CN114432492B - 一种适用于软骨的组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于软骨的组织工程支架及其制备方法，所述支架是由丝胶蛋白、海藻酸钠、碳酸钙、葡萄糖酸内酯复合交联而成。本发明制备的天然高分子材料支架，结构稳定，具有适宜软骨细胞生长的刚度、孔隙，能够模拟三维细胞生长微环境维持细胞表型，有助于软骨特异性细胞外基质成分的积累；该支架具有低免疫原性和良好的细胞相容性，可促进软骨细胞的黏附及附着软骨细胞的增殖，加快软骨组织再生进程；可通过改变丝胶蛋白的含量，调节降解率，达到降解可控性。本发明制备工艺简单，易于操作和控制，在软骨缺损修复方面具有广阔的应用前景。

Description

一种适用于软骨的组织工程支架及其制备方法

技术领域

本发明涉及组织工程支架技术领域，特别的涉及一种用于软骨缺损修复的高分子材料支架。

背景技术

创伤、损伤或病理(如骨关节炎)等引起的软骨缺损现象愈发普遍，严重影响患者的日常生活活动。由于关节软骨中缺少血管、淋巴管及神经分布，因此受损的软骨很难完成自我修复再生。目前用于软骨修复的治疗方法包括微骨折手术，软骨下钻孔，全膝关节置换，自体软骨细胞植入，骨软骨自体和同种异体移植，但这些方法由于供体短缺、免疫原性差、易引起纤维软骨生成而受到限制。随着组织工程和细胞治疗技术的不断改进，生物材料支架、种子细胞和合适的培养条件的不断结合，软骨组织的再生质量越来越好，因此，研究与制备具有良好修复性能的软骨修复材料，成为研究热点。

用于软骨修复的支架，应允许细胞迁移、黏附、分化和增殖、能够诱导新的细胞外基质的组装、具有合适的机械性能以维持必要的生理负荷，应有效的避免因纤维软骨再生、不能达到长期康复要求等原因造成的二次手术。目前用于软骨修复的组织工程支架主要有固体多孔支架、纤维支架、水凝胶支架。固体多孔支架由于其优越的力学性能、适宜的孔隙率、易于加工塑形与消毒等优点，广泛应用于软骨修复。研究表明，水占软骨湿重的65～85wt％，承担使关节保持润滑及输送营养物质的作用，蛋白多糖被胶原包裹，使软骨具有独特的弹性，因此，固体多孔支架难以做到对细胞外基质成分和功能更贴近的仿生效果。纤维支架由于其良好的力学稳定性、优越的细胞黏附性以及促细胞分化能力，在软骨修复领域有巨大的潜力，但纤维支架不能与无规则的缺损形状完全吻合，阻碍了软骨的修复。

水凝胶作为一种高含水量的三维交联网络，成为一种很好的仿生细胞外基质材料，目前，利用合成或天然聚合物制备的各种水凝胶已被用于软骨修复领域。例如，由于其可控的机械强度而用于软骨修复的聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚己内酯(PCL)等合成聚合物。但此类材料也存在一些缺点，如细胞亲和性差、降解速率难以控制、降解过程中伴有一些酸性成份的释放致使局部pH值下降，此类问题不仅会引发炎症反应，也会影响种子细胞的活性和生长，在一定程度上限制了其应用。胶原蛋白、丝素蛋白、丝胶蛋白、透明质酸、藻酸盐、壳聚糖等天然高分子材料不具备上述缺点，能更好地匹配软骨的生物学特性。因此，制备出匹配软骨的生物学特性、支持体内生物力学环境及降解的支架，是软骨组织修复的关键。

针对上述问题，国内外学者进行了大量的研究工作。其中，海藻酸盐凝胶具有制备简便、细胞反应良好、成本低等优点，使其成为组织工程研究的热门对象。据报道，在三维海藻酸盐培养物中接种软骨细胞可显着提高II型胶原蛋白的表达，骨髓间充质干细胞(BMMSCs)可均匀分布于海藻酸盐体系中，并能够在植入物中产生ECM，形成软骨样聚集物。但海藻酸盐的缺点之一是，由于细胞和多糖之间没有特定的相互作用，悬浮在凝胶中的细胞不能直接粘附在基质上。此外，海藻酸盐降解缓慢且不可控，降解速率很难做到与软骨组织再生速率相匹配。

丝胶蛋白是蚕茧中的一种天然蛋白，具有生物降解性、更低的免疫原性，促细胞黏附和增殖活性，抗氧化活性。丝胶蛋白含有多种氨基酸，主要氨基酸残基为丝氨酸(Ser)、天门冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)，其中丝氨酸本身也可以作为促进某些类型细胞存活和增殖的营养来源。此外，丝胶蛋白的亲水氨基酸侧链处于外部，赋予了丝胶蛋白良好的亲水性。但丝胶蛋白的二级结构主要以无规卷曲为主，难以保证均一且稳定的机械性能，因此，通常将其与高分子材料复合，通过一定的交联方式制备出水凝胶等高分子材料支架。

发明内容

针对现有技术的上述不足，本发明的目的在于提供了一种用于软骨缺损修复的丝胶蛋白藻酸盐软骨组织工程支架，解决自体软骨移植来源匮乏、供体损伤、缺损部位营养供给不足、降解速率与软骨组织再生速率不匹配、缺损部位纤维软骨再生导致二次手术等问题。本发明制备的丝胶蛋白藻酸盐软骨组织工程支架具有良好的生物相容性、低免疫原性和降解可控性、能与软骨修复匹配的良好的力学性能。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下的技术方案：一种用于软骨缺损修复的组织工程支架，所述支架是由丝胶蛋白、海藻酸钠、碳酸钙、葡萄糖酸内酯复合交联而成。

本发明还提供了上述适用于软骨的组织工程支架的制备方法，采用以下方法制得：

1)用去离子水溶解海藻酸钠，配制海藻酸钠溶液备用；

2)向海藻酸钠溶液中加入提取的丝胶蛋白，机械搅拌均匀，得到丝胶蛋白海藻酸钠混合溶液。

3)加入碳酸钙，机械搅拌均匀后，再加入葡萄糖酸内酯，机械搅拌均匀，将混合溶液转移至模具中，室温放置形成凝胶，转移至-20℃冰箱放置，之后转移至冷冻干燥机冷冻干燥，得到丝胶蛋白藻酸盐多孔固体支架。

4)放入DMEM培养基中浸泡，支架恢复凝胶状。

进一步，所述海藻酸钠溶液的浓度为1～3％(m/v)。

进一步，所述丝胶蛋白中不含蜡质物等杂质，丝胶蛋白的质量分数为0.5～3wt％。

进一步，所述步骤(3)中碳酸钙的质量分数为0.5～2wt％，葡萄糖酸内酯的质量分数为0.5～3wt％。

进一步，所述适用于软骨的组织工程支架及其制备方法中，丝胶蛋白、海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯的质量比为0.5～3:1～3:0.5～2:0.5～3。

进一步，所述步骤(4)中，DMEM培养基浸泡时长为1～6h，浸泡温度37℃±6℃。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明制备的一种适用于软骨的组织工程支架综合了丝胶蛋白、海藻酸钠二者的优点，其中，丝胶蛋白是蚕茧中的一种天然蛋白，有利于细胞黏附，并对软骨细胞增殖有明显的促进作用，因此更有利于软骨组织再生，同时丝胶蛋白具有低免疫原性和抗氧化活性，能够达到使受损软骨组织快速再生、功能恢复的作用；海藻酸钠是一种具有良好生物相容性的多糖，通过一定的交联方法，海藻酸钠水凝胶可拥有良好的力学性能。因此，二者协同作用，可使支架具有能促进和诱导软骨组织再生，良好的生物相容性及低免疫原性等优点。

2、本发明以丝胶蛋白、海藻酸钠为主要原料，通过复合交联制备得到软骨组织工程支架，在制备过程中，丝胶蛋白的氨基与海藻酸钠的羟基存在氢键结合，而不是简单的物理混合，因此，添加适当含量的丝胶蛋白，可提高支架的力学性能，使其有利于维持软骨细胞表型、结构稳定、具有回弹性。

3、丝胶蛋白具有良好的降解性，在体内降解过程中，支架降解率随丝胶蛋白含量的增加而加快，因而赋予支架降解可控性。相比其它同类软骨支架，丝胶蛋白藻酸盐软骨组织工程支架的降解速率与软骨组织生长速率相匹配，更适用于软骨缺损修复，具有良好的应用前景。

4、本发明制备的一种适用于软骨的组织工程支架，具有适合细胞生长的孔隙结构，利于引导、促进软骨组织再生。特别的，该支架原料易于获取，制备工艺简单，易于操作和控制，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为实施例1～4制备的软骨组织工程支架宏观形貌图；

图2为实施例1～4制备的软骨组织工程支架在200倍下的扫描电镜图；

图3为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的红外光谱图；

图4为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的力学性能图；

图5为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的体内降解图及曲线；

图6为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的体外细胞毒性评价；

图7为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的细胞粘附情况；

图8为实施例1～4制备的软骨组织工程支架的细胞增殖情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例中所用试剂未特别说明均市售可得。

一种适用于软骨的组织工程支架，采用以下方法制得：

实施例1

1)用去离子水溶解海藻酸钠，配制成浓度为2％(m/v)的海藻酸钠溶液备用；

2)向海藻酸钠溶液中按0.5％(m/v)的浓度加入提取的丝胶蛋白，室温下机械搅拌12h，得到丝胶蛋白海藻酸钠混合溶液。

3)按0.5％(m/v)的浓度加入碳酸钙，室温下机械搅拌2min，再按2.5％(m/v)的浓度加入葡萄糖酸内酯，室温下机械搅拌2min，将混合溶液转移至模具中，室温放置3h形成凝胶，转移至-20℃冰箱放置24h，之后转移至冷冻干燥机冷冻干燥3天，得到丝胶蛋白藻酸盐多孔固体支架。

4)将支架放入DMEM培养基中37℃下浸泡6h，支架恢复凝胶状。

实施例2～4与实施例1的操作步骤相同，仅丝胶蛋白的含量不同，具体见表1所示。

表1

1、图1为实施例1～4制备的软骨组织工程支架宏观形貌图，从图中可以看出，随着丝胶蛋白含量的增加，支架的形态也更加规整。本发明制备的软骨组织工程支架均能发生交联，加入丝胶蛋白并不改变其交联性能。

2、图2为实施例1～4制备的软骨组织工程支架在200倍下的扫描电镜图，由图可见支架内部有均匀的孔隙分布，这是由于支架在冷冻干燥过程中造成的，且溶胀后孔隙依旧存在。孔隙直径分布在100～500μm之间，且随丝胶蛋白含量的增加，孔隙直径逐渐减小。

3、将实施例3制备的软骨组织工程支架进行傅立叶红外扫描，结果如图3所示。从图中可以看出，本发明制备的软骨组织工程支架含有海藻酸钠、丝胶蛋白的特征峰，且相对于纯丝胶蛋白中的酰胺I与酰胺II键，支架中的酰胺键向高波方向移动，说明本发明制备的软骨组织工程支架存在氢键结合，而不是简单的物理混合。

4、将实施例1～4制备的软骨组织工程支架进行力学性能测试，其抗压强度和压缩模量如图4所示。当丝胶蛋白含量为1％(m/v)时，抗压强度最大，为215.77±6.658Kpa，与不含丝胶蛋白的对照组相比，具有显著性差异，这是由于材料间的氢键作用，使其拥有更大的抗压强度，但丝胶蛋白含量为2％(m/v)时，抗压强度明显下降，主要是由于添加过量的丝胶蛋白，其无规卷曲结构会影响支架的力学性能。此外，实施例1～3的压缩模量无显著性差异，均维持在40Kpa左右，有利于软骨细胞维持细胞表型。

5、将实施例1～4制备的软骨组织工程支架进行体内降解试验，结果如图5所示。从图中可以看出，丝胶蛋白的添加可显著提高支架的降解速率，丝胶蛋白含量为2％(m/v)时，支架在大鼠皮下埋植的第四周，可达到完全降解，因此，可以达到通过调节丝胶蛋白的含量调控降解速率的目的。

6、将实施例1～4制备的软骨组织工程支架进行体外细胞毒性试验，结果如图6所示。从表中可以看出，实施例1～4制备的软骨组织工程支架的细胞毒性分级均为0或1，体外细胞存活率均高于70％，根据国标标准，无体外细胞毒性。此外，由吸光度值可以看出，第三天时，丝胶蛋白含量为2％(m/v)的支架，细胞存活率显著高于对照组支架。

7、将实施例1～4制备的软骨组织工程支架进行细胞黏附试验，结果如图7所示。从结果中可得，丝胶蛋白的添加可显著提高细胞的黏附率。

8、将实施例1～4制备的软骨组织工程支架进行体外细胞增殖试验，结果如图8所示。结果表明，软骨细胞在支架中生长状况良好，软骨支架的三维立体及开放的孔隙结构，为细胞的养分及氧气供给提供了条件，使其在第3和第7天测得的吸光度值显著高于对照组。特别的，添加丝胶蛋白的支架，拥有更合适的孔隙结构，表现出更好的细胞增殖率。

最后需要说明，上述实施例仅为对本发明的较佳举例，而非对本发明的限制，在本发明的基础上做出的其它不同形式的变动与改进，仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (2)

1.一种适用于软骨的组织工程支架，其特征在于，所述支架是由丝胶蛋白、海藻酸钠、碳酸钙、葡萄糖酸内酯复合交联而成，丝胶蛋白、海藻酸钠、碳酸钙和葡萄糖酸内酯的质量比为0.5～3:1～3:0.5～2:0.5～3。

2.一种适用于软骨的组织工程支架的制备方法，其特征在于，采用以下方法制得：

(1)用去离子水溶解海藻酸钠，配制海藻酸钠溶液备用，海藻酸钠溶液的浓度为1～3％(m/v)；

(2)向海藻酸钠溶液中加入提取的丝胶蛋白，机械搅拌均匀，得到丝胶蛋白海藻酸钠混合溶液；

(3)加入碳酸钙，机械搅拌均匀后，再加入葡萄糖酸内酯，机械搅拌均匀，将混合溶液转移至模具中，室温放置形成凝胶，转移至-20℃冰箱放置，之后进行冷冻干燥，得到丝胶蛋白藻酸盐多孔固体支架；

(4)放入DMEM培养基中，以浸泡温度为37℃±6℃恒温浸泡，支架恢复凝胶状；

所述步骤(2)中丝胶蛋白为不含蜡质物等杂质，丝胶蛋白的质量分数为0.5～3wt％；

所述步骤(2)中机械搅拌时长为6～12h；

所述步骤(3)中碳酸钙的质量分数为0.5～2wt％，葡萄糖酸内酯的质量分数为0.5～3wt％。

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