KR20170073709A

KR20170073709A - 콜라겐 스펀지

Info

Publication number: KR20170073709A
Application number: KR1020177016143A
Authority: KR
Inventors: 코르넬 임호프; 로타르 슐뢰써; 니클라우스 슈티펠; 마르틴 뷔슈트
Original assignee: 가이스틀리히 파마 아게
Priority date: 2014-12-15
Filing date: 2015-12-15
Publication date: 2017-06-28
Also published as: CA2970849A1; US20160166737A1; CN106999632A; BR112017011140B1; HUE031528T2; BR112017011140A2; HK1221668A1; PT3055000T; CA2970849C; WO2016096831A1; IL252909A0; USRE48536E1; DK3055000T3; MX368544B; JP6328861B2; IL252909B; MX2017007810A; RU2672593C1; TW201627015A; AU2015367710A1

Abstract

본 발명은 하기에 관한 것이다:
- 입 부위에서의 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한, 수은 압입법에 의해 50 내지 90 ㎛ 의 중간 기공 직경을 갖는 상호연결 기공 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 80% 이상 다공도; 45 내지 57℃ 의 개시 온도 및 50 내지 65 mg/cm³ 의 건조 상태에서의 밀도를 나타내는, 60-96% (w/w) 콜라겐 및 4-40% (w/w) 엘라스틴을 포함하는 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지,
- 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 제조 방법, 및
- 연조직 부피 증가를 위해 구강에서의 이식물로서 사용하기 위한, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.

Description

콜라겐 스펀지 {COLLAGEN SPONGE}

본 발명은 입 부위에서의 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 신규한 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지, 상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 제조 방법 및 연조직 부피 증가를 위한 구강에서의 이식물로서의 이의 용도에 관한 것이다.

연조직 부피 증가는 치과 및 두과안면 수술에 있어서 주요 과제 중 하나가 되고 있다. 연조직 부피 증가에 의해 기능적이고 심미적인 결과 모두를 개선시키기 위해, 자가 조직 이식 예컨대 유리 치은 이식 (FGG) 또는 상피하 결합조직 이식 (SCTG) 이 그의 결점에도 불구하고 여전히 다양한 징후에 광범위하게 사용되며 최적 표준으로 고려된다 (F. Cairo et al., 2008, J. Clin. Periodontol. 35 (Suppl. 8), 314-319; R. Jung et al., 2004, Int. J. Periodontics Restorative Dent. 24(6), 545-553 및 D. Thoma, 2009, Clin. Oral Implants Res. 20 (suppl. 4), 146-165). 그러나, 통상 구개에서 2 차 수술 부위에서의 자가 조직에 대한 채취 절차는 환자에 대한 결점 및 회수할 수 있는 조직의 질 및 수량에 관한 제한을 갖는다.

따라서, 입 부위에서의 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 재생 장치가 필요하다.

구강 결합 조직의 치은 세포는 저작, 삼킴, 혀 움직임, 구변, 치아 움직임 및 치과교정 치료 동안 복잡한 기계적 힘에 노출된다. 특히 수술 절차 후 상처 치유 동안, 내부적 및 외부적 힘이 발생하여, 재생 장치 및 새로이 형성된 조직에 대한 압력을 발생시킬 수 있다.

재생 장치는 연조직 부피 증가를 위해 구강에서 사용되기 전에 특정 기준을 충족시켜야 한다: 이는 생체적합성, 생체내 재흡수성이어야 하고, 치은 내증식이 가능하게 해야 하고, 평탄한 치유 (과다한 염증이나 열개 없이) 가 가능하도록 양호한 수준의 조직 통합을 보여야 하고, 이식 후 상처 치유 과정 동안의 충분한 시간 동안, 일반적으로 약 3 개월 이상, 조직 부피를 유지시키는 스캐폴드로서 작용함으로써 기계적 힘에 견뎌낼 수 있어야 한다.

이러한 재생 장치는 지금까지 선행 기술 분야에서 개시되지 않았다.

H. Mathes et al., "A Bioreactor Test System to mimic the Biological and Mechanical Environment of Oral Soft Tissues and to Evaluate Substitutes for Connective Tissue Gafts", 2010, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 9999, No. 9999 에서는, 콜라겐 스펀지로 이루어지는 재생 장치의 이러한 특성이 콜라겐 섬유를 기계적 안정성 (높은 정도의 가교) 과 평탄한 연조직 치유 (낮은 정도의 가교) 사이의 올바른 균형이 가능하게 하는 정도로 가교함으로써 매트릭스 바디를 경직화시켜 달성될 수 있다는 것을 개시하고 있으나, 이러한 콜라겐 스펀지를 어떻게 제조하는데 있어서는 전혀 언급하지 않고 있다. 이들은 3 가지 상이한 콜라겐 스펀지 원형이 92 ㎛ 의 평균 기공 직경 및 93% 다공도를 갖는 돼지 콜라겐 I 형 및 III 형으로 이루어지며 그의 가교도가 상이하다는 것을 개시하고 있으며 (Geistlich Pharma, Wolhusen, Switzerland 에 의해 원형이 제공됨), 이는 14 일 동안 기계적 자극 하 배양한 후 양호한 섬유아세포 세포 생존성으로 만족스러운 부피 유지를 나타내었다.

DS Thoma et al., "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes: a volumetric analysis", 2010, J. of Clin. Periodontology 37, 659-666, and "Soft tissue volume augmentation by the use of collagen-based matrixes in a dog mandible - a histological analysis", 2011, J. Clin. Periodontol.: 38:1063-1070 은, H. Mathes et al. 의 상기 발행물에 나타낸 콜라겐 스펀지 원형 중 하나가 개 하악골의 만성 능선 (ridge) 결함 내로 이식하고 28 일 또는 84 일 기간 후, 최적 표준, SCTG (상피하 결합 조직 이식) 와 동일한 부피 유지를 나타내었다는 것을 개시하고 있다.

선행 기술은 이러한 화학적 가교 콜라겐 스펀지 원형, 또는 연조직 부피 증가용으로 구강에서 사용하기 위해 상기 나타낸 기준을 충족하는 임의 다른 재생 콜라겐 장치의 특성이 무엇인지, 또는 이러한 장치가 어떻게 제조될 수 있는지를 개시하거나 제안하지 않고 있다.

EP-1561480 은 10 ㎛ 미만의 다수 기공을 갖는 화학적 가교 콜라겐 시트를 포함하는, 뇌막 조직 성장을 위한 경막 대체물로서 사용하기 위한 재흡수성 콜라겐 장치, 및 혼합물이 실질적으로 가용화된 콜라겐을 함유하는 조건 하에 콜라겐과 혼합물을 혼합하고, 혼합물을 콜라겐 장치 내로 동결건조시키고, 가교제로서 포름알데히드 또는 글루타르알데히드를 사용하여 콜라겐 장치를 화학적으로 가교하는 단계를 포함하는, 콜라겐 장치 제조 방법을 개시하고 있다. 경막 대체물은, 입 부위에서 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 재생 장치와 같이, 상처 치유 동안 상기 언급한 복합적인 기계적 힘에 의해 생성된 압력에 노출되지 않는다.

US-2004-0265785 는 먼저, 천연 기원의 콜라겐 물질을 함유하는 엘라스틴으로부터 소수성 수반 물질을 화학적으로 제거한 후, 비-소수성 물질을 화학적으로 제거하는 단계를 포함하는, 20% (w/w) 이상의 엘라스틴을 함유하는 콜라겐-엘라스틴 멤브레인 제조 방법을 기재하고 있다. 콜라겐-엘라스틴 생성물은 화학적으로 가교되지 않는다.

Boekema B.K.L.H. et al., 2014, Journal of Material Sciences: Materials in Medicine, February 2014 25: 423-433 은, 상처 치유에 대한 기공 크기의 효과 및 진피 대체물로서 사용된 콜라겐-엘라스틴 스캐폴드 상의 가교를 기재하고 있다. 개시된 EDC-NHS 화학적 가교 스캐폴드는 10-15% 엘라스틴을 함유하고, 기공 크기가 80 내지 120 ㎛ 이고, 변성 온도가 64 내지 69℃ 이다 (표 1, 425 페이지 참조). 이들은 에틸렌 산화물 기체 처리에 의해 멸균된다. 저자는, 특히 섬유아세포의 증식 및 진피 대체물을 새로운 조직으로 대체하는 능력을 감소시킴으로써 가교가 여러 중요한 매개변수에서 상처 치유에 부정적으로 영향을 준다고 결론내고 있다. 진피 대체물은, 입 부위에서 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 재생 장치와 같이, 상처 치유 동안 상기 언급한 복합적인 기계적 힘에 의해 생성된 압력에 노출되지 않는다.

본 발명의 과제 또는 목표는, 생체적합성, 생체내 재흡수성이며, 치은 내증식이 가능하게 하고, 평탄한 치유 (과다한 염증이나 열개 없이) 가 가능하도록 양호한 수준의 조직 통합을 보이고, 이식 후 상처 치유 과정 동안의 충분한 시간 동안, 일반적으로 약 3 개월 이상, 조직 부피를 유지시키는 스캐폴드로서 작용함으로써 기계적 힘에 견뎌낼 수 있는, 입 부위에서의 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 재생 콜라겐 장치를 발견하는 것이다.

상기 과제는 첨부된 특허청구범위에서 정의한 바와 같이 본 발명에 의해 해결된다.

본 발명은 60-96% (w/w) 콜라겐 및 4-40% (w/w) 엘라스틴을 포함하는, 입 부위에서 연조직 부피 증가를 촉진하기 위한 탄력있는 재흡수성의 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 관한 것이며, 이는 수은 압입법에 의해 50 내지 90 ㎛ 의 중간 기공 직경을 갖는 상호연결 기공 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 80% 이상 다공도, 45 내지 57℃ 의 개시 온도 및 50 내지 65 mg/cm³ 의 건조 상태에서의 밀도를 나타낸다.

화학적 가교 콜라겐 스펀지는 60-96% (w/w) 콜라겐 및 4-40% (w/w) 엘라스틴을 포함한다. 엘라스틴 함량은 가수분해 및 RP-HPLC 를 포함하는 공지된 방법의 변형에 따라 데스모신/이소데스모신 측정에 의해 측정된다 (예를 들어, Guida E. et al. 1990 Development and validation of a high performance chromatography method for the determination of desmosines in tissues in Journal of Chromatography or Rodriguqe P 2008 Quantification of Mouse Lung Elastin During Prenatal Development in The Open Respiratory Medicine Journal 참조). 건조 엘라스틴의 데스모신/이소데스모신 함량을 측정하기 위해, 스펀지의 엘라스틴을 [Starcher and Galione 1976 Purification and Comparison of Elastin from Different Animal Species in Analytical Biochemistry] 에 기재된 바와 같은 엘라스틴 단리 절차로 처리한다.

상기 스펀지는 적합하게는 이러한 비율의 콜라겐 및 엘라스틴을 함유하는 천연 기원의 조직에서 유도된다. 이러한 조직의 예는 포유류 (예를 들어 돼지 또는 소) 복막 또는 심막 멤브레인, 태반 멤브레인, 소장 점막하조직 (SIS) 및 진피를 포함한다. 통상 콜라겐은 주로 콜라겐 I 형, 콜라겐 III 형 또는 이의 혼합물이다. 콜라겐은 또한 특히 콜라겐 II 형, IV 형, VI 형 또는 VIII 형 또는 이들 또는 임의 콜라겐 유형의 임의 조합의 부분을 포함할 수 있다.

본원에서 사용한 용어 "콜라겐" 은 통상 60-96% (w/w) 콜라겐 및 4-40% (w/w) 엘라스틴의 조합을 나타낸다.

바람직하게는 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 70-90% (w/w) 콜라겐 및 10-30% (w/w) 엘라스틴을 포함한다.

이러한 화학적 가교 콜라겐 스펀지를 제조하기 위한 적합한 출발 물질의 예는 EP-B1-1676592 의 "실시예" 에서 기재된 바와 유사한 방법에 의해 돼지 또는 소 복막으로부터 제조된 멤브레인으로부터의, 또는 매우 유사한 방법에 의해 돼지 복막으로부터 제조된 멤브레인 Geistlich Bio-Gide® (Geistlich Pharma A.G., Switzerland 에서 입수가능) 으로부터의 콜라겐 섬유 슬러리 및/또는 WO 2012/084214 의 실시예 7 에서 기재된 바와 유사한 방법에 의해 돼지 진피로부터 제조된 콜라겐 섬유 슬러리이다.

상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지는, 기계적 응력의 하중 및 하중제거 후 부피를 유지하면서 치은 세포의 내증식을 양성함으로써 입 부위에서의 연조직 증가를 촉진한다.

치은 세포의 내증식을 양성하기 위해 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 치은 섬유아세포가 성장하게 하는 적절한 직경 범위로 높은 다공도 (기공 부피 분율) 를 가져야만 한다. 스펀지가 수은 압입법에 의해 50 내지 90 ㎛ 의 중간 기공 직경을 갖는 상호연결 기공 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 다공도를 나타내는 경우, 이러한 내증식이 적합하게 양성된다는 것이 발견되었다. 이러한 기공 분포를 갖는 화학적 가교 스펀지는 적합하게는, 상기 단락에서 기재된 바와 같은 돼지 또는 소 복막으로부터 제조된 멤브레인으로부터의 콜라겐 섬유 슬러리 및 상기 단락에서 기재된 바와 같은 돼지 진피로부터 제조된 콜라겐 섬유 슬러리를 적절한 비율로 가교 전 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 제조된다.

본원에서 용어 "탄력있는" 은 화학적 가교 콜라겐 스펀지가 압력에 저항성이 있다는 것, 즉 시험관내 또는 생체내 압력에 가해진 후 이의 본래 부피의 상당 부분이 회복될 수 있다는 것을 의미한다.

입 부위에서의 부피를 유지하기 위해, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 스펀지는 이식 후 치유 과정 동안의 충분한 시간 동안, 일반적으로 약 3 개월, 조직 부피를 유지시키는 스캐폴드로서 작용함으로써 저작, 혀 움직임, 구변 및 치아 움직임에 의해 유도된 복합적인 기계적 힘에 견딜 수 있어야만 한다. 이러한 이식물의 생체내 탄력 거동이, 체액을 모방하도록 설계된 인산완충식염수 (PBS) 용액에 의해 습윤된 콜라겐 스펀지의 온도 37℃ 에서의 반복 압축의 시험관내 기계적 시험에서, 초기 두께에 대한 두께 유지가 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상이거나, 첫 번째 하중에 대한 이력 (hysteresis) 유지가 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후 55% 미만, 바람직하게는 45% 미만인 경우에 획득된다는 것이 발견되었다.

과다한 염증 또는 열개가 없는 생체내 치유와 조합된 상기의 70% 이상의 시험관내 두께 유지 및 55% 미만의 이력 유지가, 스펀지가 45 내지 57℃ 의 개시 온도 및 50 내지 65 mg/cm³ 의 건조 상태에서의 밀도를 나타내는 경우에 획득된다는 것이 발견되었다.

개시 온도는 US 약전 표준: Ph. Eur. 2.2.34, USP <891> (1 리터의 물: 8 g 염화나트륨, 0.2 g 인산칼륨, 1.15 g 인산나트륨 및 0.2 g 염화칼륨에 대한 완충제 조성; 시작 온도 15℃, 종료 온도 90℃, 가열 속도 5℃/분) 에 따라 완충액으로 습윤된 콜라겐 스펀지에서의 DSC 에 의해 측정된다. 이러한 매개변수는 스펀지의 가교도를 반영한다. 개시 온도는 반복 압축에 대한 스펀지 시험관내 저항성 (반복 압축의 기계적 시험에서의 두께 유지 또는 이력 유지), 생체내 탄력성 (resilience) (이식 후 치유 과정 동안의 충분한 시간 동안 조직 부피의 유지) 및 주변 조직 내로의 양호한 통합 (과다한 염증 또는 열개 없음) 과 밀접히 연관된다.

요구되는, 과다한 염증 또는 열개가 없는 생체내 치유와 조합된 생체내 탄력성 및 반복 압축에 대한 시험관내 저항성은, 개시 온도가 45 내지 57℃, 바람직하게는 46 내지 53℃ 인 경우에 획득될 수 있다. 개시 온도가 46℃ 미만인 경우, 반복 압축에 대한 시험관내 저항성 및 생체내 탄력성은 충분하지 않을 수 있다. 개시 온도가 57℃ 초과인 경우, 이식 후 나타나는 과다한 염증 및/또는 열개와 같은 이상 반응의 실질적 위험이 존재한다.

광범위한 동결건조 후 콜라겐 스펀지 부피의 칭량 및 측정에 의해 측정된, 건조 상태에서의 밀도 (하기 상세히 기재하는 바와 같음) 는 요구되는, 과다한 염증 또는 열개가 없는 생체내 치유와 조합된 생체내 탄력성 및 반복 압축에 대한 시험관내 저항성에 도달하기 위한 또 다른 필수적이거나 중요한 매개변수이다. 이러한 특성은 건조 상태에서의 밀도가 50 내지 65, 바람직하게는 50 내지 60 mg/cm³ 인 경우 획득될 수 있다. 건조 상태에서의 밀도가 50 mg/cm³ 미만인 경우, 반복 압축에 대한 시험관내 저항성 및 생체내 탄력성은 충분하지 않을 수 있다. 건조 상태에서의 밀도가 65 mg/cm³ 초과인 경우, 이식 후 나타나는 과다한 염증 및/또는 열개와 같은 이상 반응의 위험성이 존재한다.

본원에서 용어 "재흡수성" 은 화학적 가교 콜라겐 스펀지가 콜라게나아제 및 엘라스타아제의 작용을 통해 특히 생체내 흡수될 수 있다는 것을 의미한다. 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 제어된 생체내 재흡수성은 과다한 염증 또는 열개가 없는 치유에 필수적이다. 하기 상세히 기재된 클로스트리듐 히스토리쿰 (Clostridium histolicum) 으로부터의 콜라게나아제를 사용하는 효소 분해 시험은 생체내 재흡수성의 우수한 예측을 제공한다.

이 시험에서, 과다한 염증 또는 열개와 같은 이상 반응이 없는 흥미로운 부피 유지 및 치유가 생체내 나타난 본 발명에 따른 멸균의 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 모든 샘플에 대해, 콜라겐은 3 내지 5 시간 내에 완전히 분해되었다.

상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 동결 건조 및 화학적 가교를 포함하는 방법에 의해 천연 기원의 조직으로부터 적합하게 제조된다. 천연 기원의 적절한 조직은 돼지 또는 소 복막 또는 심막 멤브레인, 돼지 또는 소 태반 멤브레인 및 돼지 또는 소 SIS 또는 진피를 포함한다. 바람직하게는 천연 기원의 조직은 돼지 또는 소 복막 멤브레인 및 돼지 진피를 포함한다. 동결 건조 및 화학적 가교를 포함하는 상기 방법에는 일반적으로 멸균 단계가 뒤이어지는데, 이는 적합하게는 γ 조사 또는 X-선 멸균이다.

화학적 가교는, 요구되는, 반복 압축 시험에서 첫 번째 하중에 대한 이력 유지 또는 초기 두께에 대한 두께 유지를 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용가능한 가교제를 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 이러한 가교제는 글루타르알데히드, 포름알데히드, 아세트알데히드, 1,4-부탄 디글리시딜 에테르 (BDDGE), N-술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (HMDC), 시안아미드, 디페닐포스포릴아지드, 제니핀, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 및 EDC 와 NHS (N-히드록시숙신이미드) 의 혼합물을 포함한다. 소량 또는 미량의 미반응 가교제 또는 전형적인 이의 직접 반응 생성물이 통상 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지에서 검출될 수 있다.

바람직하게는 화학적 가교는, 글루타르알데히드, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 및 EDC 와 NHS (N-히드록시숙신이미드) 의 혼합물에서 선택되는 가교제를 사용하여 수행된다. 본 발명에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 흥미로운 원형은 실제로, 이들 가교제 각각을 사용하여 제조된다.

콜라겐 스펀지의 1000 개 초과의 상이한 원형은 가교제로서 EDC 또는 EDC 와 NHS 의 혼합물을 사용하여 제조되며 다양한 시험관내 시험 및/또는 생체내 동물 시험 (특히 마우스, 랫트, 토끼 및 개에서의) 에서 시험된다. 바람직하게는 화학적 가교는 이들 2 개 가교제 중 하나를 사용하여 수행된다.

본 발명의 탄력있는 재흡수성 콜라겐 스펀지는 특히 하기에서 시험된다:

- 최적 표준 SCTG (상피하 결합조직 이식) 와 비교하여 개 하악골의 만성 결함 내로의 이식에 의한 점막 부피 증가의 측정을 포함하는 동물 연구, 및

- 연조직 부피 증가에 대한 최적 표준 SCTG (상피하 결합조직 이식) 와 비교하여 구강에서의 치아 이식물 주변의 점막 두께를 늘리기 위한 조직 증가 절차에서의 그의 성능 및 안전성을 조사하기 위한 임상 시험.

이들 연구 모두에서 본 발명의 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 3 개월 이식 후 과다한 염증 또는 열개 없이 주변 조직 내로의 우수한 통합, SCTG 와 동일한 안전성 및 동일한 (즉, 통계학적으로 상이하지 않은) 연조직 부피 유지를 나타내었다.

상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다:

(a) 돼지 또는 소 복막 또는 심막 멤브레인을 pH 12 초과에서의 수산화나트륨 용액 중 염기 처리, pH 1 내지 3 의 염산 용액 중 산 처리하고, 수용성 유기 용매로 탈수 처리하고, 유기 용매로 탈지 처리하고,

수득한 건조 멤브레인을 절단 분쇄기 (mill) 로 분쇄하고, 0.5-2 mm 체를 통해 체질하고, 수득한 분말을 pH 2.5 내지 3.5 의 산성화된 수용액에 현탁하여, 콜라겐 섬유 슬러리를 수득하는 단계,

(b) 연마된 소 또는 돼지 진피를 수용성 유기 용매로 탈수 처리하고, 유기 용매로 탈지 처리하고, pH 12 초과에서의 강한 무기 염기 중 염기 처리하고, pH 0 내지 1 에서의 강한 무기 산 중 산 처리하고, 물로 헹구고, 콜라겐 섬유를 현탁하고, 동결건조시키고, 건조된 콜라겐 섬유를 유기 용매로 세정하고, 세정된 건조 섬유를 pH 3 내지 4 의 산성화된 용액 중 연마하여, 콜라겐 섬유 슬러리를 수득하는 단계,

(c) (a) 에서 수득한 3.5 내지 4.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리를 (b) 에서 수득한 0.5 내지 1.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하여, 생성된 슬러리를 수득하는 단계,

(d) (c) 에서 수득한 생성된 슬러리를 동결건조시키고, 가교제를 함유하는 용액 중 동결건조된 생성물을 가교하고, 물로 세척하고, 동결건조시키는 단계, 및

(e) (d) 에서 수득한 동결건조된 생성물을 γ 조사 또는 X-선 조사에 의해 임의로 멸균하는 단계.

단계 (a) 는, 어린 송아지 또는 어린 돼지로부터의 복막 멤브레인을 물로 세척하고, 2% 수산화나트륨 용액으로 염기 처리하고, 물로 세척하고, 0.5% 염산 용액으로 산 처리하고, pH 3.5 가 수득될 때까지 물로 세척하고, 물질을 7% 염수 용액으로 수축시키고, 물로 세척하고, 아세톤으로 탈수하고, n-헥산으로 탈지하고, 수득한 건조 멤브레인을 절단 분쇄기로 분쇄하고, 0.5-2 mm 체를 통해 체질하고, 수득한 분말을 pH 2.5 내지 3.5 의 산성화된 수용액 중 현탁하여, 돼지 또는 소 복막 콜라겐 섬유 슬러리를 수득함으로써, EP-B1-1676592 의 "실시예" 에서 기재된 방법과 유사하게 수행될 수 있다.

단계 (a) 는 멸균 멤브레인 Geistlich Bio-Gide® (Geistlich Pharma A.G., Switzerland 에서 입수가능) 를 절단 분쇄기로 분쇄하고, 0.5-2 mm 체를 통해 체질하고, 수득한 분말을 pH 2.5 내지 3.5 의 산성화된 수용액 중 현탁함으로써 편리하게 수행되어, 돼지 복막 콜라겐 섬유 슬러리가 수득된다.

바람직하게는 절단 분쇄기로 분쇄한 후 수득한 분말은 0.5-1 mm 체를 통해 체질된다.

단계 (b) 는, 연마된 돼지 표피를 알코올 또는 케톤과 같은 수용성 유기 용매로 탈수 처리하고, 디클로로에탄 또는 메틸렌 클로라이드와 같은 유기 용매로 탈지 처리하고, pH 12 초과에서의 강한 무기 염기 중 6 내지 24 시간의 기간 동안 염기 처리하고, pH 0 내지 1 에서의 강한 무기 산 중 1 내지 12 시간의 기간 동안 산 처리하고, 물로 헹구고, 팽윤 조절제의 존재 하에 콜라겐 섬유를 현탁하고, 동결건조시키고, 건조된 콜라겐 섬유를 상이한 유기 용매 예컨대 알코올, 에테르, 케톤 및 염소화된 탄화수소로 세정하고, pH 3 내지 4 의 산성화된 용액 중 세정한 건조 섬유를 콜로이드 분쇄기에서 연마하여, 돼지 진피 콜라겐 섬유 슬러리를 수득함으로써, WO 2012/084214 의 실시예 7 에서 개시된 방법과 유사하게 수행될 수 있다.

단계 (a) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리 중 (w/w)% 콜라겐 및 단계 (b) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리 중 (w/w)% 콜라겐은 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 건조 상태에서의 밀도 설정에 있어서 그 역할을 한다. 실제로, 후자는 한편으로는 (a) 에서 수득한 1.5 내지 4.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리와 (b) 에서 수득한 0.5 내지 1.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리를 혼합함으로써 단계 (c) 에서 수득한 생성 콜라겐 섬유 슬러리의 (w/w)% 콜라겐에, 그리고 다른 한편으로는 단계 (d) 에서의 가교 반응의 조건에 주로 의존적이다.

탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 대해 요구된 건조 상태에서의 밀도 50 내지 65 mg/cm³ 를 달성하기 위해서, 단계 (a) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리는 일반적으로 2.0 내지 4.5, 바람직하게는 2.5 내지 3.75 (w/w)% 콜라겐을 함유하며 단계 (b) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리는 일반적으로 3.0 내지 7.0, 바람직하게는 4.0 내지 6.0 (w/w)% 콜라겐을 함유한다.

단계 (c) 는 (a) 에서 수득한 3.5 내지 4.5 중량부의 콜라겐 섬유 슬러리를 (b) 에서 수득한 0.5 내지 1.5 중량부의 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하여, 생성된 슬러리를 수득하는 것을 포함한다.

상이한 돼지 또는 소 조직에서 기인하며 상이한 크기의 콜라겐 섬유 입자를 제공하는 상이한 연마 절차 (단계 (a) 에 대해서는 절단 분쇄기, 및 단계 (b) 에 대해서는 콜로이드 분쇄기 사용) 를 포함하는 상이한 처리를 거치는 2 가지 상이한 콜라겐 섬유 슬러리의 적절한 비율의 이러한 혼합 단계는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 바람직한 다공도 분포 또는 스펙트럼, 즉, 수은 압입법에 의해 측정된 바와 같은 50 내지 90 ㎛ 의 중간 기공 직경을 갖는 상호연결 기공 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 다공도를 획득하기 위한 편리한 방법이다.

생성된 슬러리는 일반적으로 3.0 내지 6.5 (w/w)%, 바람직하게는 3.5 내지 6.0 (w/w)% 콜라겐을 함유한다.

단계 (d) 는 (c) 에서 수득한 생성 슬러리를 동결건조시키고, 동결건조된 생성물을 가교제를 함유하는 용액 중에서 가교하고, 물로 세척하고, 동결건조시키는 것을 포함한다.

가교 단계 전 및 후의 동결건조는 일반적으로 -10℃ 미만의 온도에서 수행된다.

가교제는 적합하게는 글루타르알데히드, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 및 EDC 와 NHS (N-히드록시숙신이미드) 의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 콜라겐 가교에 대해 공지되어 있는 기타 가교제, 예컨대 포름알데히드, 아세트알데히드, 1,4-부탄 디글리시딜 에테르 (BDDGE), N-술포숙신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트, 헥사메틸렌 디이소시아네이트 (HMDC), 시안아미드, 디페닐포스포릴아지드 또는 제니핀이 또한 사용될 수 있다.

가교제가 글루타르알데히드인 경우, 동결건조 후 수득한 스펀지는 적합하게는, 0.01 내지 0.10%, 바람직하게는 0.04 내지 0.06% 글루타르알데히드를 함유하는 pH 7.0 내지 7.5 의 인산염 완충액 중에서 화학적으로 가교된다. 화학적 가교 스펀지는 동결건조되기 전에 물, 1-3 M NaCl 용액, 0.05-0.15 M Na₂HPO₄ 용액 및 물로 연속하여 세척될 수 있다.

가교제가 EDC 인 경우, 동결건조 후 수득한 스펀지는 적합하게는, 먼저 110℃ 초과의 온도에서 탈수열 (dehydrothermal) 처리된 후, 0.05-0.15 M MES (2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산) 또는 0.05-0.15 M 아세트산 및 2-20% (w/w) 의 알코올 (메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택됨) 을 함유하는 완충액 중에서, 콜라겐 1 g 당 0.03-0.80, 바람직하게는 0.2-0.4 g EDC 로, 1 내지 8 시간의 기간 동안 화학적으로 가교된다. 반응 매질 (상기 완충액) 에 대한 콜라겐의 (w/w) 비는 일반적으로 1/10 내지 1/100, 바람직하게는 1/20 내지 1/50 이다. 알코올이 에탄올인 경우, 이는 적합하게는 완충액 중 3-7% (w/w) 로 존재한다. 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 동결건조 전에 먼저 0.05-0.15 M Na₂HPO₄ 용액, 0.5-3 M NaCl 용액으로 세척된 후, 물로 세척될 수 있다.

가교제가 EDC 와 NHS 의 혼합물인 경우, 동결건조 후 수득한 스펀지는 적합하게는, 0.1-0.3 M MES (2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산) 또는 0.1-0.3 M 아세트산 및 10-70% (w/w) 알코올 (메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 부탄올로 이루어지는 군에서 선택됨) 을 함유하는 완충액 중에서, 콜라겐 1 g 당 0.01-0.60, 바람직하게는 0.05-0.2 g EDC 및 0.01-0.6, 바람직하게는 0.05-0.2 g NHS 로, 1 내지 8 시간의 기간 동안 화학적으로 가교된다. NHS 에 대한 EDC 의 몰비는 일반적으로 4 내지 0.5, 바람직하게는 2 내지 1 이다. 반응 매질 (상기 완충액) 에 대한 콜라겐의 (w/w) 비는 일반적으로 1/10 내지 1/100, 바람직하게는 1/20 내지 1/50 이다. 알코올이 에탄올인 경우, 이는 적합하게는 완충액 중 40-60% (w/w) 로 존재한다. 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 동결건조 전에 먼저 0.05-0.15 M Na₂HPO₄ 용액으로 세척된 후, 물로 세척될 수 있다.

(c) 에서 수득한 콜라겐 섬유 슬러리의 혼합물 각각에 대해, 당업자는 본 출원의 교시를 기반으로 단지 당업계의 통상의 지식 및 일상적 실험을 사용하여, 명시된 개시 온도 및 건조 상태에서의 밀도를 갖는 본 발명에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지가 수득되도록 하는 가교제 및 가교 조건을 발견할 수 있을 것이다.

따라서 하기의 것이 3.0 내지 6.5 (w/w)% 콜라겐을 함유하는 콜라겐 슬러리에 대한 일상적 실험에 의해 발견되었다:

- 가교제가 EDC 인 경우:

- 완충액 중 EDC 온도, 콜라겐에 대한 EDC 의 비, 콜라겐에 대한 반응 매질의 (w/w) 비 또는 완충액 중 알코올 % 의 증가에 대하여, 개시 온도가 증가함.

- 완충액 중 알코올 % 의 증가에 대하여, 건조 상태에서의 밀도가 감소함 (콜라겐이 보다 수축함).

- 가교제가 EDC 와 NHS 의 혼합물인 경우:

- 완충액 중 가교제의 농도, 콜라겐에 대한 가교제 (EDC + NHS) 의 (w/w) 비, NHS 에 대한 EDC 의 비, 콜라겐에 대한 반응 매질의 (w/w) 비 또는 완충액 중 알코올 % 의 증가에 대하여, 개시 온도가 증가함.

단계 (d) 의 말에 수득한 동결건조된 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 일반적으로 γ 조사 또는 X-선 조사에 의한 멸균 단계 (e) 를 거칠 것이다. 상기 단계는 단계 (c) 에서 수득한 콜라겐 슬러리 혼합물이 이미 무균성이고 단계 (d) 가 무균 조건 하에 수행되는 경우 필요하지 않을 수 있다.

하기 상세히 기재하는 시험관내 반복 압축 시험 및 효소 분해 시험 (클로스트리듐 히스톨리티쿰 (Clostridium histolyticum) 으로부터의 콜라게나아제를 사용함) 은 구강 내로의 이식 후 화학적 가교 스펀지의 생체내 거동, 특히 과다한 염증 또는 열개와 같은 이상 반응이 없이 치유하고 부피를 유지하는 이의 능력을 예측하는데 매우 유용하다.

본 발명은 또한 상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 제조 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 구강용 이식물로서 사용되는 상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지, 구강용 이식물을 제조하기 위한 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 용도 및 구강 내로 상기 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지를 이식하는 것을 포함하는, 기계적 응력 하에 부피를 유지하면서 특히 치은 세포의 내증식을 양성시킴으로써 입 부위에서의 연조직 부피를 증가시키는 방법에 관한 것이다.

하기 실험적 방법, 시험 및 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않고 본 발명을 설명한다.

탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 건조 상태에서의 밀도 측정을 위한 시험

탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지 샘플을 2 시간 이상 동안 20℃ 의 온도 및 0.5 mbar 미만의 압력에서 동결건조기에서 건조시킨 무게를 잰 플라스틱 튜브 내에 도입하였다. 건조된 샘플을 갖는 튜브를 칭량하고 건조 상태에서의 샘플의 순 중량을 계산하였다.

샘플이 느슨하게 고정되도록 충분한 접촉 압력을 적용하여 (즉, 그의 중량에 의해 초래된 힘에 저항하도록 고정되었으나 힘이 약 10 배 증가시 움직이기 쉬움), 전기 슬라이드 게이지를 사용함으로써 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지 샘플의 길이, 너비 및 높이를 측정하였다. 건조 상태에서의 샘플의 부피를 계산하였다.

그런 다음, 건조 상태에서의 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 밀도 (부피에 대한 중량) 를 각 샘플에 대해 계산하였다.

반복 압축 시험

12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후 첫 번째 하중에 대한 초기 두께 및 이력의 % 를 기계적 압축 기계, 즉 Zwick Roell 사제 Z2.5 물질 압축 기계 (프로그램 Test Expert II 사용) 를 사용하여 측정하였다.

pH 7.4 의 PBS 용액 (80.0 g NaCl, 2.0 g KCl, 17.7 g Na₂HPO₄ 및 2.4 g KH₂PO₄ 를 1000 ml 물에 용해하고, 물 중 용액을 10 회 희석하고, HCl 로 pH 를 7.4 로 조정하여 제조함) 중 2 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션한 멸균의, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지 샘플에 대한 측정을, 37℃ 에서 PBS 에 담그어 수행하였다.

분 당 초기 높이의 33% 의 변형 속도로, 0.25 kPa 의 예압에서 분석을 시작하여, 샘플이 0.5 내지 12.1 kPa 하중의 총 49 사이클을 거치게 하였다.

0.5 kPa 압력에서의 초기 높이를 사용하여, 하중 및 하중제거의 49 사이클 후 초기 높이 유지를 계산하였다. "첫 번째 하중에 대한 이력" 은 등식 XY 에 따른 첫 번째 하중의 0.5 내지 12.1 kPa 의 작업 (W₁ _{, 하중} (Nm)) 및 49 번째 하중제거 사이클로부터의 작업 (W₄₉ _{, 하중제거} (Nm)) 을 사용하는, 하중제거 동안 소멸된 백분율 작업이다:

등식 XY: "첫 번째 로딩에 대한 이력" [%] =

100 * (W₁ _{, 하중} - W₄₉ _{, 하중제거})

---------------------------

W₁ _{, 하중}

프로그램 Test Expert 또는 엑셀은 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후 초기 두께의 유지 % 및 초기 이력의 유지 % 를 계산한다.

도 1 은 반복 압축 시험의 전형적인 결과를 나타낸다.
흥미로운 부피 유지 및 과다한 염증 또는 열개 없는 치유를 생체내 나타낸 본 발명에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 샘플에 대해:
- 초기 높이에 대한 높이 또는 두께 유지는 12.1 kPa 로의 압축 49 사이클 후 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85% 이상이었으며,
- 12.1 kPa 로의 압축 49 사이클 후 첫 번째 하중에 대한 이력 유지는 55% 미만, 바람직하게는 45% 미만이었다.
클로스트리듐 히스톨리티쿰 ( Clostridium histolyticum ) 으로부터의 콜라 게나아제를 사용하는 효소 분해 시험
인간 신체에서 콜라겐은 인간 조직 매트릭스-메탈로프로테이나아제 (MMP), 카텝신에 의해, 그리고 추정적으로는 일부 세린 프로테이나아제에 의해 분해된다. 최적으로 연구된 것은 콜라게나아제 (특히 MMP-1, MMP-8, MMP-13 및 MMP-18) 가 직접적 콜라겐 분해를 위한 가장 중요한 효소인 MMP 이다 (Lauer-Fields et al. 2002 Matrix metalloproteinases and collagen catabolism in Biopolymers Peptide Science Section 및 Song et al. 2006 Matrix metalloproteinase dependent and independent collagen degradation in Frontiers in Bioscience).
콜라겐 조직 및 멤브레인을 분해하는 콜라게나아제의 능력은 기질 유연성 및 콜라겐 유형, MMP 활성 부위 및 MMP 외부 부위 (exosite) 에 따라 좌우된다. 콜라게나아제는 삼중 나선 콜라겐에 정렬되고, 이를 풀리게 한 후 절단한다 (Song et al. 2006, 상기 참조).
상이한 콜라겐 유형 사이의 분해 차이를 극복할 목적으로, 콜라겐의 콜라게나아제 분해를 종종, 높은 촉매 속도를 갖는 클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 콜라게나아제를 사용하여 평가한다 (Kadler et al. 2007 Collagen at a glance in J Cell Sci). 일반적으로, 천연 콜라겐 생성물은 화학적 가교 콜라겐 생성물보다 빠르게 분해된다.
이 시험에서 콜라겐 생성물 (본 발명에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지 샘플) 을 클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 50 유닛/ml (1 개 유닛은 칼슘 이온의 존재 하 pH 7.4 및 37℃ 에서 5 시간에서의 1.0 μmol 의 류신에 대한 닌히드린 색과 동등한 소 아킬레스건으로부터의 콜라겐으로부터의 자유 펩티드로서 정의됨) 과 함께 37℃ 에서 칼슘 함유 Tris-완충제 중 인큐베이션하고, 콜라겐 매트릭스의 분해를 시각적으로 및 참조 물질로서 콜라겐 I 형을 사용하여 Bio-Rad Laboratories (Hercules, USA, Order Nr. 500-0116) 사로부터의 "DC 단백질 검정" 으로 측정하였다. 마이크로웰플레이트 분광계 (Tecan 사에서 입수가능한 Infinite M200) 를 사용하여 콜라겐 농도를 측정하였다.
과다한 염증 또는 열개가 없는 치유를 생체내 나타낸 본 발명에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지 샘플에 대해, 콜라겐은 3 내지 5 시간 내에 완전히 분해되었다 (시각적 검사에 의해 검출가능한 콜라겐 섬유가 없음).

실시예 1 돼지 복막에서 유도된 콜라겐 섬유 슬러리의 제조

어린 돼지로부터의 복막 멤브레인을 기계적 수단에 의해 살과 기름을 완전히 제거하고, 흐르는 물로 세척하고, 2% NaOH 용액으로 12 시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 멤브레인을 흐르는 물로 세척하고 0.5% HCl 로 산성화하였다. 물질을 그의 전체 두께에 걸쳐 산성화시킨 후 (약 15 분), 물질을 pH 3.5 가 얻어질 때까지 세척하였다. 이후 물질을 7% 염수 용액으로 수축시키고, 1% NaHCO₃ 용액으로 중화시키고, 흐르는 물로 세척하였다. 물질을 그 후 아세톤으로 탈수하고 n-헥산으로 탈지하였다.

물질을 에탄올 에테르를 사용하여 건조시키고, 0.5 내지 1.0 mm 의 사다리꼴 체를 포함하는 절단 분쇄기로 분쇄하였다 (예를 들어 Fritsch 사로부터의 Pulverisette 25: www.fritsch.de./produkte/mahlen/schneidmuehlen/pulverisette-25 또는 Retsch 사로부터의 SM300: www.retsch.de/de/produkte/zerkleinern/schneidmuehlen.html 참조).

적절량의 건조된 분말을 물에 현탁하고 10 mM 염산으로 pH 를 2.6 으로 조정하여, 4% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리 및 6% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리를 제조하였다.

실시예 2 멸균 Geistlich Bio-Gide® 멤브레인에서 유도된 콜라겐 섬유 슬러리의 제조

Geistlich Bio-Gide® 멤브레인 (Geistlich Pharma AG, CH-6110, Switzerland 에서 입수가능) 을 건조시키고 0.5 내지 1.0 mm 의 사다리꼴 체를 포함하는 절단 분쇄기로 분쇄하였다. 적절량의 건조된 분말을 물에 현탁하고 10 mM 염산으로 pH 를 2.6 으로 조정하여, 콜라겐 섬유의 4% (w/w) 콜라겐 슬러리 및 콜라겐 섬유의 6% (w/w) 콜라겐 슬러리를 제조하였다.

실시예 3 돼지 진피에서 유도된 콜라겐 섬유 슬러리의 제조

돼지 가죽을 고기 분쇄기에서 1 내지 20 mm 의 조각으로 연마하였다. 알코올 또는 케톤과 같은 수용성 용매를 사용하여 물을 제거하였다. 염소화 탄화수소 예컨대 디클로로에탄 또는 메틸렌 클로라이드 또는 비-염소화 탄화수소 예컨대 헥산 또는 톨루엔을 사용하여 콜라겐 섬유를 탈지하였다. 용매를 제거한 후, 콜라겐을 pH 12 초과에서의 강한 무기 염기로 6 내지 24 시간의 기간 동안 처리하고 pH 0 내지 1 에서의 강한 무기 산으로 1 내지 12 시간의 기간 동안 처리하였다. 과량의 산을 물로 헹구어 제거하고, 현탁액을 콜로이드 분쇄에 의해 무기 염과 같은 팽윤 조절제의 존재 하 콜라겐 섬유의 0.5 내지 2% 균질 현탁액으로 균질화하였다. 현탁액을 동결건조에 의해 건조시키고 건조 콜라겐 섬유를 상이한 유기 용매 예컨대 알코올, 에테르, 케톤 및 염소화 탄화수소로 연속하여 세정하고, 용매는 1% (w/w) 미만의 용매 잔류물까지 진공 하 증발시킨다.

콜라겐 섬유의 2.5% (w/w) 콜라겐 슬러리 및 콜라겐 섬유의 3.75% (w/w) 콜라겐 슬러리를, pH 3.4 에서 물을 사용한 상기 수득한 세정된 건조 섬유의 적절량을 콜로이드 분쇄에 의해 잘게 연마하여 제조하였다.

실시예 4 EDC 로 화학적 가교된 탄력있는 재흡수성 콜라겐 스펀지의 제조

4 부의, 실시예 1 또는 실시예 2 에서 수득한 콜라겐 섬유의 4% (w/w) 콜라겐 슬러리를 1 부의, 실시예 3 에서 수득한 콜라겐 섬유의 2.5% (w/w) 콜라겐 슬러리와 혼합하고, 8 X 25 X 25 mm 의 몰드에 부었다. 생성된 콜라겐 섬유의 3.7% 슬러리를 -45℃ 에서 동결건조에 의해 건조시켰다. 그런 다음, 건조된 콜라겐 스펀지를 120℃ 에서 24 시간 동안 감압 하 (200 mbar 미만) 탈수열 처리하였다.

콜라겐 스펀지를 이후 pH 5.5 에서 0.1M MES (2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산) 및 5% 에탄올을 함유하는 완충액 중에서, 콜라겐 1 g 당 0.3 g EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드) 로, 120 분의 기간 동안 실온에서 교반 하에 화학적으로 가교하였다.

화학적 가교 콜라겐 스펀지를 먼저 0.10 M Na2HPO4 용액, 1M NaCl 용액, 2M NaCl 용액으로 세척한 후, 물로 세척하고, -45℃ 에서 동결건조시켰다.

건조된 화학적 가교 콜라겐 스펀지를 30 kGy 에서 감마-멸균하였다.

멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 측정 개시 온도 및 건조 상태에서의 밀도는 각각 47℃ 및 64 mg/cm³ 이었다.

37℃ 에서 PBS 중 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후, 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 그의 초기 두께의 87% 및 초기 이력의 41% 의 유지를 나타내었다.

수은 압입법은, 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 대해 88 ㎛ 의 중간 기공 직경 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 95% 다공도를 보여주었다.

클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 콜라게나아제를 사용하는 효소 분해 시험은, 콜라겐이 3.25 시간 내에 완전히 분해됨을 보여주었다.

실시예 5 EDC 와 NHS 의 혼합물로 화학적 가교된 탄력있는 재흡수성 콜라겐 스펀지의 제조

4 부의, 실시예 1 또는 실시예 2 에서 수득한 6% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리를 1 부의, 실시예 3 에서 수득한 3.75% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하고, 6 mm 높이의 몰드에 부었다. 생성된 콜라겐 섬유의 5.55% (w/w) 콜라겐 슬러리를 -10℃ 에서 동결건조에 의해 건조시켰다.

이러한 스펀지를, pH 5.5 에서 0.2 M MES (2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산) 및 50% w/w 에탄올을 함유하는 용액 중에서, 콜라겐 1 g 당 0.1 g EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드) 및 콜라겐 1 g 당 0.1 g NHS (N-히드록시숙신이미드) 로, 120 분의 기간 동안 실온에서 교반 하에 화학적으로 가교하였다. 화학적 가교 스펀지를 먼저 0.1 M Na₂HPO₄용액, 1M NaCl 용액, 2M NaCl 용액으로 세척한 후, 물로 세척하고, -10℃ 에서 동결건조시켰다.

건조된 화학적 가교 콜라겐 스펀지를 26 kGy 에서 γ 조사에 의해 멸균하였다.

멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 측정 개시 온도 및 건조 상태에서의 밀도는 각각 52℃ 및 59 mg/cm³ 였다.

37℃ 에서 PBS 중 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후, 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 첫 번째 하중에 대해 그의 초기 두께의 90% 및 이력의 38% 의 유지를 나타내었다.

수은 압입법은, 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 대해 69.1 ㎛ 의 중간 기공 직경 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 93.1% 다공도를 보여주었다.

클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 콜라게나아제를 사용하는 효소 분해 시험은, 콜라겐이 3.5 시간 내에 완전히 분해됨을 보여주었다.

실시예 6 EDC 와 NHS 의 혼합물로 화학적 가교된 탄력있는 재흡수성 콜라겐 스펀지의 제조 (멸균 단계 없음)

4 부의, 실시예 2 에서 수득한 6% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리를 1 부의, 실시예 3 에서 수득한 3.75% (w/w) 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하고, 6 mm 높이의 몰드에 부었다. 생성된 콜라겐 섬유의 5.55% (w/w) 콜라겐 슬러리를　-10℃ 에서 동결건조에 의해 건조시켰다.

이러한 스펀지를, pH 5.5 에서 0.2 M MES (2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산) 및 50% w/w 에탄올을 함유하는 용액 중에서, 콜라겐 1 g 당 0.01 g EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드) 및 콜라겐 1 g 당 0.01 g　NHS (N-히드록시숙신이미드) 로, 120 분의 기간 동안 실온에서 교반 하에 화학적으로 가교하였다. 화학적 가교된 스펀지를 먼저 0.1 M Na₂HPO₄용액, 1M NaCl 용액, 2M NaCl 용액으로 세척한 후, 물로 세척하고, -10℃ 에서 동결건조시켰다.

화학적 가교 콜라겐 스펀지의 측정 개시 온도 및 건조 상태에서의 밀도는 각각 57℃ 및 57 mg/cm³ 였다.

37℃ 에서 PBS 중 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후, 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 그의 초기 두께의 80% 의 유지를 나타내었다.

수은 압입법은, 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 대해 71.0 ㎛ 의 중간 기공 직경 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 94.0% 다공도를 보여주었다.

실시예 7 글루타르알데히드로 화학적 가교된 탄력있는 재흡수성 콜라겐 스펀지의 제조

4 부의, 실시예 1 에서 수득한 콜라겐 섬유 슬러리를 1 부의, 실시예 3 에서 수득한 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하고, 6 mm 높이의 몰드에 부었다. 콜라겐 슬러리를 -45℃ 에서 동결건조에 의해 건조시켰다. 이러한 스펀지를, 0.05% (w/w) 글루타르알데히드를 함유하는 인산나트륨 완충제 (pH 7.0-7.5) 중에서 10℃ 에서 60 분 동안 화학적으로 가교하였다. 화학적 가교 콜라겐 스펀지를 물, 2 M NaCl 용액 및 0.1 M Na₂HPO₄ 용액으로 연속하여 세척하였다. 물로 마지막으로 헹군 후, 스펀지를 -45℃ 에서 동결건조시켰다.

화학적 가교 콜라겐 스펀지를 25 kGy 에서 γ-조사에 의해 멸균하였다.

멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 측정 개시 온도 및 건조 상태에서의 밀도는 각각 51℃ 및 52 mg/cm³ 였다.

37℃ 에서 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후, PBS 중 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지는 첫 번째 하중에 대해 그의 초기 두께의 74% 및 이력의 48% 의 유지를 나타내었다.

수은 압입법은, 멸균된 화학적 가교 콜라겐 스펀지에 대해 63.7 ㎛ 의 중간 기공 직경 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 92.7% 다공도를 보여주었다.

클로스트리듐 히스톨리티쿰으로부터의 콜라게나아제를 사용하는 효소 분해 시험은, 콜라겐이 4.5 시간 내에 완전히 분해됨을 보여주었다.

Claims

입 부위에서의 연조직 부피 증가 촉진을 위한, 수은 압입법에 의해 50 내지 90 ㎛ 의 중간 기공 직경을 갖는 상호연결 기공 및 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 80% 이상 다공도, 45 내지 57℃ 의 개시 온도 및 50 내지 65 mg/cm³ 의 건조 상태에서의 밀도를 나타내는, 60-96% (w/w) 콜라겐 및 4-40% (w/w) 엘라스틴을 포함하는 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항에 있어서, 46 내지 53℃ 의 개시 온도를 나타내는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 50 내지 60 mg/cm³ 의 건조 상태에서의 밀도를 나타내는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 70-90% (w/w) 콜라겐 및 10-30% (w/w) 엘라스틴을 포함하는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 10 ㎛ 초과의 기공 직경으로의 90% 이상 다공도를 나타내는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 글루타르알데히드, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 및 EDC 와 NHS (N-히드록시숙신이미드) 의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 가교제를 사용하여 수득된, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 동결건조 및 화학적 가교, 임의로는 이후 γ 멸균 또는 X-선 멸균을 포함하는 방법에 의해 천연 기원의 조직에서 유도된, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, 천연 기원의 조직이 돼지 또는 소 복막 또는 심막 멤브레인, 돼지 또는 소 태반 멤브레인, 또는 돼지 또는 소 SIS 또는 진피를 포함하는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, PBS 용액에 의해 습윤된 콜라겐 스펀지가 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후 초기 두께의 70% 이상을 유지하는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, PBS 용액에 의해 습윤된 콜라겐 스펀지가 12.1 kPa 의 압력으로의 압축 49 사이클 후 첫 번째 하중에 대해 55% 미만의 이력 (hysteresis) 을 유지하는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 입 부위에서 이식 후 SCTG (상피하 결합조직 이식) 와 동일한 부피 유지를 나타내는, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.
하기 단계를 포함하는, 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지의 제조 방법:
(a) 돼지 또는 소 복막 또는 심막 멤브레인을 pH 12 초과에서의 수산화나트륨 용액 중 염기 처리, pH 1 내지 3 의 염산 용액 중 산 처리하고, 수용성 유기 용매로 탈수 처리하고, 유기 용매로 탈지 처리하고, 수득한 건조 멤브레인을 절단 분쇄기로 분쇄하고, 0.5-2 mm 체를 통해 체질하고, 수득한 분말을 pH 2.5 내지 3.5 의 산성화된 수용액에 현탁하여, 콜라겐 섬유 슬러리를 수득하는 단계,
(b) 연마된 소 또는 돼지 진피를 수용성 유기 용매로 탈수 처리하고, 유기 용매로 탈지 처리하고, pH 12 초과에서의 강한 무기 염기 중 염기 처리하고, pH 0 내지 1 에서의 강한 무기 산 중 산 처리하고, 물로 헹구고, 콜라겐 섬유를 현탁하고, 동결건조시키고, 건조된 콜라겐 섬유를 유기 용매로 세정하고, 세정된 건조 섬유를 pH 3 내지 4 의 산성화된 용액 중 연마하여, 콜라겐 섬유 슬러리를 수득하는 단계,
(c) (a) 에서 수득한 3.5 내지 4.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리를 (b) 에서 수득한 0.5 내지 1.5 부의 콜라겐 섬유 슬러리와 혼합하여, 생성된 슬러리를 수득하는 단계,
(d) (c) 에서 수득한 생성된 슬러리를 동결건조시키고, 가교제를 함유하는 용액 중 동결건조된 생성물을 가교하고, 물로 세척하고, 동결건조시키는 단계, 및
(e) (d) 에서 수득한 동결건조된 생성물을 γ 조사 또는 X-선 조사에 의해 임의로 멸균하는 단계.
제 12 항에 있어서, 가교제가 글루타르알데히드, EDC (1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드), 및 EDC 와 NHS (N-히드록시숙신이미드) 의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 단계 (a) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리가 2.5 내지 3.75 (w/w)% 콜라겐을 함유하고 단계 (b) 에서 제조된 콜라겐 섬유 슬러리가 4.0 내지 6.0 (w/w)% 콜라겐을 함유하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 구강에서의 이식물로서 사용하기 위한, 탄력있는 재흡수성 화학적 가교 콜라겐 스펀지.