래 프로테아제에 의한 유착 감소를 예시한다.
프로테아제를 0.2 U/㎖ 농도의 등장액 형태로 투여하였다. 용액이 동결 건조된 PHM-101 배치로부터 구성된 경우, 이 용액은 또한 본 출원의 앞부분에서 인용한 최종 제조 방식에 대해 설명한 부형제들을 함유하였다.
제제를 4-0 에틸론(Ethilon) (에티콘(Ethicon; 미국 뉴저지주 소머빌))에 의해 피하 포켓 내의 제위치에 고정된 미니삼투 펌프 (앨자 코포레이션 (Alza Corporation; 미국 캘리포니아주 팔로 알토))에 의해 시험 부위로 전달한 것을 제외하고는 실시예 8에 기재한 바와 같이 토끼 측벽 모델 시험을 수행하였다. 펌프는 수술 후 평균 3½일에 교환하였다. 시험 결과를 하기 표 3에 제공하였다.
| 플라시보 | 프로테아제 | |
| 유착을 나타내는 집단 % | 90% | 64% |
| 유착의 평균 면적 (%) | 64% | 35% |
실시예 11
본 실시예는 본 발명의 크릴 유래 프로테아제를 함유하는 본 발명의 마이크로겔 제제를 사용하여 사람의 창상의 한 형태인 각종 궤양을 치료하였을 때 얻어진 임상학 결과를 예시한다.
하기 열거한 마이크로겔 제제는 앞의 실시예에 설명한 것과 유사한 표준 멸균 처방 방법에 의해 제조하였다. 모든 경우에, 카르보폴 974가 친수성 다가음이온성 중합체이었다. 크릴 유래 다작용성 하이드롤라제, PHM-101 (롯트 CHX-088)을 사용하였다. 제제의 활성을 0.2 U/㎖로 만들기에 충분한 양의 하이드롤라제를 마이크로겔 제제에 첨가하였다.
| 성분 | 양 |
| 글리세롤, 87% (머크 (독일 다름스타트) 제품) | 23.5 g/l 용액 |
| 카르보폴 974 (비에프 굿리치 (미국) 제품) | 8.0 g/l 용액 |
| 재증류수 | 724 ㎖/l 용액 |
| 10% NaOHaq | pH를 7.4±0.1로 만드는 충분량 |
상기 제제를 사용하여 수행한 몇가지 임상 시험의 결과를 하기 표 4에 요약하였다.
| 성별 | 연령 | 진단 | 괴사조직제거 | 악취 | 통증 | 치유 |
| M | 66 | 욕창성 궤양 | + | - | ||
| F | 56 | 병소, 국소 진행성 유방암 | + | + | ||
| M | 33 | 욕창성 궤양 | + | - | ||
| M | 57 | 욕창성 궤양 | + | + | ||
| F | 88 | 20년간 지속된 정맥성 궤양 | + | + | + | + |
| M | 74 | 다리의 당뇨성 궤양 | + | + | + | + |
| F | 73 | 동맥성 궤양 | + | + | + | + |
| M | 70 | 동맥성 궤양 | + | + | + | + |
| F | 63 | 욕창성 궤양 | + | + | + | + |
| M | 69 | 동맥성 궤양 | + | + | + | + |
| F | 64 | 감염된 외과적 창상(샅) | + | + | + | + |
| + = 효과를 관찰할 수 있었던 경우 바람직한 효과가 관찰되었다.- = 효과가 보일 수 있었던 경우 효과가 전혀 관찰되지 않았다. |
따라서 10명의 환자 중 8명이 치료에 대해 예상치못한 치유 반응을 나타냈다.
상기한 실시예들은 본 발명의 실행과 유용성을 입증하기 위한 것으로, 결코 이들이 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 기재한 핵산 서열, 및 결과적으로 그로부터 유도된 단백질 서열을 조심스럽게 서열화하였다. 그러나, 당업계의 통상의 숙련인은 핵산 서열화 기술이 어느 정도 부주의한 에러가 있을 수 있음을 알 것이다. 관련 업계의 통상의 숙련인은 문제의 핵산 서열을 단리하는 방법에 대한 본 명세서의 충분한 설명에 기초하여 이들 서열을 확인하거나 수정할 수 있으며, 본 발명의 개시내용에 의해 용이하게 이용가능한 이러한 변법은 본 발명에 포함된다. 또한, 본 명세서에 보고된 서열은 이후의 해명 연구가 서열화 에러를 확인하였던지 그렇지 않던지에 무관하게 본 발명 내의 기능적 생물학적 거대분자를 정의한다고 생각된다.
본 출원은 많은 핵산 서열을 기술하고 있는데, 이들 중에서 보다 밀접한 관계가 있는 것을 아래에 요약한다.
| 간단한 이름 | 핵산 서열 | 단백질 서열 | 설명 |
| p62 | 1 | 2 | 핵산은 LLLALVAAASAAEWRW 서열부터 리딩 프레임의 말단까지 코딩한다 (2개의 프레임내 중지 코돈으로 표시됨). |
| p31 | 3 | 4 | 핵산은 p62의 AA117에서 시작되는 것과 매우 상동성인 서열부터 리딩 프레임의 말단까지 코딩한다 |
| p5.1a | 5 | 6 | 핵산은 p62의 AA1-170과 매우 상동성인 서열+ N-말단에 융합된 추가의 7-아미노산 서열을 코딩한다 |
| p13 | 7 | 8 | 핵산은 p62의 AA73-283과 매우 상동성인 서열을 코딩한다. |
| p912 | 9 | 10 | 핵산은 p62의 AA1-300과 매우 상동성인 서열+ N-말단에 융합된 추가의 2-아미노산 서열을 코딩한다 |
| p5.1b | 11 | 12 | 핵산은 p62의 AA1-170과 매우 상동성인 서열+ N-말단에 융합된 추가의 7-아미노산 서열을 코딩한다. 4개의 PCR 생성물로부터 유도된 컨센서스 서열을 포함한다. |
본 발명을 바람직한 실시태양을 강조하여 설명하였지만, 바람직한 장치 및 방법에 있어서의 변형이 사용될 수 있고 본 발명은 본 명세서에서 구체적으로 설명한 바와 다르게 실행될 수 있음이 당업계의 통상의 숙련인들에게는 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 하기하는 특허 청구의 범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 본질 및 영역 내에 포함된 모든 변형물들을 포함한다.
Claims (52)
- 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔의, 각막 창상 및 내인성 외상으로 이루어진 군으로부터 선택된 외상을 입은 영역 치료용 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 각막 창상이 각막 궤양, 각막상피 박리, 또는 각막 궤양을 일으키기 쉬운 각막에 대한 화학적 또는 물리적 상해인 용도.
- 제2항에 있어서, 상기 각막 궤양이 감염성인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 외상이 내부 외과적 창상인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 외상이 내부 기관 또는 조직을 덮거나 또는 하나 이상의 내부 기관 또는 조직이 위치하는 강(腔)을 덮는 막에 대한 외상을 포함하는 용도.
- 제5항에 있어서, 상기 막이 복막, 심막, 심외막 및 흉막으로 이루어진 군으로부터 선택된 장막인 용도.
- 제5항에 있어서, 상기 막이 상피인 용도.
- 제7항에 있어서, 상기 상피가 내피인 용도.
- 제5항에 있어서, 상기 막이 뇌막인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 외상이 건(腱) 또는 건초(腱硝)에 대한 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 외상이 신경 또는 신경초에 대한 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 내인성 외상이 유착을 일으키기 쉬운 것이고, 투여되는 마이크로겔의 양이 유착의 형성 또는 재형성을 예방 또는 감소시키는데 효과적인 양인 것인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물이 단백질을 추가로 포함하는 용도.
- 제13항에 있어서, 상기 단백질이 키모트립신, 트립신, 콜라게나제 및 엘라스타제 활성 중의 2가지 이상을 포함하는 활성을 갖는 프로테아제인 용도.
- 제14항에 있어서, 상기 프로테아제가 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 (Panaeus vanameii) 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 (Panaeus monodon) 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 (Uca pugilator) 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 (Kamchatka crab) IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 (Crayfish) 프로테아제 1, 연어(Salmon) 효소 1, 대서양 대구(Atlantic cod) I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소인 용도.
- 제15항에 있어서, 상기 창상이 각막 궤양, 각막상피 박리, 및 각막 궤양을 일으키기 쉬운 각막에 대한 화학적 또는 물리적 상해로 이루어진 군으로부터 선택된 각막 창상인 용도.
- 제16항에 있어서, 상기 각막 궤양이 감염성인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 가교결합된 다가음이온성 중합체가 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 것인 용도.
- 제18항에 있어서, 상기 관능기가 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택되고, 상기 전구체기가 -C(O)R4, -S(O2)OR4또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택되는 용도.
- 제19항에 있어서, 상기 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물이 하기 화학식으로 표시될 수 있는 용도.(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y식 중, Y는 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다.
- 제20항에 있어서, 상기 R1, R2및 R3이 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X가 직접 결합 또는 C1-C3알킬렌인 용도.
- 제21항에 있어서, 상기 R2및 R3이 H이고, R1이 수소 또는 메틸이고, X가 직접 결합인 용도.
- 제22항에 있어서, 상기 Y가 -C(O)OR4인 용도.
- 제23항에 있어서, 상기 R4가 수소 또는 메틸인 용도.
- 제24항에 있어서, 상기 R4가 수소인 용도.
- 제25항에 있어서, 상기 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하인 용도.
- 제26항에 있어서, 상기 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.01 이하인 용도.
- 제26항에 있어서, 상기 에틸렌계 불포화 가교결합제가 수크로스의 트리알릴에테르 또는 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르 중의 하나인 용도.
- 제28항에 있어서, 상기 에틸렌계 불포화 가교결합제가 펜타에리트리톨의 트리알릴 에테르인 용도.
- 제1항에 있어서, 상기 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하인 용도.
- 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔의, 유착을 일으키기 쉬운 외상을 입은 영역에서 유착의 형성 또는 재형성을 감소시키거나 또는 예방하기 위한 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하고,iii) 상기 가교결합된 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 전체 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하이거나, 또는iv) 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하인 조건 중의 적어도 하나가 적용되는 마이크로겔의, 창상을 입은 영역 치료용 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 제32항에 있어서, 상기 관능기가 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택되고, 상기 전구체기가 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된 용도.
- 제33항에 있어서, 상기 1종 이상의 에틸렌계 불포화 단량체가 하기 화학식으로 표시될 수 있는 용도.(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y식 중, Y는 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자는 O 또는 S에 직접 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다.
- 제34항에 있어서, 상기 R1, R2및 R3이 독립적으로 수소 또는 C1-C3알킬이고, X가 직접 결합이고, Y가 C(O)OR4인 용도.
- 제35항에 있어서, 상기 R1, R2및 R3이 수소이고, R4가 수소인 용도.
- 제32항에 있어서, 상기 조성물이 단백질을 추가로 포함하는 용도.
- 키모트립신, 트립신, 콜라게나제 및 엘라스타제 활성 중의 2가지 이상을 포함하는 활성을 갖는 단백질의, 각막 창상 치료용 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 제38항에 있어서, 상기 각막 창상이 각막 궤양, 각막상피 박리, 및 각막 궤양을 일으키기 쉬운 각막에 대한 화학적 또는 물리적 상해인 용도.
- 제39항에 있어서, 상기 각막 궤양이 감염성인 용도.
- 제38항에 있어서, 상기 단백질이 (a) 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 다작용성 효소인 용도.
- 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가i) 염기로 적정되어 음으로 하전된 관능기를 형성할 수 있는 1개 이상의 관능기, 또는ii) 염기로 적정될 수 있는 관능기의 전구체로서, 상기 관능기로 전환되는 1개 이상의 전구체기를 갖는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물과의 중합반응에 의해 제조된 가교결합된 다가음이온성 중합체를 포함하는 마이크로겔의, 이식가능한 장치의 이식 후 유착의 형성을 예방하거나 또는 감소하기 위한 조성물의 제조에 있어서의 용도.
- 제42항에 있어서, 상기 관능기가 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소임}로부터 선택되고, 상기 전구체기가 -C(O)R4, -S(O2)OR4, 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 독립적으로 C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}로부터 선택된 용도.
- 제43항에 있어서, 상기 가교결합된 다가음이온성 중합체가 1종 이상의 에틸렌계 불포화 가교결합제와, 적어도 하나가 하기 화학식으로 표시될 수 있는 1종 이상의 에틸렌계 불포화 화합물의 혼합물로부터 제조되는 용도.(R3)(R2)C=C(R1)-X-Y식 중, Y는 -C(O)OR4; -S(O2)OR4; 또는 -S(O)OR4{여기서, R4는 수소, C1-C6노르말 또는 분지 알킬, 페닐 또는 벤질임}이고,X는 직접 결합; 1개 이상이 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환될 수 있으나, 단, Y에 대한 α 또는 β 위치에는 헤테로원자가 존재하지 않는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬렌기; 페닐렌; O, S 및 N으로부터 독립적으로 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴렌이고, 단, Y와 R3R2C=C(R1)-은 헤테로원자에 결합되지 않으며,R1, R2및 R3은 독립적으로 수소, C1-C6알킬, 카르복시, 할로겐, 시아노, 이소시아나토, C1-C6히드록시알킬, 2 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 알콕시알킬, C1-C6할로알킬, C1-C6시아노알킬, C3-C6시클로알킬, C1-C6카르복시알킬, 아릴, 히드록시아릴, 할로아릴, 시아노아릴, C1-C6알콕시아릴, 카르복시아릴, 니트로아릴 및 -X-Y기로부터 선택되고, 여기서, C1-C6알킬 또는 C1-C6알콕시기는 직쇄 또는 분지쇄이고, 임의의 C3-C6시클로알킬기 중의 Q-2개 이하의 탄소 원자 {여기서, Q는 시클로알킬기 중의 고리 탄소 원자들의 총수임}는 독립적으로 O, S 또는 N 헤테로원자로 치환되고, 단, 이중 결합된 탄소 원자가 O 또는 S에 직접적으로 결합되지 않고, 상기 아릴은 페닐, 또는 O, S 및 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개 이하의 헤테로원자를 갖는 5 또는 6원 헤테로아릴기이다.
- 제42항에 있어서, 상기 마이크로겔이 단백질을 추가로 포함하는 용도.
- 제42항에 있어서, 상기 다가음이온성 중합체를 제조하기 위한 혼합물 중의 에틸렌계 불포화 가교결합제에 기인한 에틸렌계 이중 결합의 몰분율이 0.02 이하인 용도.
- 제42항에 있어서, 상기 마이크로겔의 마이크로점도에 대한 마이크로겔의 마크로점도의 비가 10,000 이하인 용도.
- 담수를 사용하여 다작용성 단백질분해 효소를 추출하는 것을 포함하는, 생물학적 시료로부터의 다작용성 단백질분해 효소의 단리 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 생물학적 시료가 기계적으로 파괴되지 않는 방법.
- 제48항에 있어서, 담수 추출물을 아미노페닐보로네이트인 리간드를 갖는 친화도 컬럼에 가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 생물학적 추출물을 아미노페닐보로네이트인 리간드를 갖는 친화도 컬럼에 가하는 것을 포함하는, 생물학적 추출물로부터의 다작용성 단백질분해 효소의 단리 방법.
- 제48항 또는 제51항에 있어서, 상기 다작용성 단백질분해 효소가 (a) 키모트립신, 트립신, 콜라게나제 및 엘라스타제 활성 중 하나 이상을 포함하는 활성을 갖고, 서열 2의 AA64-300 또는 서열 2의 AA1-300인 기준 서열, 또는 이들과 서열 4, 6, 8, 10 또는 12에서 발견되는 잔기 차이들 중 적어도 1가지가 상이한 서열과 약 60% 이상의 서열 유사성을 갖는 제1 효소, 또는 (b) 파내우스 바나메이 1, 파내우스 바나메이 2, 파내우스 모노돈 키모트립틱-1, 파내우스 모노돈 트립틱, 파내우스 모노돈 키모트립틱-2, 우카 푸길라터 효소 I, 우카 푸길라터 효소 II, 캄차카 게 IA, 캄차카 게 IIA, 캄차카 게 IIB, 캄차카 게 IIC, 가재 프로테아제 1, 연어 효소 1, 대서양 대구 I 또는 대서양 대구 II인 제2 효소인 방법.
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