KR100906559B1

KR100906559B1 - 콘도로이틴 황산 올리고당의 제조

Info

Publication number: KR100906559B1
Application number: KR1020070085886A
Authority: KR
Inventors: 조석형; 환 용 강
Original assignee: 한국농축산영농조합; 조석형
Priority date: 2007-08-27
Filing date: 2007-08-27
Publication date: 2009-07-07
Also published as: KR20070092941A

Abstract

콘드로이틴 황산은 상어를 비롯한 각종 동물의 연골 조직에 다량 함유되어 있는 점질다당류로, 관절염 예방 및 치료, 각막 보호, 피부 노화 억제 및 항종양 등 다양한 생리활성을 가진다. 이러한 생리활성으로 인해 콘드로이틴 황산은 고부가치의 기능성 소재로서 기능성 식품뿐만 아니라 화장품 및 의약품 소재 등으로 이용되고 있다.

본 발명은 동물 연골 조직으로부터 고순도의 콘드로이틴 황산을 고순도로 추출하는 단계화 추출한 콘도로이틴 황산을 효소 분해하여 콘도로이틴 황산 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의해서 발명된 콘도로이틴 황산 올리고당은 관절염 치료제 등으로 사용할 수 있는 항원성이 낮고 안전성이 높은 의약품으로서의 이용이 기대되고 화장품 등으로의 사용도 기대된다. 또한, 콘도로이틴 황산 올리고당은 물질의 효능을 적은 양으로도 획기적으로 증대시킴으로써 의약 및 식품 분야에 확대 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

콘도로리틴 황산, 단백질분해효소, 콘드로이틴 황산 올리고당, 관절염

Description

콘도로이틴 황산 올리고당의 제조{preparation of chondroitin sulfate oligosaccharide}

본 발명은 동물 연골 조직으로부터 고순도의 콘드로이틴 황산을 고순도로 추출하는 단계화 추출한 콘도로이틴 황산을 효소 분해하여 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

콘드로이틴 황산을 얻기 위해, 팔쇼 등(Falshaw, R. et al., Carbohydrate polymers, 41, 357-364 (2000))은 오징어 껍질 및 연골 조직으로부터 음이온 교환 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피 등을 수행하여 콘드로이틴 황산을 분리한 바 있는데, 이 방법으로 고순도의 콘드로이틴 황산이 얻어지나, 고가의 장치를 사용하고 처리량도 제한적이어서 산업에 적용하기에는 적합하지 않은 단점이 있 다. 미국 특허 제4,302,577호에는 소의 기관 연골을 산과 알칼리 용액 중에서 효소 분해한 후 세틸 피리디니움 클로라이드(CPC) 또는 n-알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드를 가하여 콘드로이틴 황산과의 복합체를 형성시킨 다음 알칼리 조건하에서 복합체를 재분리하고 중화시키는 일련의 과정을 통해 콘드로이틴 황산을 분리하는 방법이 기재되어있으나, 이 방법은 그 과정이 복잡하고 장시간이 소요될 뿐만 아니라 CPC와 n-알킬 디메틸 벤질 암모늄 클로라이드와 같은 유독 물질을 사용함으로써 산업에 적용하기에는 적합하지 않다. 대한민국 특허공고 제167831호, 제0416884호에는 해삼을 알칼라제로 가수분해한 후 이 가수분해물을 알콜로 분별 침전시켜 콘드로이틴 황산을 분리하는 방법이 기재되어 있는데, 이 방법은 비교적 간단한 공정을 사용하여 일정 수준의 콘드로이틴 황산을 얻는 장점이 있다. 그러나 이 방법으로 실시할 경우 알콜 등의 유기용매를 사용하기 때문에 폐수처리문제, 비용이 높아진다는 단점이 있다.

한편, 황산 콘도로이틴과 같은 다당류는 고분자량으로 섭취할 경우 인체내에 분해효소가 존재하지 않기 때문에 흡수되기가 어렵고 기능성이 떨어지는 단점이 있어서 올리고당화 하지 않으면 안된다.

본 발명은 동물의 연골조직을 단백질 분해효소로 연골조직에 포함된 단백질을 분해하는 단계와 분해된 저분자 단백질과 콘도로이틴 황산을 분리하기 위하여 한외여과막을 이용하여 저분자 단백질을 제거하여 고순도의 콘도로이틴 황산을 제조하는 단계 및 분리된 콘도로이틴 황산을 효소 분해하여 콘도로이틴 황산 올리고 당을 제조하는 단계로 이루어진 콘도로이틴 황산 올리고당을 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 동물 연골 조직으로부터 고순도의 콘드로이틴 황산을 고순도로 추출하는 단계와 추출한 콘도로이틴 황산을 효소 분해하여 올리고당을 제조하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

먼저, 동물의 연골 조직을 단백질 분해효소로 가수분해한다. 동물의 연골 조직으로는 상어, 가오리 등의 연골 어류와 소, 돼지 등의 포유 동물의 연골 조직이 바람직하며, 이 중 상어 연골 조직이 더욱 바람직하다. 구체적인 단백질 분해 효소로는 키모트립신(Chymotrypsins), 서브틸리신(subtilisins) 등의 세린 단백질 분해 효소(EC 3.4.21); 시스테인 단백질 분해 효소(EC 3.4.22); 아스파틱 단백질 분해 효소(EC 3.4.23); 및 메탈로 단백질 분해효소(EC 3.4.24); 또는 이들의 혼합물 등이 있으며, 바람직하게는 노보(Novo)사에 의해 시판되는, 바실러스 리첸니. 포르미스( Bacillus licheniformis )로부터 생산되고 서브틸리신 A를 주성분으로 함유하는 알칼라제(Alcalase TM )가 있다. 이 가수분해 반응에서 엔도프로타제는 동물 연골 조직 건조 중량에 대해 0.5 내지 2중량%의 양으로 사용하는 것이 바람직하며, 1.5 내지 2중량%의 양으로 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 반응 온도는 55 내지 60℃가 바람직하다. 이 반응물을 80 내지 100℃에서 5 내지 10 분 동안 가열하여 단백질분해효소를 불활성화시킨 후 실온까지 냉각한 다음, 먼저 한외여과막(분획분 자량 5만 또는 2만Da 이하)을 사용하여 단백질 분해물인 저분자 펩타이드를 제거함과 동시에 콘도로인틴 황산을 농축하였을 때 갈람보스법(Galambos JT 1967 The reaction of carbazole with carbohydrates1. Efect of borate and sulfamate on the carbazole color of sugars Anal. Biochem. 19:119-132)으로 정량한 결과 콘도로이틴 황산 함량 98%이상의 고순도 콘도로이틴을 얻었다. 이렇게 얻어진 순수한 콘도로이틴 황산 용액에 콘도로이틴아제 A B C(Proteus vulgaris유래;CS, DS, HA)을 사용하여 pH를 5부근으로 조절하고 37-40℃에서 24 내지 36시간 반응시켜 콘도로이틴황산 올리고당을 제조하였다.

사용한 한외여과 막은 반응액에 포함되어진 콘도로이틴 황산의 분자량을 고려하여 선택하면 이상적이고 상어연골에 함유된 콘도로이틴황산의 경우에 분자량이 5만이상(약 3만-30만)이기 때문에 분획분자량 2만 내지 5만의 한외여과막을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용한 콘도로이틴 황산 분해효소는 콘돌로이틴 황산에서 작용해서 불포화형 8당 또는 10당을 생성하는 것으로 pH 5에서는 주로 포화형 8당의 콘도로이틴 황산을 생산한다.

상세하게 실시예를 들어 설명하면 다음과 같다.

실시예 1 (전처리)

상어연골을 파쇠하여 1-5mm정도로 한 다음 칼슘을 제거허기 위하여 1N 염산용액에 2시간 침적시켜 반응시켰다. 이 반응 상어연골을 중성이 될 때까지 세적하여 사용하였다.

실시예 2 (단백질 분해)

전처리한 사어연골을 10kg을 90kg의 물에 분산시키고 중성인 상태에서 단백질 분해효소인 알칼라제를 총량에 대하여 1% 투여하고 60℃에서 24시간 반응시키고 85℃로 10분간 처리하여 효소를 실활시키고 여과처리하여 80kg의 용액을 얻었다.

실시예 3 (한외여과처리)

한외여과 처리하기 위하여 한외여과막(분획분자량 2만 이하)을 장착한 한외여과장치에 상기의 단백질 분해효소 처리액을 평균 2-3kg/㎠의 압력으로 처리하여 10ℓ/분으로 처리이송하여 단백질분해물을 분리하였다. 분리한 용액의 콘도로이틴 함량을 갈밤보스법으로 측정한 결과 순도는 콘드로이틴 함량이 98%이고 농축된 용액의 양은 43ℓ(콘도로이틴 중량%=19%)을 얻었다. 그리고 콘드로이틴 황산의 분자량은 평균 170,000 Da이었다.

실시예 4(콘드로이틴 황산의 분해)

실시예 3에서 얻어진 순수한 콘드로이틴 황산 용액을 그대로 사용하여 콘드로이틴 황산올리고당을 제조하였다. 콘드로이틴황산 용액 5L(고형분함량 19%)을 삼구플라스크에 넣고 젓산을 이용하여 pH를 5부근으로 조정한 다음 콘도로이틴아제 A B C(Proteus vulgaris유래;CS, DS, HA)를 0.1% 첨가하고 37℃에서 24시간 반응시켜 콘도로이틴황산 올리고당을 얻었다.

실시예 5(콘도로이틴황산 올리고당의 분석)

반응하여 얻은 콘도로이틴황산 올리고당 환원말단을 2-aminopyridine으로 발색시키고 겔투과크로마토그래피를 행하였다. 크로마토그래피는 실온에서 행하였고 이동상 은 0.02M 초산암모늄 완충용액(pH 7.5)를사용하였으며 유속은 0.5㎖/min으로 행하였다. 또한 검출기는 형광검출기로 행하였으며 중합도는 표 1과 같다 표1에서 보는 바와 같이 생성된 콘도로이틴 올리고당의 중합도는 12-8당이었다.

중합도(DP)	함량(%)
8	48
10	20
12	32

상기에서와 같이 생성된 올리고당은 엔도형임을 확인할 수 있었다.

본 발명에 의해서 제조된 콘도로이틴 황산 올리고당은 관절염 치료제 등으로 사용할 수 있는 항원성이 낮고 안전성이 높은 의약품으로서의 이용이 기대되고 화장품 등으로의 사용도 기대된다. 또한 콘도로이틴 황산 올리고당은 물질의 효능을 적은 양으로도 획기적으로 증대시킴으로써 의약 및 식품 분야에 확대 적용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims

상어 연골조직에 포함된 단백질을 단백질 분해효소에 의하여 분해하는 단계와 한외여과막을 이용하여 저분자 단백질을 제거하여 순수한 콘도로이틴 황산을 분리하는 단계 및 분리된 콘도로이틴 황산을 효소분해하여 콘도로이틴 황산올리고당을 제조하는 단계로 이루어진 것에 있어서,

상기 효소분해는 분획분자량 2만의 한외여과막이 장착된 한외여과장치에서 2 ~ 3kg/㎠의 압력으로 10ℓ/분으로 처리하여 단백질을 분리한 콘드로이틴 함량이 98%인 콘드로이틴 황산을 젓산을 이용하여 pH5로 조절한 후, 여기에 효소를 첨가하여 7 ~ 40℃에서 24 내지 36시간 동안 반응시켜 이루어짐을 특징으로 하는 황산 콘도로이틴 올리고당 제조 방법.
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