JP4989108B2 - 血管平滑筋細胞の培養方法、培養器材および培養によって得られる医療用材料 - Google Patents
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Description
R1、R3は下記の構造式で表される<A>または<B>の何れかであり、R1とR3とは同じであっても異なっていてもよく、
[製造例1]
(水溶性エラスチンの作製)
ブタ大動脈血管から脂肪を除去し水洗した後、5〜10重量%塩化ナトリウム水溶液に浸し24時間冷蔵庫内で静置し、コラーゲンを溶解除去した。水洗後水を加え圧力鍋で1時間煮沸後、血管付着物を除去し、ミキサーに入れ組織片が1〜5mm片になるまで破砕した。その後、再度圧力鍋で1時間加熱し水洗した。メッシュ状袋に移し電動洗浄機で洗浄した後、エタノールを最終濃度50容量%になるように加え30分間静置した。その後エタノールを最終濃度70容量%になるように加え90分間静置した。更にエタノールを最終濃度90容量%になるように加えた後10時間静置した。最終的にエタノールを取り除き、デシケーターにて減圧乾燥し不溶性エラスチン(血管2kgより乾燥重量で約330gの収量)を得た。 この不溶性エラスチン10gに対し0.25Mシュウ酸を45mL加え100℃で1時間加熱した。氷水で冷やし遠心分離し、上澄み液を集め、分子量10,000〜14,000の透析チューブで脱イオン水に対し、外液のpHが5〜6程度になるまで透析を行ってシュウ酸を除去した。上澄み液をガラスフィルターで吸引ろ過し、ろ液を凍結乾燥して水溶性エラスチン(約3g)を得た。
(架橋剤の製造)
水溶性エラスチンを用いてエラスチン構造体を作製するための化学架橋剤を、公開WO 02/096978に記載されている方法に従って作製した。この方法は、ドデカンジカルボン酸のカルボキシル基を4−ヒドロキキシフェニルジメチル−スルホニウムメチルサルフェート(以下DSP)により活性エステル化させるものである。具体的には1モルのドデカンジカルボン酸と2モルのDSPおよび2モルのジシクロヘキシルカルボジイミド(以下DCCD)をアセトニトリルに溶解し25℃で5時間撹拌し反応させる。反応過程で生じたジシクロヘキシル尿素をガラスフィルターで除去した。更に反応溶液(ろ液)をエーテルに滴下して固化させた。該固形物を減圧乾燥して目的の架橋剤を得た。化学構造および純度は1H−NMRにより確認した。
(水溶性エラスチンおよび架橋剤の細胞障害試験)
水溶性エラスチンおよび架橋剤の血管平滑筋細胞に対する障害試験として、生細胞が3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニル−2H−テトラゾリウムブロミド(以下MTT)をホルマザン産物に転換する原理を利用するMTT法を用いた。MTTなどのテトラゾリウム塩はミトコンドリアの酸化的リン酸化反応であるTCA回路の脱水素酵素の基質になるので、サンプル物質の細胞活性障害を測定することができる。測定にはCell Proliferation Kit I (Roche社製)を用いた。
具体的測定方法としては、96well細胞培養プレートに対し10容量%ウシ胎児血清を含むCSC培地(血管平滑筋細胞用培地:大日本製薬社製)を100μL/well添加してプレインキュベートし、平滑筋細胞懸濁液(細胞密度1.5×105cells/mL)を10μL/well播種し、37℃、5容量%CO2インキュベーター内で培養した。サブコンフルエントとなった後、培地を吸引し、0.1容量%ウシ胎児血清を含むCSC培地100μLを添加し、更に細胞増殖が停止するまでインキュベーター内で24時間培養した。PBSで洗浄後、製造例1で製造した水溶性エラスチンの水溶液(濃度0.1〜5重量%)、製造例2で製造したDSP活性化ドデカンジカルボン酸架橋剤(50〜500μM)および製造例2で使用したDSP(0.05〜20mM)をそれぞれ100μL/well添加し、インキュベーター内で24時間培養した。その後、サンプル溶液を吸引、PBSで洗浄後、10容量%ウシ胎児血清を含むCSC培地を100μL/well添加し、MTT液を規定量添加し、インキュベーター内で一晩静置し、マイクロプレートリーダーを用いて、測定波長550nmおよび参考波長655nmの吸光度を測定した。試料未添加をコントロールとして、測定値と対比した。結果を[図1]、[図2]、および[図3]に示す。水溶性エラスチン、架橋剤および活性エステル基部分(DSP)のいずれも測定濃度範囲内では、コントロールとほぼ変化がなく、即ち細胞活性に影響は無く障害性を示さないことがわかった。
(水溶性エラスチンのコアセルべーション温度の測定)
水溶性エラスチンには、溶液温度の上昇に応じて分子内および分子間における疎水性相互作用が発現し、凝集する感熱現象が観察される。これはコアセルべーションと呼び、水溶性エラスチンの重要な現象の一つとして知られている。コアセルべーション温度は、溶液の濁度を測定することで決定できる。具体的には温度可変装置つきの分光光度計を用いて、特定波長(640nm)を試料溶液に照射し入射光強度に対する透過光強度の割合を透過率として算出した。温度を10〜80℃まで変化させ透過率を測定し透過率の減少が全体の50%になる温度をコアセルべーション温度と定義した。エラスチン濃度を0.1〜70重量%まで変化させてコアセルべーション温度を測定した。結果を[図4]に示した。水溶性エラスチン濃度の上昇とともにコアセルべーション温度も上昇し、60重量%以上では凝集しないことが確認された。この結果から水溶性エラスチン濃度を60重量%以上とした場合には、水溶性エラスチンを100℃以上の温度で架橋し透明な成形体が得られることが判明した。
(静的細胞培養用のエラスチンでコーティングしたシャーレの作成)
クリーンベンチ内での無菌操作下で以下の操作を行った。浮遊培養用35φシャーレ(住友ベークライト株式会社、ポリスチレン製)の表面に、コロナ放電装置(コロナフィット:信光電気計装株式会社製)のコロナ炎吹き出し口が、培養用シャーレ表面から10mmの距離を保った状態で、45秒間放電(9kV)処理を行い、その後100μg/mL水溶性エラスチン溶液1mLを8時間載置した。その後エラスチン溶液を捨て、シャーレを室温で約1時間乾燥した。この処理により、コロナ放電で活性化したシャーレ表面にエラスチンが反応して固定され、エラスチンがコーティングされる。同様に対照実験用としてコラーゲンでコーティングしたシャーレを製造した。コーティング状態の評価は、表面の水滴の接触角測定により行った。具体的には、接触角測定器(ERMA社製)の載物台上のスライドガラス上に浮遊培養用35φシャーレを載せ、脱イオン水をマイクロビュレットで20μL添加し、数秒静置後に接触角を測定した。5回の接触角の平均値を測定値とした。
コロナ放電により疎水性表面が活性化され、水中のタンパク質が反応することで表面にエラスチン、コラーゲンが固定化される。放電後は大気中では約8時間程度で元の疎水性に戻る(接触角約80°)ことが観測される。放電直後に水のみを加えた場合(コントロール)は、元の疎水性に戻る際に徐々に水分子の一部が反応して親水化し、8時間程度で表面変化は安定し、接触角で約42°になる。放電直後にエラスチン水溶液またはコラーゲン水溶液を浸漬させた場合は、8時間後ではそれぞれ25°、34°とコントロールより親水性の状態で安定化表面が形成された[図5]。この結果からコロナ放電されてシャーレ表面にエラスチンおよびコラーゲンがコーティングされたことが確認された。
(エラスチンコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材の作製)
厚さ10mmのシリコンゴムシートを加工し、縦3cm×横3cm×高さ1cmの培養皿の箱型の外枠を作製した。その底面に厚さ50μmのシリコンゴムシートをバスコーク(HJ−132 セメダイン株式会社)を用いて接着させ、一日静置することで完全に接着させた。脱イオン水で充分洗浄した後、121℃でオートクレーブ処理を30分間行い滅菌する。実施例1と同じコロナ放電装置により表面処理を45秒間行い、100μg/mL水溶性エラスチン溶液およびコラーゲン溶液を1mL加え8時間静置した。同様に対照実験用としてコラーゲンでコーティングしたシャーレを製造した。コーティングの評価は、接触角の測定から行った[図6]。浮遊培養用シャーレと同様にシリコンシートに対しても、接触角の有意な低下が見られるため、エラスチンおよびコラーゲンがコーティングされたことが確認された。
(エラスチンゲルシートを用いた動的培養器材の作製)
水溶性エラスチン600mgに対し、製造例2で製造した架橋剤340mM水溶液を240μL加え、更に脱イオン水を加え最終エラスチン濃度が65重量%になるように溶液を調整した。両面を撥水処理したガラス板で鋳型を作成し、上記エラスチン溶液をシート状に成型するように流し込み100℃で30分間加熱架橋させ、膜厚約100μmの光透過性エラスチンゲルシートを得た。本条件はコアセルべーションを起こさない状態であるため、得られたエラスチンゲルシートの可視光の透過率が60〜90%程度で、光学顕微鏡下での観察が可能である。実施例2で作製したと同じく、厚さ10mmのシリコンゴムシートで、縦3cm×横3cm×高さ1cmの培養皿の外枠を作製し、上記のエラスチンゲルシートを接着剤で接着した。脱イオン水で充分洗浄した後、121℃でオートクレーブ処理を30分間行い滅菌した。
(血管系細胞培養接着・伸展試験)
市販の正常ヒト血管平滑筋細胞、正常ヒト線維芽細胞、正常ヒト血管内皮細胞をそれぞれ無血清の専用培地と共に、1.0×104(cells/mL)で、実施例1で作製したエラスチンでコーティングしたシャーレおよびコラーゲンでコーティングしたシャーレ上に播種した。5%CO2培養装置(OLYMPUS MI-IBC)で培養しながら、光学顕微鏡(OLYMPUS IMT-2)でパソコンのXCAPソフトに画像を取り込み、撮影枚数や撮影インターバルを設定した。播種した時間を0とし、撮影した画像はAdobe Photoshopにて解析処理した。細胞接着率および接着した細胞の伸展は、を撮影した画像の解析より算出した。これは経時間的に撮影した細胞画像から各時間における細胞接着総数および細胞伸展数を測定し、接着率(%)=(接着細胞数/全細胞数)×100および伸展率(%)=(伸展細胞数/全接着細胞数)×100により算出した。
(エラスチンでコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材による動的培養試験)
実施例2で作製した、エラスチンでコーティングしたシリコンシートを用いた動的培養器材にCSC培地(血管平滑筋細胞用培地:大日本製薬社製)で細胞濃度を1.0×105(cells/mL)に調節した血管平滑筋細胞懸濁液を1mL播種した。細胞を播種してから20時間、37℃、5%CO2培養装置(OLYMPUS MI-IBC)で静的培養した。動的培養器材を取り出し位相差顕微鏡により細胞が接着していることを確認後、CSC培地3mLで培地交換し、再び37℃、5%CO2で4時間静的培養によりインキュベートした。その後、顕微鏡ステージ上に固定した動的細胞培養用装置に静的培養した動的培養器材をセットし、伸展条件を2秒で一往復(0.5Hz)、伸展率10%で動的細胞培養(1軸伸展培養)を4時間行い同一箇所の撮影を繰り返した。撮影した画像の解析より、動的培養中の各時間における血管平滑筋細胞の引っ張り付加方向に対する配向角度を測定した。[図8]には静的培養時の配向角度変化(0〜4時間)を[図9]動的培養時の配向角度変化(0〜4時間)を示した。静的培養ではほとんど角度を変える割合の変化が無いが、動的培養では、時間とともに、配向角度の分布が引っ張り付加方向に対して垂直の角度を向く細胞の割合が多くなることがわかる。この現象は同様の方法で、0.5Hz、0.2%程度の伸展条件では静的培養と同様に変化が見られなかった。
(血管平滑筋の分化誘導試験)
血管平滑筋細胞の細胞骨格構造変化に関する実験として、細胞内骨格タンパク質であるα−アクチン、β−アクチンの免疫染色を行い、その取り込み画像のピクセル解析から、タンパクの定量を行った。一般に、α−アクチンは分化型の特徴とされ、β−アクチンは脱分化型で多いとされている。実施例1の方法で作製したエラスチンをコーティングしたシャーレで培養した血管平滑筋細胞中に発現している両アクチン量を、コントロールとして一般に使用されている接着性細胞用シャーレ(住友ベークライト株式会社、ポリスチレン:親水性処理済)で培養した血管平滑筋細胞中に発現している両アクチン量で割った比を[図10]に示した。
エラスチン上で培養した平滑筋細胞は、動的培養でないにもかかわらず、未処理培養皿中のアクチンと比較するとα−アクチンが増加しβ−アクチン比が低下する現象が見られ、分化誘導が促進されていることがわかった。
(エラスチンゲルシートを用いた動的培養器材によるによる動的培養試験)
実施例3で作製したエラスチンゲルシートを用いた動的培養器材を用いて、実施例5と同様に血管平滑筋細胞を培養した。エラスチンゲルシート上に生育する細胞の3次元的な顕微鏡観察を行うことができた。
Claims (7)
- 水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを含む足場であってコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含まない足場上で血管平滑筋細胞を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞の培養方法であって、血管平滑筋細胞が水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンに接着するまで、水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを伸張および収縮させない静的状態で血管平滑筋細胞を培養し、次いで水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを伸張および収縮させる動的状態で血管平滑筋細胞を培養する培養方法。
- 水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを含む足場であってコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含まない足場上で血管平滑筋細胞と他の血管系細胞の混合物を培養することを特徴とする血管平滑筋細胞を選択的に増殖させる請求項1に記載の血管平滑筋細胞の培養方法。
- 細胞が生育する伸縮性の材料表面上に水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを含む足場であってコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含まない足場が固定されている血管平滑筋細胞の培養器材。
- 伸縮性の材料がシリコンゴムシートである請求項3に記載の血管平滑筋細胞の培養器材。
- 細胞が生育する面が水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチン成形体で構成されている請求項3または4に記載の血管平滑筋細胞の培養器材。
- 細胞が生育する面の可視光または紫外光の透過率が50〜100%である請求項3または4に記載の血管平滑筋細胞の細胞培養器材。
- 細胞が生育する面上に水溶性エラスチン又は水溶性エラスチンを架橋した架橋エラスチンを含む足場であってコラーゲン、フィブロネクチンおよびラミニンを含まない足場が固定されている培養器材、および
該面上で培養された血管平滑筋細胞、
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