KR20080010201A - 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리된콘드로이틴황산, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 연골관절 보호용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리된 콘드로이틴황산, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 연골 관절 보호용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식품으로서의 가치가 높은 아귀 경골 및 연골을 프로테아제와 같은 분해제를 사용하여 아귀 경골 및 연골 추출물을 제조하고, 이로부터 콘드로이틴황산을 분리 및 정제함으로써, 기존의 상어 연골 유래 콘드로이틴황산과 같이 연골 관절 보호용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

콘드로이틴황산, 아귀

Description

아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리된 콘드로이틴황산, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 연골 관절 보호용 조성물{Extract of Lophiomus setigerus or chondroitin sulfate isolated, preparation method and cartilage articulation protection composition containing thereof}

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 아귀로부터 정제한 콘드로이틴황산의 ¹H-NMR의 결과를 나타낸다.

(1): GalNAc4S의 H-4 시그날

(2): GalNAc4S 및 6S의 H-1시그날

(3): GalNAc6S의 H-6 시그날

(4): GalNAc6S의 H-4 시그날

(5): GlcA의 H-2 시그날

(6): -NHCOCH₃

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제한 콘드로이틴황산 및 표준품 콘드로이틴황산을 콘드로이티나제와 반응시켜 생성된 생성물을 고속 액체 크로마토그라피(high performance liquid chromatography, HPLC)로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

a: △Di-OS: △UA-β-(1->3)-GalNAc

b: △Di-6S: △UA-β-(1->3)-GalNAc-6S

c: △Di-4S: △UA-β-(1->3)-GalNAc-4S

d: △Di-2,6 diS: △UA-2S-β-(1->3)-GalNAc-6S

e: △Di-4,6-diS: △UA-β-(1->3)-GalNAc-4,6S

이 때, △: H-4, H-5의 이중결합

UA: 우론산(uronic acid),

GalNAc: N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine)

OS: 무황산염, 2S: 2-황산염, 4S: 4-황산염, 6S: 6-황산염

도 3은 본 발명의 실시예에 따른 아귀 경골 및 연골로부터 정제한 콘드로이틴황산 및 표준품 콘드로이틴황산의 분자량을 나타낸 검량선 나타낸다.

A: 히알우론산(평균 분자량 1,690,000 Da)

B: 히알우론산(평균 분자량 130,000 Da)

C: 히알우론산(평균 분자량 100,000 Da)

D: 콘드로이틴황산(평균 분자량 40,000 Da)

E: 콘드로이틴황산(평균 분자량 15,000 Da)

F: 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제한 콘드로이틴황산

본 발명은 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리된 콘드로이틴황산, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 연골 관절 보호용 조성물에 관한 것이다.

글리코사미노글리칸(Glycosaminoglycan)은 생합성 과정에서 부분적인 변화를 통해 구조적으로 다양하고 복잡한 형태를 지니게 된다. 글리코사미노글리칸류의 기본적인 골격은 우론산(uronic acid)과 글루코사민(glucosamine)의 반복이면서 부분적으로 설페이트화가 이루어져 있는데, 이러한 복잡한 화학 구조에 의해 여러 종류의 생리 활성을 나타낼 수 있게 된다. 동물의 글리코사미노글리칸류로는 히알우론산(hyaluronic acid), 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 케라탄황산(keratan sulfate), 헤파란황산(heparan sulfate), 헤파린(heparin) 등이 알려져 있다. 이들 글리코사미노글리칸류는 주로 연결조직에 분포하며 헤파린만 예외적으로 간, 허파, 피부 점막내의 동맥에 있는 마스트(mast) 세포 내의 과립에 존재한다. 또한, 하등 동물인 연체동물에서도 글리코사미노글리칸류가 발견되고 있는데, 조개류에서 3-O-설페이트기를 가지고 있는 헤파린과 유사한 글리코사미노글리칸류의 존재가 보고되었고[Pejler 등, J. Biol. Chem. (1986) 262, 11413-11421], 해삼, 성게류에서도 설페이트기가 치환된 콘드로이틴황산류가 발견되었으며[Mourao 등, Trends in Glycobiology and Glycoscience (1995) 7, 235-246], 오징어의 각막에서도 콘드로이틴황산이 존재함이 알려졌다[Karamanos 등, Int. J. Biochem. (1991) 23, 67- 72]. 최근에는 홍어 연골[Lignot 등, J. Biotechnol. (2003) 103, 281-284] 연어 코[마쯔오등, 대한민국 공개특허 제2002-0086594호], 먹장어 연골[Nandini 등, J. Biol. Chem, (2004), 279, 50799-50809], 상어 피부[Nandini 등, J. Biol. Chem. (2005), 280, 4058-4069] 등에서 콘드로이틴황산이 발견되었다.

글리코사미노글리칸류 중에 의약품으로서 널리 사용되는 것은 헤파린으로서, 약간의 부작용이 있긴 하지만 항응고제로서 혈전 치료제, 수술후, 신장투석, 인공혈관 등에 광범위하게 사용되고 있다. 최근 들어서는 부작용을 낮춘 저분자량의 헤파린이 동일한 목적으로 사용되고 있으며, 또한 콘드로이틴황산 B인 데르마탄황산(dermatan sulfate)이 항혈전제로 임상 실험중에 있다. 히알우론산은 화장품의 첨가물로 많이 쓰이고 있다.

또한, 상기 콘드로이틴은 황산기의 위치와 우론산의 종류에 따라서 콘드로이틴황산 A, 콘드로이틴황산 B, 콘드로이틴황산 C로 크게 세 종류로 분류하고 있으며, 하기 화학식 1로 표시된다.

(상기 식에서, R², ⁴R 및 R⁶는 각각 독립적으로 H 또는 SO₃ ^-이다.)

콘드로이틴황산 A와 C는 D-글루쿠론산(D-glucronic acid)과 N-아세틸-D-갈락토사민(N-acetyl-D-galactosamine)이 1,3결합과 1,4결합이 번갈아가며 연결된 2당(糖)류의 중합체이며, 2당당(糖當) 한 개의 황산 에스테르기를 갖는다. 콘드로이틴황산 B는 D-글루쿠론산 대신에 L-이두론산을 함유하고 있으며, 이들을 β-헤파린 또는 데르마탄황산이라고도 한다. 콘드로이틴황산 A 및 C에서 황산기를 약산 처리 또는 효소 설파타아제(sulfatase)로 제거한 것을 콘드로이틴이라고 한다.

이러한 콘드로이틴황산은 상어의 척추 연골 및 소의 기관지에서 얻어지고 있다. 상기 콘드로이틴황산은 점안제, 관절염치료제로 사용되어 왔으며, 최근에는 강장 드링크류 등으로 사용되고 있다. 또한, 콘드로이틴황산은 환자에게 고통 및 행동 제한과 관절의 변형을 나타내는 질환인 골관절염(osteoarthritis)의 치료에 사용되는데, 글루코사민황산과 함께 투여시 통증을 감소시킬 뿐만 아니라 연골을 보호할 수 있다고 알려져 있다[Paroli E, Int. J. Clin. Pharmacol. Res. (1993) 13 suppl:1-9]. 실제로, 환자를 대상으로 콘드로이틴황산을 이용한 골관절염과 퇴행성 관절염의 치료에서 콘드로이틴 또는 글루코사민이 퇴행성 관절염의 진행 속도를 늦추고 환자의 고통을 감해준다는 사실이 보고된바 있다[Kelley, Altern. Med. Rev. (1998) 3, 27-39]. 이러한 결과를 바탕으로 흔히 부작용을 수반하는 비스테로이성 소염제 대신 대체 약물요법으로서 글루코사민, 콘드로이틴황산 및 글루코사민 복합체를 이용한 골관절염 치료제의 임상 3상 실험이 진행 중에 있다[미국 보건연구원 11차 대체의학 자문위원회 보고서, 9.24-25, 1998]. 관절은 연골 조직으로 구성되어 있으며 혈관이 없기 때문에 새로이 생성이 되지 않는다. 따라서 연골 조직의 주 성분인 글리코사미노글리칸류를 보충해 주어야만 한다. 투여한 콘드로이틴황산의 약 70%가 효소에 의해서 대사를 받아 N-아세틸갈락토사민, 글루쿠론산, 황산 이온으로 분해되어 흡수되는데, 이러한 과정을 거쳐 약 8%가 연골조직에 도달하는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에서 콘드로이틴황산 투여에 의한 치료 방법은 상당히 좋은 결과를 얻고 있다고 볼 수 있다. 콘드로이틴황산의 원료로서 돼지, 소, 연어 및 상어 연골이 활용되고 있다. 그러나 돼지 및 소는 빈번한 전염병으로 인하여 많은 제약이 따르고 있으며 상어는 중화요리의 식품재료 등으로 인하여 가격이 상승하고 있어 새로운 원료원의 발굴이 필요하다.

이에 본 발명자는 콘드로이틴황산을 포함하는 글리코사미노글리칸류의 원료원을 탐색하던 중, 아귀 경골 및 연골 건조물을 프로테아제 등의 분해제를 사용하여 아귀 경골 및 연골 추출물을 제조하고, 이로부터 순도 98% 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하여 그 구조를 규명하고 특성을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리 및 정제된 콘드로이틴황산을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 아귀 경골 및 연골 추출물의 제조방법 또는 이로부터 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분 리한 콘드로이틴황산을 유효성분으로 하는 연골관절 보호용 조성물을 제공하고자 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리 및 정제된 콘드로이틴황산을 제공한다.

또한, 본 발명은 아귀 경골 및 연골 추출물의 제조방법 또는 이로부터 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 유효성분으로 하는 연골관절 보호용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리 및 정제된 콘드로이틴황산을 제공한다.

아귀(Lophiomus setigerus)는 우리나라 서해 남부해, 남해, 동해남부, 일본 혹가이도 이남해역, 동중국해, 서태평양 등지에 분포하며, 2002 ~ 2005년 사이의 국내 어획량은 연간 9,000 M/T 이상을 기록하고 있다. 단백질 및 불포화지방산의 함량이 높아 성인병 예방 및 건강기능 생리효과가 높은 것으로 알려져 있으며, 칼슘이나 비타민류 등이 풍부할 뿐만 아니라 콘드로이틴황산류의 함량이 높아 점안제, 관절염 치료제, 신생혈관 성장억제제 등으로 사용될 수 있으며, 골다공증은 물 론 간기능 개선 및 갱년기장애 치료에도 매우 효과적으로 이용할 수 있다. 그러나 현재 식품 이외로는 거의 활용이 되지 않고 있다. 본 발명에서는 식용으로 사용되는 모든 아귀의 경골 및 연골 건조물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 중국산 및 북아메리카산 아귀 경골 및 연골 건조물을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물은 콘드로이틴황산이 포함될 수 있으며, 상기 콘드로이틴황산의 평균 분자량은 52,000 달톤이다.

상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 C, 콘드로이틴황산 A, 황산화 콘드로이틴 등을 포함할 수 있으며, 콘드로이틴황산 100 중량부에 대하여 콘드로이틴 19 ~ 21 중량부, 콘드로이틴황산 C 61 ~ 63 중량부, 콘드로이틴황산 A 15 ~ 17 중량부, 2,6 황산화 콘드로이틴 0.5 ~ 1 중량부, 4,6 황산화 콘드로이틴 0.1 ~ 0.3 중량부로 구성될 수 있다.

이때, 콘드로이틴은 →3)-2-N-아세틸갈락토사민(acetylgalctosamine)-β-(1→4)글루쿠론산(glucuronic acid)-β-(1→을, 콘드로이틴황산 C는 →3)-2-N-아세틸갈락토사민-6-설페이트-β-(1→4)글루쿠론산-β-(1→을, 콘드로이틴황산 A는→3)-2-N-아세틸갈락토사민-4-설페이트-β-(1→4)글루쿠론산-β-(1→을, 2,6 황산화 콘드로이틴은 →3)-2-N-아세틸갈락토사민-6-설페이트-β-(1→4)-2-설페이트글루쿠론산-β-(1→을, 4,6 황산화 콘드로이틴은 →3)-2-N-아세틸갈락토사민-4,6-설페이트-β-(1→4)글루쿠론산-β-(1→을 의미한다.

또한, 본 발명은 아귀 경골 및 연골에서 분리 및 정제한 콘드로이틴황산을 제공한다.

상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 C, 콘드로이틴황산 A, 황산화 콘드로이틴 등을 포함할 수 있으며, 콘드로이틴황산 100 중량부에 대하여 콘드로이틴 19 ~ 21 중량부, 콘드로이틴황산 C 61 ~ 63 중량부, 콘드로이틴황산 A 15 ~ 17 중량부, 2,6 황산화 콘드로이틴 0.5 ~ 1 중량부, 4,6 황산화 콘드로이틴 0.1 ~ 0.3 중량부로 구성될 수 있다.

또한, 본 발명은

(a) 아귀 경골 및 연골 건조 분말에 분해제 및 완충용액을 넣어 반응액을 제조하여 아귀 경골 및 연골을 분해하는 단계;

(b) 상기 반응액 내에 생성된 단백질 및 핵산을 침전시키고 제거하는 단계; 및

(c) 상기 단백질 및 핵산을 제거된 반응액을 재침전시킨 후 건조하는 단계를 포함하여 이루어지는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법을 제공한다.

단계 (a)에서는 아귀 경골 및 연골 건조 분말에 분해제 및 완충용액을 넣어 반응액을 제조하여 아귀 경골 및 연골을 분해할 수 있다.

상기 아귀 경골 및 연골은 식용으로 사용되는 모든 아귀 경골 및 연골 건조물을 사용할 수 있다. 아귀 경골 및 연골을 건조시켜 딱딱하게 된 조직을 분쇄기를 이용하여 잘게 부수고 체를 통과시켜 일정한 크기의 분말을 얻을 수 있다. 이렇게 얻은 아귀 경골 및 연골 분말을 건조시킨 후 pH 6.5 ~ 9.0 범위의 완충용액, 바람직하게는 0.05 N 탄산나트륨 또는 수산화나트륨 용액에서 현탁시킨다. pH를 6.5 ~ 9.0로 유지시킨 완충용액을 사용한 이유는 단백질을 제거하기 위해 사용될 수 있는 프로테아제인 알칼라제의 최적 pH이기 때문이다.

상기 분해제로는 프로테아제 또는 수산화나트륨 등을 사용할 수 있다. 프로테아제로서는 알칼라제를 사용할 수 있으며, 상기 알칼라제는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로부터 생산될 수 있고, 상기 알칼라제는 모든 종류의 단백질을 분해시킬 수 있는 프로테아제(활성도: 2.4 AU/g)이다. 이의 주효소는 섭틸리신(subtilisin) A로 엔도프로테아제의 일종이다. 최적 반응온도는 기질에 따라서 55 ~ 70 ℃이고 최적 pH는 6.5 ~ 8.5이다. 반응시간은 24 ~ 48시간 정도가 바람직하다. 이는 대부분의 단백질이 분해되도록 하기 위함이다. 알칼라제 이외에도 프로테아제로 파파인(papain) 프로테아제를 사용할 수 있으나, 경제성면에서 알칼라제가 유리하다. 이외에도 단백질 제거를 위해 수산화나트륨 용액을 사용할 수 있으나, 이 경우 강알칼리 용액이기 때문에 강염산을 이용하여 중화시켜야 한다. 그러나, 프로테아제를 사용하는 경우에는 중화시킬 필요가 없다.

다음으로, 단계 (b)에서는 상기 단계 (a)에서 반응액 내에 생성된 단백질 및 핵산을 침전시킨 후 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

프로테아제 또는 수산화나트륨으로 단백질을 분해한 후, 반응액 내에 생성된 단백질 및 핵산을 침전시키는데 용액을 사용할 수 있으며, 바람직하게 트리클로로 아세트산(trichloroacetic acid)을 사용할 수 있다. 단백질 및 핵산의 침전물은 3 ~ 5 ℃에서 보관한 후 원심분리하여 제거할 수 있다.

다음으로, 단계 (c)에서는 상기 단계 (b)에서 단백질 및 핵산을 제거한 반응액을 재침전시킨 후 건조하여 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물을 제조할 수 있다.

단백질 및 핵산이 제거된 고분자 탄수화물이 녹아 있는 반응액을 분획하기 위하여 상기 반응액을 유기용매를 넣어 후, 유기용매에 대한 용해도 차이별로 분획할 수 있다. 이때 유기용매은 상기 반응액 부피의 3 ~ 5배를 사용할 수 있다. 상기 에탄올을 넣은 반응액은 3 ~ 5 ℃에서 하룻밤 방치시킨 후 원심분리시켜 침전물을 다시 모은다. 침전물을 무수 에탄올로 씻어서 감압 하에 건조한 후 분말화 하여 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물을 얻는다.

또한, 본 발명은

(ⅰ) 아귀 경골 및 연골 추출물을 증류수에 용해한 후, 4급 암모늄염을 가하여 침전물 복합체를 생성시키는 단계; 및

(ⅱ) 상기 침전물 복합체를 강염으로 용해시키고, 에탄올로 재침전시키는 단계를 포함하여 이루어지는 아귀의 경골 및 연골 추출물로부터 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법을 제공한다.

상기 단계 (ⅰ)에서는 아귀 경골 및 연골 추출물을 증류수에 용해한 후, 4급 암모늄염을 가하여 침전물 복합체를 생성시킨다.

상기 아귀 경골 및 연골 추출물은 통상의 추출 방법 또는 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물의 제조방법에 의해 제조된 모든 아귀 경골 및 연골 추출물을 포함할 수 있다. 상기 아귀 경골 및 연골 추출물의 분말성분 중에 포함되어 있는 산성 당을 정제하기 위하여 3급 및 4급 암모늄염을 사용할 수 있다. 4급 암모늄염으로는 세틸피리디움 클로라이드(세타블론, cetylpyridinium chloride), 트리메틸아민 클로라이드(trimethylamine chloride) 등이 사용될 수 있다. 이때 4급 암모늄염을 가하면 침전물 복합체가 생성된다.

다음으로, 단계 (ⅱ)에서는 상기 단계 (ⅰ)에서 생성된 침전물 복합체를 강염으로 용해시키고, 유기용매로 재침전시켜 본 발명의 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제된 콘드로이틴황산을 얻는다.

상기 단계 (ⅱ)의 강염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화리튬 등을 사용할 수 있으며, 유기용매는 에탄올, 이소프로필알코올 등을 사용할 수 있으며, 상기 단계 (ⅰ)에서 제조된 아귀 경골 및 연골 추출물 수용액 부피의 3 ~ 5배 사용할 수 있다.

상기 알콜에 의해 재침전된 아귀 경골 및 연골 추출물 수용액은 3 ~ 5 ℃에서 방치한 후, 통상적인 방법에 의한 원심분리, 투석 또는 동결건조 등의 단계를 더 거친 후에 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물로부터 분리 및 정제된 콘드로이 틴황산로 제조할 수 있다.

상기 아귀 경골 및 연골 추출물로부터 얻어진 콘드로이틴황산의 구조는 콘드로이티나제(chondroitinase) A, B 및 C를 이용하여 규명할 수 있다. 상기 콘드로이티나제 A, B 및 C는 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) 미생물 유래의 효소로서 콘드로이틴을 분해시켜 세 종류의 콘드로이틴 불포화기를 가진 콘드로이틴 이당류를 생성한다. 이러한 콘드로이티나제 A, B 및 C를 이용하여 콘드로이틴황산의 구조적 특징을 확인할 수 있다.

콘드로이티나제 A, B 및 C를 이용하여 얻어진 이당류를 고속 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatoraphy)로 분석한 결과, 콘드로이틴황산과 비교할 때 분리 시간이 일치하였으며 또한 얻어진 이당류를 표준품과 함께 핵자기 공명(NMR)을 이용하여 분석할 때 정확히 일치함을 확인할 수 있었다. 이상의 결과로부터, 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물로부터 분리한 콘드로이틴황산이 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 C, 콘드로이틴황산 A, 2,6 황산화 콘드로이틴 및 4,6 황산화 콘드로이틴으로 구성됨을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 유효성분으로 하는 연골관절 보호용 조성물을 제공한다.

상기 콘드로이틴황산은 점안제, 관절염치료제로 사용되어 왔으며, 최근에는 강장 드링크류 등으로 사용되고 있다. 또한, 콘드로이틴황산은 환자에게 고통 및 행동 제한과 관절의 변형을 나타내는 질환인 골관절염(osteoarthritis)의 치료에 사용되는데, 글루코사민황산과 함께 투여시 통증을 감소시킬 뿐만 아니라 연골을 보호할 수 있다고 알려져 있다[Paroli E, Int. J. Clin. Pharmacol. Res. (1993) 13 suppl:1-9]. 실제로, 환자를 대상으로 콘드로이틴황산을 이용한 골관절염과 퇴행성 관절염의 치료에서 콘드로이틴 또는 글루코사민이 퇴행성 관절염의 진행 속도를 늦추고 환자의 고통을 감해준다는 사실이 보고된바 있다[Kelley, Altern. Med. Rev. (1998) 3, 27-39]. 이러한 결과를 바탕으로 흔히 부작용을 수반하는 비스테로이성 소염제 대신 대체 약물요법으로서 글루코사민, 콘드로이틴황산 및 글루코사민 복합체를 이용한 골관절염 치료제의 임상 3상 실험이 진행 중에 있다[미국 보건연구원 11차 대체의학 자문위원회 보고서, 9.24-25, 1998]. 관절은 연골 조직으로 구성되어 있으며 혈관이 없기 때문에 새로이 생성이 되지 않는다. 따라서 연골 조직의 주성분인 글리코사미노글리칸류를 보충해 주어야만 한다. 투여한 콘드로이틴황산의 약 70%가 효소에 의해서 대사를 받아 N-아세틸갈락토사민, 글루쿠론산, 황산 이온으로 분해되어 흡수되는데, 이러한 과정을 거쳐 약 8%가 연골조직에 도달하는 것으로 알려져 있다. 이러한 점에서 콘드로이틴황산 투여에 의한 치료 방법은 상당히 좋은 결과를 얻고 있다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산은 연골관절 보호용 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리 및 정제된 콘드로 이틴황산은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등에 포함할 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등을 포함할 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(marcrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지(Sevum Laurinum), 글리세로제라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물 및 이로부터 분리한 콘드로이틴황산의 유효 용량은 1,200 ㎎/day이고, 바람직하게는 800 ㎎/day이다. 또한, 투여회수는 하루 수회 투여할 수 있으며, 바람직하게는 하루 2 ~ 4 회 투여할 수 있다.

본 발명의 조성물은 연골 보호를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 연골 보호를 목적으로 건강식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 아귀 경골 및 연골 추출물 및 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 아귀 경골 및 연골 추출물 및 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 및 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 아귀 경골 및 연골 건조 엑스의 제조

시중에서 판매하는 아귀에서 경골 및 연골 부분을 분리하여 건조하고, 건조 분말 5 g에 프로테아제인 알칼라제(노보자임) 2.5 ㎖과 0.05 M 탄산나트륨 완충용액(sodium carbonate buffer, pH 7.0)을 첨가하여 최종부피를 50 ㎖로 하여 60 ℃에서 48시간 동안 150 rpm으로 교반하여 효소반응에 의해 단백질이 분해되도록 하였다. 반응액을 100 ℃에서 10분 동안 가열하여 효소활성을 제거한 후 냉각시켰다. 4 ℃, 3700 g에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 회수하였고, 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, 시그마)를 최종 5%가 되도록 첨가하여 4 ℃에서 1시간 동안 방치한 후 4 ℃, 3700 g에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 취하였다. 여기에 여액에 대해 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 4 ℃에서 12시간 방치한 후 4 ℃, 3700 g에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 얻었다. 침전물을 상온에서 건조하여 아귀 경골 및 연골 추출물을 얻었다(300.2 ㎎, 수율 6.0%).

< 실시예 2> 아귀 경골 및 연골 추출물로부터 콘드로이틴황산 의 정제 및 확인

상기 실시예 1에서 얻은 아귀 경골 및 연골 추출물을 45 ㎖의 증류수에 녹인 후, 45 ℃에서 가온하여 녹인 5 ㎖의 10% 세틸피리디니움 클로라이드 용액을 첨가하여 혼합한 후 1시간 동안 상온에서 방치하였다. 이를 다시 25 ℃, 3700 g에서 30분 동안 원심 분리하여 얻은 침전물 복합체를 45 ℃에서 가온한 10 ㎖의 2.5 N 염화나트륨 용액으로 녹이고, 다시 3배의 에탄올로 침전시켰다. 이를 25 ℃, 3700 g에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 얻은 후 다시 증류수로 녹여 투석을 시킨 다음 동결건조하여 정제된 콘드로이틴황산(141.8 ㎎, 수율 2.8%)을 얻었다.

< 실험예 1> 아귀 콘드로이틴황산 의 구조규명

1-1: 핵자기 공명(NMR) 측정

상기 실시예 1에서 정제한 콘드로이틴황산의 구조를 규명하고자 하기와 같이 NMR 측정을 하였다.

정제한 콘드로이틴황산 10 ㎎을 중수(D₂O)로 세 번 치환시키고 동결건조시킨 후 데시케이터(desiccator)내에서 오산화인(P₂O₅)과 함께 건조시킨 다음, 마지막으로 99.96%의 중수로 다시 처리하고 동결건조시킨 후 데시케이터내에서 오산화인과 함께 건조시켰다. 이를 99.96%의 중수에 녹여서 500 ㎒ 핵자기공명(NMR, Varian inc. UI 500)을 수행하고, 그 결과는 표 1 및 도 1에 나타내었다.

	D-GlcA(ppm)	D-GalNAc(ppm)
		0S	4S	6S
H-1	4.58	4.60	4.66	4.62
H-2	3.47	4.09	4.09	4.08
H-3	3.68	3.88	4.08	3.91
H-4	3.85	4.18	4.83	4.23
H-5	3.92	3.88	3.85	4.04
H-6	-	3.85	3.83	4.29
NHCOCH3	-	2.08	2.11	2.10

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 핵자기공명 후 두 개의 아노머(anomer) 수소의 케미칼 쉬프트(chemical shift)에서 GalNAc4S H1->는 4.66 ppm, GlcA H1->는 4.58 ppm으로 확인되었다.

또한, 도 1에 나타난 바와 같이, NMR 데이타에서 (1)은 GalNAc4S의 H-4 시그날이고 (2)는 GalNAc4S 및 6S의 H-1시그날이다. (3)은 GalNAc6S의 H-6 시그날이며, (4)는 GalNAc6S의 H-4 시그날이다. (5)는 GlcA의 H-2 시그날이다. 이러한 NMR 결과에서 아귀에서 분리한 화합물은 더마탄황산 (콘드로이틴황산 B)에서 흔히 나타나는 이두론산(iduronic acid)은 발견이 되지 않는 것으로 보아 순수하게 콘드로이틴황산 A 및 C로 구성되었음을 알 수 있었다. 이두론산의 H-1시그날은 4.9 ppm로서, 도 1에서는 이두론산의 시그날이 나타나지 않는다. (6)은 -NHCOCH₃기가 있음을 보여줌으로써 전형적인 콘드로이틴황산을 보여주고 있다.

아울러, 상기 실시예 2에서 정제한 글리코사미노글리칸을 표준품인 상어의 연골로부터 분리된 콘드로이틴황산 C(콘드로이틴황산 C가 70%, 이외 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 A 및 2,6 황산화 콘드로이틴이 30%, 일본생화학주식회사)와 비교하였을 때 일치하는 것으로 나타났다.

1-2: 효소분해에 의한 이당류 분석

상기 실시예 2에서 정제한 콘드로이틴황산의 이당류 분석을 위하여 하기와 같은 실험을 하였다.

상기 실시예 2에서 정제한 콘드로이틴황산을 콘드로이티나제 A, B 및 C와 반응시켜 생성된 이당류를 고속 액체 크로마토그래피로 분석하였고, 표준품 콘드로이틴황산에서 유래한 이당류의 결과와 비교하였다.

콘드로이틴황산 1 ㎎에 100 mU/100 ㎕의 콘드로이티나제 A, B 및 C 및 50 mM 트리스염산 완충용액/60 mM 초산나트륨(pH 8.0)을 가하여 전체 용액을 1 ㎖로 하여 12시간 반응시킨 후 고속 액체크로마토그래피(HPLC, Amersham Pharmacia 제품의 AKTA purifier로서 자외선 검출기가 부착된 것을 사용하였으며, 분석용 컬럼은 Thermo Hypersil-Keyston사의 Hypersil 강음이온 컬럼(5 ㎜ × 250 ㎜))를 이용하여 증류수 및 2 M 염화나트륨(pH 3.5)의 농도 구배(0 ~ 50 %)에 따라 42분 동안 흘려주면서 분석하였고, 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 나타난 바와 같이, 고속 액체클마토그래피 분석을 통해 표준품과 비교하였을 때 정확히 일치하는 a(△UA-β-(1->3)-GalNAc), b(△UA-β-(1->3)-GalNAc-6S) 및 c(△UA-β-(1->3)-GalNAc-4S)의 세 종류의 콘드로이틴황산으로부터 유래된 콘드로이틴 이당류가 생성되었음을 확인하였다. 상기 생성된 이당류는 ¹H-NMR을 행하였을 때 표준품과 함께 정확하게 일치하게 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 순도는 HPLC의 이당류 전체 면적을 합하여 98%이었다[Sim등, J. Chromatogr. B, 818 (2005) 133-139].

따라서 상기 결과를 통해 아귀 경골 및 연골로부터 분리한 콘드로이틴황산은 황산기가 없는 불포화 콘드로이틴 이당류 20.11%, 불포화 6-황산화 콘드로이틴 이당류(△UA-β-(1->3)-GalNAc-6S) 62.37%, 불포화 4-황산화 콘드로이틴 이당류(△UA-β-(1->3)-GalNAc-4S) 16.60%, 불포화 2,6-황산화 콘드로이틴(IV) 0.74%, 불포화 4,6-황산화 콘드로이틴(V) 0.18%로 구성되어 있음을 알 수 있었다.

1-3: 고속 액체크로마토그래피를 이용한 분자량 측정

상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 아귀 경골 및 연골로부터 정제한 콘드로이틴황산의 분자량을 고속 액체크로마토그래피(TSK-G6000 PWXL 컬럼 (7.8 × 300 ㎜)을 Amersham Pharmacia사 제품의 AKTA purifier 고속 액체 크로마토그라피에 설치하고, 1.0 ㎖/분의 유속으로 0.1 N 염화나트륨 용액을 흘려주면서 평형을 유지시켰으며, UV 검출기를 이용하여 206 ㎚로 측정)를 이용하여 측정하였다. 분자량 측정을 위한 표준품으로 일본 생화학주식회사의 제품인 (A) 히알우론산(평균 분자량 1,690,000 달톤), (B) 히알우론산(평균분자량 130,000 달톤, (C) 히알우론산(평균 분자량 100,000 달톤), (D) 콘드로이틴황산(평균 분자량 40,000 달톤) 및 (E) 콘드로이틴황산(평균 분자량 15,000 달톤)을 사용하였다. 시료의 주입양은 표준품과 검체 시료 모두 500 ㎍으로 하였으며, 분자량은 검량선을 이용하여 계산하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 1 및 2를 통해 제조된 아귀 경골 및 연골로부터 정제한 콘드로이틴황산의 평균 분자량이 52,000 달톤임을 확인하였다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

< 제제예 1> 약학적 제제의 제조

1-1: 산제의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2: 정제의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3: 캡슐제의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4: 주사액제의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

< 제제예 2> 식품의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

2-1: 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-2: 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-3: 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

2-4: 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-5: 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산의 건조분말(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

< 제제예 3> 음료의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

3-1: 탄산음료의 제조

설탕 5 ~ 10%, 구연산 0.05 ~ 0.3%, 카라멜 0.005 ~ 0.02%, 비타민 C 0.1 ~ 1%의 첨가물을 혼합하고, 여기에 79 ~ 94%의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85 ~ 98 ℃에서 20 ~ 180초간 살균하여 냉각수와 1 : 4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 ~ 0.82% 주입하여 본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.

3-1: 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3-2: 야채쥬스의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3-3: 과일쥬스의 제조

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명에 따른 아귀 경골 및 연골 추출물 또는 이로부터 분리한 콘드로이틴황산은 기존의 상어 연골 유래 콘드로이틴황산의 효능과 유사한 효과를 나타내어 연골 보호용 조성물에 사용될 수 있으며, 간보호작용, 지질대사, 항염증 작용에 매우 효과적으로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 콘드로이틴황산은 아귀 경골 및 연골로부터 유래한 것이기 때문에 상어 연골 유래 콘드로이틴황산보다 경제적인 이점을 가질 수 있다.

Claims (17)

1. 아귀(Lophiomus setigerus) 경골 및 연골 추출물.
2. 제1항에 있어서, 상기 아귀 경골 및 연골 추출물은 평균분자량이 52,000 달톤인 콘드로이틴황산을 포함하는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물.
3. 제2항에 있어서, 상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 C, 콘드로이틴황산 A, 2,6 황산화 콘드로이틴 및 4,6 황산화 콘드로이틴으로 구성되는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물.
4. 제3항에 있어서, 상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴황산 100 중량부에 대하여 콘드로이틴 19 ~ 21 중량부, 콘드로이틴황산 C 61 ~ 63 중량부 및 콘드로이틴황산 A 15 ~ 17 중량부, 2,4 황산화 콘드로이틴 0.5 ~ 1 중량부, 4,6 황산화 콘드로이틴 0.1 ~ 0.3 중량부로 구성되는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물.
5. 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제한 콘드로이틴황산.
6. 제5항에 있어서, 상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴, 콘드로이틴황산 C, 콘드로이틴황산 A, 2,6 황산화 콘드로이틴 및 4,6 황산화 콘드로이틴으로 구성되는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제한 콘드로이틴황산.
7. 제6항에 있어서, 상기 콘드로이틴황산은 콘드로이틴황산 100 중량부에 대하여 콘드로이틴 19 ~ 21 중량부, 콘드로이틴황산 C 61 ~ 63 중량부 및 콘드로이틴황산 A 15 ~ 17 중량부, 2,4 황산화 콘드로이틴 0.5 ~ 1 중량부, 4,6 황산화 콘드로이틴 0.1 ~ 0.3 중량부로 구성되는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골로부터 분리 및 정제한 콘드로이틴황산.
8. (a) 아귀 경골 및 연골 건조 분말에 분해제 및 완충용액을 넣어 반응액을 제조하여 아귀 경골 및 연골을 분해하는 단계;

   (b) 상기 반응액 내에 생성된 단백질 및 핵산을 침전시키고 제거하는 단계; 및

   (c) 상기 단백질 및 핵산을 제거된 반응액을 재침전시킨 후 건조하는 단계를 포함하여 이루어지는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법.
9. 제8항에 있어서, 단계 (a)의 완충용액의 pH는 6.5 ~ 9.0인 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법.
10. 제8항에 있어서, 단계 (a)의 완충용액은 0.05 N 탄산나트륨인 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법.
11. 제8항에 있어서, 단계 (a)의 분해제가 섭틸리신(subtilisin)과 같은 알칼라제인 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법.
12. 제8항에 있어서, 단계 (b)에서 단백질 및 핵산을 침전시키기 위해 트리클로로아세트산을 사용하는 것을 특징으로 하는 아귀 경골 및 연골 추출물 제조방법.
13. (ⅰ) 아귀 경골 및 연골 추출물을 증류수에 용해한 후, 4급 암모늄염을 가하 여 침전물 복합체를 생성하는 단계; 및

    (ⅱ) 상기 침전물 복합체를 강염으로 용해시키고, 유기용매로 재침전시키는 단계를 포함하여 이루어지는 아귀 경골 및 연골로부터 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 단계 (ⅰ)의 4급 암모늄염은 세틸피리디움클로라이드(cetylpyridium chloride) 또는 트리메틸아민클로라이드(trimethylamine chloride)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1종 이상인 것을 특징으로 하는 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법.
15. 제11항에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)의 강염은 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘및 염화리튬으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상이고, 상기 유기용매는 에탄올 및 이소프로필알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 콘드로이틴황산을 분리 및 정제하는 방법.
16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 아귀 경골 및 연골 추출물을 유효성분으로 하는 연골관절 보호용 조성물.
17. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 아귀 경골 및 연골로부터 분리한 콘드로이틴황산을 유효성분으로 하는 연골관절 보호용 조성물.

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