KR100706294B1 - 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법 - Google Patents

연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 연골어류인 상어 및 홍어의 연골로부터 경제적이고 효과적인 공정을 통해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate, CS) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻을 수 있으며, 저분자량, 보다 바람직하게는 평균분자량이 3,000∼12,000 Da인 콘드로이틴 황산의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 효소가수분해, 산가수분해, 여과 및 정제공정을 통해 저분자량의 콘드로이틴 황산 제조방법 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 연골어류의 연골을 재료로 하는 콘드로이틴 황산의 제조에 있어서,
연골어류의 연골을 분쇄하는 단계,
분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,
연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,
산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함한다.

Description

연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법{low molecular weight chondroitin sulfates from cartilage of chondrichthyes and Process for preparing thereof}
도 1은 본 발명의 연골어류의 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 제조공정도이다.
도 2a는 상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동.
도 2b는 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동.
도 3a는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이고, 도 3b는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이다.
도 3e는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3f는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 상어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.
도 4b는 홍어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻은 저분자 콘드로이틴 황산 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 연골어류인 상어 및 홍어의 연골로부터 경제적이고 효과적인 공정을 통해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산(chondroitin sulfate, CS) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
콘드로이틴 황산은 연골, 혈관 및 뼈를 비롯한 동물의 조직에 널리 분포하고 있는 점질성 다당류로서 황산기의 위치에 따라 크게 콘드로이틴 황산 A(chondroitin sulfate A), 콘드로이틴 황산 B(chondroitin sulfate B) 및 콘드로이틴 황산 C(chondroitin sulfate C)의 세 가지로 구분된다.
콘드로이틴 황산은 D-글루쿠론산과 N-아세틸-D-갈락토사민 β(1→3) 결합에 의해 이루어진 이당류를 단위로 하여 반복되어지는 다당류이다.
이러한 이당류 단위는 황산기가 존재하는 위치에 따라 △Di-6S, △Di-4S 및 △Di-2,6diS 등으로 나눌 수 있으며 황산기가 없는 △Di-0S도 있다.
일반적으로 육상동물 유래 콘드로이틴 황산의 경우는 대부분 △Di-0S, △Di-6S 및 △Di-4S로 이루어져 있으며, 어류의 연골에서 유래한 콘드로이틴 황산은 △Di-2,6diS도 존재한다.
콘드로이틴 황산을 구성하고 있는 황산화 이당류들은 생체활성과 같은 특성에 크게 관여하고 있다.
콘드로이틴 황산은 분자량이 5,000∼20,000 Da 정도의 저분자 영역에 가까울수록 흡수율 및 생리활성이 뛰어나다. 특히, 관절염 관련 약품 및 건강기능식품은 구강으로 섭취하기 때문에 저분자일수록 인체에 흡수가 많이 되어 생체이용률 측면에서 바람직하다(Kelly G.S., Alternative Medicine Review, 1998, 3: 37-44).
콘드로이틴 황산은 현재 관절염의 예방 및 치료를 목적으로 약품 및 건강기능식품의 소재와 화장품의 원료로 널리 이용되고 있다.
전 세계적으로 노령 인구가 증가함에 따라 실버산업의 성장 또한 증가하고 있으며, 이러한 추세의 일예로서 노령자에게 필요한 약품, 건강식품의 시장 역시 확대되고, 이처럼 노령자에게 필요한 약품, 건강식품의 재료의 하나인 콘드로이틴 황산 시장 규모는 매우 커질 것이다.
관절염 관련의 약품 및 건강기능식품에 사용되는 콘드로이틴 황산은 대부분 육상동물 유래의 소재를 사용하고 있으나, 특히 소의 골분을 이용한 제품은 광우병의 우려를 내포하고 있다.
현재, 소의 골분을 대체하는 소재로 상어연골이 각광을 받고 있으나 아무런 처리가 되지 않은 연골분말의 형태, 즉 고분자 콘드로이틴 황산을 함유하고 있는 상태로 소비되고 있어 흡수율이 높지 못하다.
콘드로이틴 황산의 주요 원료로는 소 기관지(bovine trachea) 및 상어 연골(shark cartilage)이 주로 이용되고 있다.
일반적으로 소 기관지 유래 콘드로이틴 황산은 분자량이 20,000 Da 이하로 저분자이지만, 상어연골 유래 콘드로이틴 황산은 50,000 Da에서 100,000 Da 정도로 고분자이다(Adebowale A.O. et al., J. Am. Nutraceutical Assoc., 2000, 3: 27-39). 특히, 상어 연골 관련 제품은 단순추출물 또는 원료 상태 그대로 분말화만 되어 출시되고 있어 소화흡수율이 매우 낮다.
일반적인 콘드로이틴 황산의 저분자화 방법은 강산 및 강알칼리 가수분해, 중금속 촉매의 과산화수소를 이용한 가수분해 등이 있다(Vopli et al., Analytical Bi℃hemistry, 1992, 200:100-107; Cho et al., Biol. Pharm. Bull., 2004, 27:47-51; Vopli et al., Carbohydrate Research, 1999, 315:345-349). 하지만, 이러한 방법들은 공정이 복잡하고, 비용이 많이 소요되기 때문에 실제 경제적으로 생산하는 공정보다는 학문적인 공정에 가까운 문제가 있다.
본 발명에서는 흡수율 및 생체 이용률 측면에서 연골어류인 상어 연골을 원료로 하거나 또는 홍어 연골을 원료로 하는 저분자 콘드로이틴 황산 및 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.
한편 본 발명과 관련된 종래 기술로서 한국공개특허공보 제2002-0078053호에 (1)동물 연골 조직을 엔도프로타제로 가수분해하고, (2)상기 (1)에서 얻은 가수분해물을 엔도프로타제와 엑소펩티다제로 가수분해하고, (3)상기 (2)에서 얻은 가수분해물에 염을 가하고 알콜로 분별침전시키고, (4)상기 (3)단계에서 얻은 침전물을 탈염하는 단계로 이루어진 콘드로이틴 황산의 정제방법이 있다.
또한 한국공개특허 제2004-0098738호에 (1)균질화한 닭식도에 닭식도의 10배에 해당하는 양의 증류수를 첨가하고 120℃의 온도로 1시간 동안 가열한 후, 4℃로 방냉하여 탈지하는 단계, (2)탈지 후 수산화나트륨을 가하여 pH를 9.0으로 조정하고, 엔도펩티다아제를 닭식도 건물 중량 대비 2％ 첨가하여 55℃에서 24시간 동안 쉐이킹 인큐규베이션(incubation)하는 단계, (3)300rpm으로 30분간 원심분리한 후 상등액을 수집하는 단계를 포함하는 닭식도로부터 콘드로이틴 황산을 추출하는 방법이 있다.
그러나 상기 선행기술들은 본 발명의 연골어류의 연골을 분쇄하는 단계, 분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계, 연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계, 산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함하는 저분자 콘드로이틴 황산의 제조방법과는 기술적 구성을 달리한다.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 얻을 수 있으며, 저분자, 보다 바람직하게는 평균분자량이 3,000∼12,000 Da인 콘드로이틴 황산의 제공을 목적으로 한다.
본 발명은 연골어류의 연골로부터 효소가수분해, 산가수분해, 여과 및 정제공정을 통해 저분자 콘드로이틴 황산 제조방법 제공을 목적으로 한다.
본 발명에 의해 제조한 저분자 콘드로이틴 황산은 의약품, 화장품 또는 건강기능성 식품 소재로 활용 할 수 있다.
상기에서 언급한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 연골어류의 연골을 재료로 하는 콘드로이틴 황산의 제조에 있어서,
연골어류의 연골을 분쇄하는 단계,
분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,
연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,
산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함한다.
이하 본 발명의 연골어류의 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조방법을 각각의 단계에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다.
(1) 연골어류의 연골 분쇄
본 발명에서 연골어류는 종래 콘드로이틴 황산 제조시 사용하는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 연골어류의 일예로서 상어 또는 홍어의 연골을 콘드로이틴 황산 제조시 원료로 사용할 수 있다.
본 발명에서 연골어류의 연골은 추후 공정인 효소가수분해 및 산가수분해시 각각의 가수분해가 잘 이루어 질 정도로 분쇄하는 것이 좋다. 본 발명에서 이러한 연골 분쇄의 일예로서 연골을 5∼20mm로 파쇄할 수 있다.
(2) 분쇄된 연골에 물과 효소를 첨가하여 연골을 효소가수분해하는 단계,
콘드로이틴 황산은 연골의 주요 구성성분으로 핵단백질(core protein)과 결합된 상태로 존재하고 있다. 따라서 프로테아제와 같은 단백질 분해효소를 이용하여 건조된 연골 조직을 와해시키면서 가수분해시켜 고분자 콘드로이틴 황산을 얻는 단계가 필요하다.
따라서 연골 조직을 와해시키면서 가수분해시켜 고분자 콘드로이틴 황산을 얻기 위해 상기 (1)단계를 이용하여 파쇄한 연골에 연골 중량 대비 5∼15배의 물을 가하고 효소를 연골 중량 대비 1.0∼2.0％ 첨가하고 1∼5시간 동안 10∼100rpm으로 교반하여 연골의 효소가수분해를 실시한다. 교반시 온도는 효소의 최적활성을 나타내는 온도에서 실시할 수 있다. 이러한 온도조건은 효소에 따라 최적활성을 나타내는 온도가 서로 상이하므로 사용하는 효소에 따라 온도조건을 적의 선택할 수 있다.
연골을 분해하는 효소는 연골어류의 연골을 핵단백질을 분해랄 수 있는 것이라면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 본 발명에서 이러한 연골을 분해하는 효소의 일예로서 프로테아제(protease)의 일종인 맥사자임 NNP(Maxazyme NNP), 알칼라제(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 나투자임(Natoozyme) 중에서 선택된 어느 하나의 효소를 사용하거나 또는 둘 이상의 효소를 사용할 수 있다. 이때 두 개의 효소를 사용하는 경우 각각 1:9∼9:1의 비로 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게 는 가격이 저렴한 맥사자임 NNP를 사용하는 것이 좋다.
본 발명에서 상기의 효소를 이용하여 다양한 조건에 의해 연골어류의 연골을 효소가수분해를 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해 연골어류의 연골 효소가수분해는 전술한 수치범위로 연골을 효소가수분해하는 것이 좋다.
(3) 연골 효소가수분해물에 약산을 첨가하여 산가수분해하는 단계,
상기 (2)단계로부터 얻은 고분자 콘드로이틴 황산은 저분자화 처리 공정과 정제공정을 거쳐야 한다.
일반적으로 저분자화 처리공정으로 강산 및 강알칼리를 분해시키거나 또는 중금속을 촉매로 하는 과산화수소를 이용해 고분자의 콘드로이틴 황산을 분해시켜 저분자 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다. 그러나 이러한 방법들은 콘드로이틴 황산의 생체 활성에 주요 인자인 황산기(sulfate group, SO3)의 제거, 수율 및 경제성의 저하를 가져오는 문제가 있다. 그래서 본 발명에서는 약산 보다 바람직하게는 식품첨가물로 사용되고 있는 안정한 유기산과 비교적 열에 안정한 콘드로이틴 황산의 특성을 고려해 유기산과 고온고압의 조건에서 효소가수분해물의 가수분해를 실시할 수 있다.
따라서 고분자의 콘드로이틴 황산의 저분자화 처리공정으로 본 발명에서는 상기 (2)단계로부터 얻은 효소가수분해물에 약산을 연골 중량 대비 1％∼2.5％ 첨가하고 120∼130℃, 1.0∼1.5 kg/cm2에서 30분∼100분 동안 산가수분해를 실시한다.
본 발명에서 약산은 농도가 0.1∼2.4M인 유기산 또는 무기산을 사용할 수 있 다. 보다 바람직하게는 식품첨가물로 사용할 수 있는 유기산을 사용하는 것이 좋다.
상기에서 약산은 말산(malic acid), 구연산(citric acid), 아스코르브산(ascorbic acid), 아세트산(acetic acid) 중에서 선택된 어느 하나의 유기산을 사용하거나 또는 둘 이상을 사용할 수 있다. 이때 두 개의 유기산을 사용하는 경우 각각 1:9∼9:1의 비로 혼합된 유기산을 사용할 수 있다.
상기에서 약산은 염산과 같은 무기산을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기의 약산을 이용하여 다양한 조건에 의해 연골어류의 연골 효소가수분해물의 산가수분해를 실시한바, 본 발명의 목적을 달성하기 위해서 연골어류의 연골효소가수분해물의 산가수분해는 전술한 수치의 조건으로 산가수분해하는 것이 좋다.
(4) 산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계
상기 (3)단계의 산가수분해가 끝나면 가수분해물을 여과하고 정제하여 목적하는 저분자 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.
이때 가수분해물의 여과는 통상적으로 사용하는 여과종이, 여과포와 같은 여과재 또는 여과장치를 이용하여 여과를 실시할 수 있으면 족하므로 이하 자세한 내용은 생략하기로 한다.
또한 여과된 가수분해물은 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 정제를 실시할 수 있다. 본 발명에서 이러한 이온교환 크로마토그래피의 일예로서 DEAE- Sephacel 칼럼을 사용하며, 50mM 인산완충액을 사용하여 샘플을 로딩(loading)한 후 염화나트륨(NaCl) 용액을 0에서 1M 까지 직선적으로 증가시키면서 저분자 콘드로이틴 황산을 용출시켜 얻을 수 있다.
상기에서 여과, 정제된 저분자 콘드로이틴 황산은 탈염, 건조 및 재차 분쇄하여 제품화할 수 있다.
한편 본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 평균분자량이 3,000∼12,000 Da 이고, 비황산화 이당류(△Di-0S) 3.6∼12.8％, C6 위치 황산화 이당류(△Di-6S) 41.1∼54.8％, C4 위치 황산화 이당류(△Di-4S) 28.4∼38.3％ 및 C2, C6 위치 이황산화 이당류(△Di-2,6diS) 4.7∼16.4％를 구성하고 있으며 이러한 이당류들이 임의로 배열된 구조의 상어 연골 유래의 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.
그리고, 본 발명은 상기에서 언급한 방법에 의해 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 비황산화 이당류(△Di-0S) 5.8∼11.8％, C6 위치 황산화 이당류(△Di-6S) 67.4∼72.8％, C4 위치 황산화 이당류(△Di-4S) 13.8∼19.6％ 및 C2, C6 위치 이황산화 이당류(△Di-2,6diS) 2.7∼6.1％를 구성하고 있으며 이러한 이당류들이 임의로 배열된 구조의 홍어 연골 유래 콘드로이틴 황산을 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 상기에서 언급한 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 상어 연골 유래의 콘드로이틴 황산 또는 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 홍어 연골 유래의 콘드로이틴 황산을 약품, 건강보조식품, 화장품 중에서 선택된 어느 하 나에 사용할 수 있다.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 약품은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함하여 관절염 관련 약품에 사용할 수 있다.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 건강보조식품은 식품학적으로 허용하는 고상의 부형제를 포함하여 분말, 환(丸), 정제(tablet), 산제, 캡슐(capsule)과 같은 고상 형태로 제형화 될 수 있다. 또한 콘드로이틴 황산을 함유하는 건강보조식품은 식품학적으로 허용하는 액상의 부형제를 포함하여 음료, 드링크제, 페이스트(paste)와 같은 액상 형태로 제형화 될 수 있다.
상기에서 콘드로이틴 황산을 함유하는 화장품은 통상적으로 사용하는 화장품 재료에 첨가되어 액상, 고상 또는 페이스트 제형의 화장품으로 제공될 수 있다.
이하, 본 발명은 하기의 실시예 및 시험예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명에 의한 하나의 일실시예일 뿐 이들에 의해 본 발명의 권리범위하 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 상어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조
도 1과 같은 제조공정을 이용하여 상어 연골로부터 콘드로이틴 황산을 제조하였다.
5mm로 파쇄하고 건조한 상어 연골에 연골 중량 대비 10배의 물을 가하고, 상어 연골 중량 대비 1.65％의 맥사자임 NNP를 첨가하였다. 그런 다음 맥사자임 NNP 의 최적 활성 온도인 50℃에서 3시간 동안 50rpm으로 교반하면서 효소가수분해를 실시하였다. 이후 여과를 통해 가수분해되지 않은 연골성분을 제거하였다.
상기에서 얻은 효소가수분해물에 유기산으로 말산을 상어 연골 중량 대비 1.18％ 첨가하고 121℃, 1.5 kg/cm2에서 48분 동안 산가수분해를 실시하였다.
산가수분해가 끝난 후 여과재를 이용하여 여과한 후 이온교환 크로마토그래피를 정제하여 저분자 콘드로이틴 황산을 정제하였다. 이때 이온교환 크로마토그래피는 DEAE-Sephacel 칼럼을 사용하며, 50mM 인산완충액을 사용하여 샘플을 로딩(loading)한 후 염화나트륨(NaCl) 용액을 0에서 1M 까지 직선적으로 증가시키면서 저분자 콘드로이틴 황산을 용출시켜 정제하였다.
정제한 저분자 콘드로이틴 황산은 탈염을 거친 후 -7℃에서 동결건조 시킨 다음 100메쉬로 분쇄하여 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.
<실시예 2> 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조
5mm로 파쇄하고 건조한 홍어 연골을 사용하고, 산가수분해시 말산을 홍어 연골 중량 대비 1.64％ 첨가하고 121℃, 1.5 kg/cm2에서 46분 동안 산가수분해를 실시하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 저분자 콘드로이틴 황산을 제조하였다.
<시험예 1> 가수분해제의 종류에 따른 콘드로이틴 황산의 물리화학적 특성
본 발명에서는 경제적이고 효율적인 저분자화 공정을 개발하기 위하여 알칼리, 유기산 및 무기산을 가수분해제로 검토하였다.
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 하기 표 1에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산의 분자량, 황산화도 및 수율을 비롯한 주요 물리화학적 특성을 측정하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
상기에서 콘드로이틴 황산의 분자량은 HPSEC(High-Performance Size-Exclusion Chromatography) 장치를 이용하여 측정되었으며, 분자량 3,000에서 1,000,000 사이의 콘드로이틴 황산 표준품들이 검량선 작성을 위해 사용되었다.
상기에서 콘드로이틴 황산의 황산화도는 총이당류 함량에서 황산화된 이당류가 차지하는 비율을 백분율로 나타낸 것이며, 수율은 사용된 연골 무게 대비 최종 제품의 무게의 비율로 계산되었다.
산가수분해제를 사용한 저분자 콘드로이틴 황산의 평균분자량의 경향을 보면, 알칼리보다는 산을 이용한 콘드로이틴 황산의 경우가 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다. 특히, 구연산을 가수분해제로 이용한 경우 무기산인 염산 보다 저분자화 효과가 더 크게 나타났으며 다른 유기산인 말산 및 아스코르브산의 경우도 비슷한 수준을 보여주고 있다. 또한, 콘드로이틴 황산은 일반적으로 가수분해되어 저분자화 될 때 황산기가 떨어져 나가는 탈황산화(desulfation)가 동반된다. 본 발명에서도 분자량이 작아질수록 황산화도가 낮아지는 것으로 나타났다. 반면에, 유기산 처리구 중에는 말산 처리구가 황산화도가 높으면서 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다. 저분자처리를 하지 않은 미처리구의 경우 높은 수율을 보이고 있으나 저분자화가 많이 될수록 수율이 2∼4％ 정도 감소하였다. 말산 및 아스코르브산 처리구의 경우 알칼리 처리구에 비해 큰 수율 차이를 보이지 않으면서 저분자화 효과가 큰 것으로 나타났다.
<표 1> 가수분해제의 종류에 따른 콘드로이틴 황산의 특성
가수분해제 평균분자량 (Da) 황산화도 (％) 수율 (％)
상어 홍어 상어 홍어 상어 홍어
미처리 109,060 215,314 99.12 94.68 10.78 13.16
0.1M 수산화나트륨 31,599 41,483 98.53 93.75 8.72 11.89
0.1M 탄산나트륨 32,038 37,352 98.58 93.80 8.14 11.18
0.1M 인산나트륨 28,788 36,648 98.14 93.95 8.33 11.13
0.1M 염산 5,213 9,155 97.32 93.12 7.25 10.19
0.1M 말산 5,821 8,244 96.29 92.20 7.74 9.75
0.1M 구연산 4,302 7,220 96.52 91.72 7.16 9.44
0.1M 아스코르브산 9,235 11,865 96.87 93.78 8.28 10.17
<시험예 2> 아가로스 겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)
시험예 1에서 HPSEC 장치를 이용한 콘드로이틴 황산의 분자량 측정방법은 고가의 장치 구입비 및 칼럼 구매 경비가 들어가기 때문에 간단하고 경제적으로 대략적인 분자량을 검증할 수 있는 아가로스 겔 전기영동을 이용하였다.
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 상기 표 1에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동을 시행하고 그 결과를 도 2a,2b에 나타내었다.
도 2a는 상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동이고, 도 2b는 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산의 아가로스 겔 전기영동이 다.
도 2a,2b에서 1은 분자량이 15,000 Da인 표품 콘드로이틴 황산, 2는 분자량이 40,000 Da인 표품 콘드로이틴 황산, 3은 미처리구, 4는 수산화나트륨 처리구, 5는 탄산나트륨 처리구, 6은 인산나트륨 처리구, 7은 구연산 처리구, 8은 말산 처리구, 10은 아스코르브산 처리구, 10은 염산 처리구를 나타낸다.
도 2a,2b를 보면 미처리구인 고분자의 상어 및 홍어 콘드로이틴 황산의 경우 1.5％ 아가로스 겔(agarose gel)을 제대로 통과하지 못해 위쪽에 진한 밴드를 나타내고 있으며, 알칼리(수산화나트륨, 탄산나트륨, 인산나트륨) 처리구들은 분자량 40,000 Da 표품과 거의 비슷한 이동도를 나타내고 있다. 유기산(말산, 구연산, 아스코르브산) 및 무기산(염산) 처리구들은 분자량 15,000 Da 표품 보다 밴드가 낮은 위치에서 나타나 HPSEC 결과와 비슷한 경향을 보였다.
<시험예 3> 이당류 조성 분석
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산 제조시 하기 표 2, 표 3에 언급된 알칼리, 유기산 및 무기산의 산가수분해제를 이용하여 제조한 콘드로이틴 황산에 대하여 강음이온교환 칼럼(strong-anonion exchange column)을 이용하여 이당류 조성을 분석하였으며 시그마(Sigma Co.)사의 이당류 표품을 통해 동정하고 그 결과를 아래의 표 2, 표 3에 나타내었다.
상어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 이미 알려진 조성과 유사하였으 며, 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 그동안 연구가 되지 않았던 것으로 상어에 비해 △Di-0S 및 △Di-6S의 함량은 높았으며, △Di-4S 및 △Di-2,6diS는 낮게 나타났다.
그러나, 상어 연골 및 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산 모두 저분자화가 일어나면서 이당류 조성의 변화는 유사하게 나타났다. △Di-6S의 경우는 모두 변화가 거의 없어 안정적으로 나타났지만, △Di-4S 및 △Di-2,6diS는 저분자화 되면서 탈황산화(desulfation) 되어 그 함량이 낮게 나타났다. 반면에 △Di-0S는 절대적인 양의 변화는 크게 없었으나 황산화 이당류의 탈황산화가 일어나면 상대적인 함량이 증가한 것으로 나타났다.
<표 2> 상어 연골 콘드로이틴 황산의 이당류 조성 분석
상어(단위:％)
처리구 △Di-0S △Di-6S △Di-4S △Di-2,6diS
미처리 0.88 37.74 36.51 24.87
0.1M 수산화나트륨 1.47 40.43 37.39 20.70
0.1M 탄산나트륨 1.42 37.47 39.14 21.97
0.1M 인산나트륨 1.86 37.66 38.50 21.99
0.1M 염산 3.48 44.62 34.76 17.14
0.1M 말산 2.65 44.91 36.10 16.34
0.1M 구연산 3.13 40.07 37.45 19.35
0.1M 아스코르브산 3.71 41.16 35.98 19.15
△Di-0S, △UA-[β1→3]-GalNAc (비황산화 이당류); △Di-6S, △UA-[β1→3]-GalNAc(6-OSO3) (C6 위치 황산화 이당류); △Di-4S, △UA-[β1→3]-GalNAc(4-OSO3) (C4 위치 황산화 이당류); △Di-2,6diS, △UA (2-OSO3)-[β1→3]-GalNAc(6-OSO3) (C2, C6 위치 이황산화 이당류).
<표 3> 홍어 연골 콘드로이틴 황산의 이당류 조성 분석
홍어(단위:％)
처리구 △Di-0S △Di-6S △Di-4S △Di-2,6diS
미처리 5.32 69.90 16.27 8.51
0.1 M 수산화나트륨 6.25 69.26 15.93 8.56
0.1 M 탄산나트륨 6.20 69.48 15.88 8.44
0.1 M 인산나트륨 6.05 69.69 15.99 8.27
0.1 M 염산 8.28 69.64 14.61 7.47
0.1 M 말산 6.88 68.24 15.54 9.34
0.1 M 구연산 6.22 69.26 16.61 7.91
0.1 M 아스코르브산 7.80 69.66 15.20 7.34
<시험예 4> 저분자 콘드로이틴 황산 제조를 위한 조건의 설정
본 발명에서는 유기산이 다른 알칼리 및 산에 비해 안전하고 저분자화 효과도 뛰어나 유기산인 말산을 이용한 최적 저분자화 조건을 구명하였다. 특히, 말산은 원료 1kg당 단가가 280원으로 가장 저렴하여, 본 발명의 가수분해제로 선택되었다. 저분자 콘드로이틴 황산 제조 조건의 설정은 반응표면분석법을 이용하였으며, 평균분자량, 황산화도 및 수율을 종속변수로 말산의 농도 및 처리시간을 독립변수로 설정하였다.
SAS 통계프로그램의 반응표면회귀 처리(response surface regression procedure)를 사용하였으며 말산의 농도 (X1)를 1％에서 2.4％까지, 처리시간 (X2)을 32분에서 88분까지 변화시켜 이에 따른 저분자 콘드로이틴 황산의 특성을 분석하였다.
종속변수인 평균분자량(Y1), 황산화도(Y2) 및 수율(Y3) 모두 모델식의 결정계수 (R2) 값이 0.95 이상으로 높게 나타났으며, 또한 유의수준(P-value)이 0.001∼0.003으로 95％ 수준에서 유의성을 보였다. 따라서 본 실험계획의 모델이 통계적 으로 적합한 것으로 판단된다.
말산의 농도 (X1)와 처리시간 (X2)에 대한 영향을 분석해보면, 모든 종속변수에서 말산의 농도보다는 처리시간에 대한 영향을 크게 받는 것으로 나타났다. 같은 처리시간에서 농도의 변화에 따른 종속변수의 차이는 크게 나타나지 않으나 같은 농도에서 처리시간이 길어지면서 급격하게 종속변수의 차이가 보였다(도 3 참조).
도 3a는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이고, 도 3b는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 평균분자량을 나타낸 그래프이다.
도 3c는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이고, 도 3d는 홍어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 황산화도를 나타낸 그래프이다.
도 3e는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이고, 도 3f는 상어 연골로부터 말산 농도 및 처리시간에 따라 제조한 콘드로이틴 황산의 수율 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명의 제조 조건에서 제조된 상어 및 홍어 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 특성은 하기의 표 4와 같다.
<표 4> 최적조건에서 제조된 상어 및 홍어 연골 유래 저분자 콘드로이틴 황산의 특성
상어 연골 저분자 콘드로이틴 황산 홍어 연골 저분자 콘드로이틴 황산
평균분자량 (Da) 4,371∼11,218 3,299∼11,415
황산화도 (％) 87.2∼96.4 89.7∼94.2
수율 (％) 4.6∼6.8 10.0∼16.2
이당류 조성 (％) △Di-0S 3.6∼12.8 5.8∼11.8
△Di-6S 41.1∼54.8 67.4∼72.8
△Di-4S 28.4∼38.3 13.8∼19.6
△Di-2,6diS 4.7∼16.4 2.7∼6.1
<시험예 5> 저분자 콘드로이틴 황산의 구조 분석
상기 실시예 1 및 실시예 2에 기재된 방법으로 상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산의 구조를 핵자기공명법(NMR)으로 측정하고 분석하여 저분자화에 따른 구조 변화를 살펴보았다.
상어 연골 및/또는 홍어 연골로부터 콘드로이틴 황산의 구조를 핵자기공명법으로 나타낸 그래프를 도 4에 나타내었다.
도 4a는 상어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.
도 4b는 홍어 연골로부터 제조한 고분자 콘드로이틴 황산, 저분자 콘드로이틴 황산 및 표품 콘드로이틴 황산의 구조를 분석한 H1 핵자기공명법(NMR) 그래프이다.
도 4에서 (A)로 나타낸 표품(시그마사의 콘드로이틴 황산 C)과, (B)로 나타 낸 고분자 콘드로이틴 황산의 경우 표품과 유사하였으며, 특히 홍어 연골로부터 제조한 콘드로이틴 황산은 거의 표품에 가까웠다. 이러한 상어 및 홍어 연골 유래 콘드로이틴 황산의 결과의 차이는 서로 다른 이당류 조성을 가지고 있기 때문인 것으로 보인다.
도 4에서 (C)로 나타낸 저분자 콘드로이틴 황산은 폴리머 구조의 파괴 및 탈황산화에 의해 고분자보다 많은 피크들을 보이고 있으나 구조상으로 큰 변화를 나타내지는 않았다. 3.5ppm 영역에서 새로운 피크의 생성은 폴리머 구조 파괴에 의한 D-글루콘산의 잔기가 노출되어 나타나는 것이며, 4.2ppm 영역의 피크의 생성은 탈황산화된 N-아세틸-D-갈락토사민으로 인한 것으로 판단된다.
상기의 시험예의 결과에서처럼 흡수율 및 생체 이용률 측면에서 매우 효과적인 저분자 곤드로이틴 황산을 연골어류 특히, 상어 연골 및/또는 홍어 연골을 재료로 하여 효소가수분해, 산가수분해를 이용하여 제조할 수 있다.
본 발명에 의해 그 동안 미이용 자원이었던 홍어연골을 사용함으로 고부가가치 효과를 볼 수 있다.
또한 본 발명에 의해 얻을 수 있는 저분자 콘드로이틴 황산은 건강에 대한 관심의 증가와 노령화 사회로의 구조 이동과 같은 현 상황에서 관절염 관련 약품, 건강보조식품과 화장품 제품의 시장에 수출을 통한 국익 및 국민 건강에 이바지할 것으로 기대된다.

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 평균분자량이 3,000∼1,2000 Da 이고, 비황산화 이당류(△Di-0S) 5.8∼11.8％, C6 위치 황산화 이당류(△Di-6S) 67.4∼72.8％, C4 위치 황산화 이당류(△Di-4S) 13.8∼19.6％ 및 C2, C6 위치 이황산화 이당류(△Di-2,6diS) 2.7∼6.1％를 구성하고 있으며 이러한 이당류들이 임의로 배열된 구조의 홍어 연골 유래 콘드로이틴 황산.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 연골어류의 연골을 재료로 하는 콘드로이틴 황산의 제조에 있어서,
    연골어류의 연골을 분쇄하는 단계,
    분쇄된 연골에 연골 중량 대비 5∼15배의 물을 가하고 맥사자임 NNP(Maxazyme NNP), 알칼라제(Alcalase), 플라보자임(Flavourzyme), 나투자임(Natoozyme) 중에서 선택된 어느 하나의 효소를 연골 중량 대비 1.0∼2.0％ 첨가하고 1∼5시간 동안 10∼100rpm으로 교반하여 연골을 효소가수분해하는 단계,
    연골 효소가수분해물에 구연산, 아스코르브산, 아세트산 중에서 선택된 어느 하나의 유기산을 연골 중량 대비 1％∼2.5％ 첨가하고 120∼130℃, 1.0∼1.5 kg/cm2에서 30분∼100분 동안 산가수분해하는 단계,
    산가수분해물을 여과하고, 정제하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 콘드로이틴 황산의 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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