CN101890184B - 一种软骨源性胶原海绵支架及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备软骨源性胶原海绵支架的方法以及由该方法得到的胶原海绵支架。本发明方法包括:粉碎、脱细胞、去端肽、溶解、交联,得到的胶原海绵支架具有良好的生物相容性,抗原性极低,可由来源于同种动物多个个体的软骨制备出均一的海绵支架,其孔径及孔隙率均可控制,可为软骨细胞、骨髓间充质干细胞提供适宜的生长增殖环境,特别对软骨缺损部位具有良好的修复效果,更利于标准化生产和临床使用。
Description
技术领域
本发明涉及一种支架,尤其涉及一种软骨源性胶原海绵支架的制备方法及由该方法制备得到的产品,属于生物医学材料领域。
背景技术
软骨损伤后,缺乏有效自身修复的能力。目前,临床上对关节软骨损伤治疗的手段不多,效果也不太理想。组织工程技术可能成为关节软骨缺损的修复新手段。天然生物支架材料具有细胞信号识别,促进细胞的黏附、增殖和分化、良好的生物相容性及良好的生物降解性等优点。其中,天然脱细胞生物支架材料主要利用同种或异种器官/组织,经理化处理得到的脱细胞基质材料。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是由细胞自身分泌组成的,并围绕在细胞周围,主要含有胶原蛋白、纤维蛋白粘连素、层粘连蛋白,层连素等。ECM不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点,而且对细胞的粘附、迁移、增殖、分化以及基因表达的调控有重要作用和显著影响。软骨的主要成分为II型胶原。
杨自权,何君仁,李刚等.可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究.中国修复重建外科杂志.2008;22(10):1232-1237
公开了一种采集新鲜牛膝关节,切取关节表面透明软骨,冻干后低温粉碎为软骨微粒,系列筛网筛选直径106~150μm的软骨微粒。胰酶、Triton X-100及低张Tris-HCl溶液联合作用进行脱细胞处理,冷冻干燥塑形,紫外线交联后制备脱细胞软骨基质材料。
杨强,彭江,卢世璧等.新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备.中国修复重建外科杂志.2008;22(3):359-363
公开了一种支架载体,取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100nm-5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。254nm紫外线和碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联。
康红军,卢世璧,张莉等.人脂肪干细胞复合脱细胞软骨基质支架在生物反应器中构建组织工程软骨.中国组织工程研究与临床康复.2007;11(10):1801-1804,1811
公开了一种软骨基质支架的制备方法,关节软骨冻干后经粉碎机粉碎,过筛,选取25-38μm大小的软骨微粒。在样品中先加入2.5g/L胰蛋白酶,37℃消化24h,再加入1%Triton X-100震荡72h。将软骨微粒和蒸馏水按1∶3的比例混合后滴加在模板中,置入冷冻干燥机冻干后行紫外线交联。紫外线照射8h完成。最后经25kGy 60Co辐照灭菌完成支架制备。
孔清泉等在中国专利CN200710090962.0,一种关节软骨生物支架材料及制备方法中公开了一种软骨支架,取新鲜猪软骨打碎,通过脱钙、脱脂、脱细胞等步骤后得到基质材料,再与II型胶原共混得到所述的软骨支架。
美国专利US2005159822报道了微粒脱细胞基质的制备方法。US2007014867该专利报道了脱细胞基质植入物的制备方法及其治疗关节软骨、骨或骨软骨缺损和损伤的方法。
现有技术公开的软骨支架材料均为软骨粉碎后的微粒通过脱脂、脱钙、脱细胞等方法得到的天然基质材料,以及在这种材料上再附加胶原等得到的复合材料,加上软骨供体差异,其制备的软骨支架材料是不均一的,可重复性差,质量难以控制,支架材料的不均一性导致在不同研究者的动物试验中,其修复缺损效果不一致,不具有可比性,难以在临床上大规模应用,更难以大规模的工业标准化生产。因此,本发明人致力于研究得到一种胶原海绵支架,其原料可以来源于同种或异种动物多个个体,其孔径及孔隙率均可控制的均一的海绵支架,更利于标准化生产和临床使用。
发明内容
本发明将软骨进行脱细胞去抗原性处理,制备软骨脱细胞基质,进一步采用酶解去除胶原端肽清除胶原的抗原性,酸溶后采用不同模具成型冻干,制备三维多孔海绵支架。
本发明提供的制备软骨源性胶原海绵支架的方法,包括以下步骤:
a、将新鲜软骨片冷冻干燥后粉碎,得到软骨微粒;
b、将软骨微粒脱细胞;
c、按体积比V/V 1∶5~1∶10将步骤b的脱细胞软骨微粒与0.5mol/L HAc(乙酸)混合,以胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比1~3∶100,加入胃蛋白酶,低温下连续搅拌12~24小时,离心取上清液,调节pH值至5.6,离心取沉淀,蒸馏水清洗,离心弃上清,得到软骨源性胶原;
d、按重量比1~3∶100,将步骤c的软骨源性胶原与0.05mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6小时,置于模具中,冷冻干燥36~60小时后取出,紫外线照射6~10小时,得到软骨源性胶原海绵支架。
上述方法还包括步骤:e、蒸馏水清洗步骤d得到的软骨源性胶原海绵支架,去除残留HAc,冻干,封装,辐照灭菌。
进一步的,步骤a所述的软骨为猪、牛或羊的耳软骨或肋软骨,软骨微粒小于90μm;所述冷冻干燥为,先-70℃预冻后,冷冻干燥机干燥24hr,然后冷冻粉碎30min。
步骤b中脱细胞的方法为:按体积比V/V 1∶8~1∶12将软骨微粒与0.25%胰酶与0.1%EDTA组成的胰酶EDTA混合液TNE混合,低温振荡12~30小时,离心,弃上清,PBS清洗,离心弃上清,得到软骨微粒备用。
优选的,步骤c中软骨微粒与乙酸的体积比为1∶10,胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比为2∶100,用1mol/L NaOH调节pH值。
步骤d中软骨源性胶原与0.05mol/L HAc的重量比为2∶100,模具形状根据软骨缺损修复所需形状进行适应性变化。
步骤e所述辐射灭菌采用25kGy 60Co照射。
另一方面,本发明还提供一种软骨源性胶原海绵支架,它是由权利要求1~6任意一项所述方法制备得到的,其形状与软骨缺损修复需要相适配。
更进一步的,它是通过选择模具制备得到的任意规格、形状的适于各种软骨缺损修复的软骨源性胶原海绵支架。
上述制备方法中,所用的软骨可为猪、牛或羊的耳软骨、关节软骨、肋软骨;步骤a中可取新鲜猪耳软骨在-70℃冰箱预冻后,置于真空冻干机冷冻干燥24hr,液氮冷冻粉碎机粉碎30min,8号筛网取粒径90μm以下软骨微粒备用;
步骤b中将上述软骨微粒脱细胞,方法是:按体积比V/V 1∶8~1∶12将软骨微粒与胰酶EDTA混合液(0.25%Trypsin+0.1%EDTA,TNE)混合,4℃振荡12~30hr,以1000g离心10min弃上清,反复PBS清洗3次,离心弃上清;
步骤b能有效去除软骨细胞,排除其导致的抗原反应,能充分保留软骨的II型胶原以及少量的GAG(糖胺聚糖)、透明质酸等促进软骨细胞生长的成分,II型胶原是软骨基质的主要成分,对软骨细胞的粘附、分化和迁移具有重要的促进作用,有利于软骨的形成,糖胺聚糖(GAG)、透明质酸可促进软骨细胞的粘附和扩增。
步骤c进一步采用胃蛋白酶去除胶原的端肽,按体积比1∶5~1∶10将软骨微粒与0.5mol/L HAc混合,加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比1~3∶100),4℃下连续搅拌12~24hr,110g离心5min,取上清液,用1mol/LNaOH调节pH值至5.6,弃上清,蒸馏水反复清洗3次,离心弃上清,得到软骨源性胶原。去端肽可进一步降低材料的抗原性,冷冻干燥以及灭菌处理都可降低材料的抗原性,从而制备主要成分为软骨源性胶原的海绵支架。
不同类型的胶原蛋白在结构上有很大差别,但所有的胶原蛋白均具有由三条α链组成的右手三螺旋结构。形成螺旋结构的三条α链可以是相同的,也可以是不同的,每条α链自身形成左手螺旋。三条链依次交错排列,以右手螺旋围绕中心轴线形成三螺旋结构。
三螺旋区域的氨基酸分别约有200或460个,非螺旋末端短肽起着与基质中其他蛋白交联以及在胶原蛋白分子内部共价交联的作用,非螺旋区域在不同类型结构和功能上的差异较大。三螺旋区具有抵抗如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的能力,只能被特异的胶原蛋白酶水解。
胃蛋白酶只对胶原蛋白的非螺旋区域(即端肽)起作用,对螺旋区不进行水解[Hickman D,Sima T J,Miles C A.Koopmans,Isinglass/colagen:denaturation and functionality.Journal of Biotechnology,2000(79):245-257],可通过文献公开的方法对其粘度及热力学稳定性试验进行检测,离心可弃去酶解后的非螺旋区。
步骤d是进一步酸溶解后成形,将步骤c的软骨源性胶原按W/W:1~3/100,与0.05mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6hr,获得凝胶状的软骨源性胶原,故可根据需要选择任意形状的模具,置于模具中,冷冻干燥后获得不同规格、形状的支架,适于各种软骨缺损的修复;-70℃冰箱预冻后置于冷冻干燥机内36~60小时后取出,紫外线照射6~10小时,得到软骨源性胶原海绵支架初产品。
采用紫外线辐照交联处理支架,可提高支架的力学性状。胶原在体内降解速度太快,为减慢降解速度以与细胞功能相匹配,有必要对其进行进一步交联。交联方法可分为化学交联、光交联和辐照交联。本发明采用紫外线辐照方法,可使胶原蛋白之间相互作用发生交联,从而提高材料的力学性状,与传统化学交联剂如戊二醛相比,紫外线交联后基质材料中无化学成分残留,对细胞的毒副作用较小。
软骨源性胶原海绵支架初产品经蒸馏水反复清洗3次,去除可能残存的HAc;冻干,封装,辐照灭菌,即可得到使用方便的软骨源性胶原海绵支架终产品。
步骤d中,成形时还可用公知方法,加入致孔剂Nacl以调节胶原海绵支架的孔径,进一步满足工业生产和临床使用的需要。
本发明克服了现有软骨脱细胞支架不均一,难以产业化的技术缺陷,提供了一种均一的软骨源性胶原海绵支架,原料来源广,适于标准化生产,质量可控,临床推广、使用方便。该软骨源性胶原海绵支架具有良好的生物相容性,其孔径及孔隙率可控,抗原性极低,可为软骨细胞、骨髓间充质干细胞提供适宜的生长增殖环境。
本发明的软骨支架具有良好的软骨细胞相容性,有利于软骨细胞的粘附、生长和增殖,有利于软骨形成,植入软骨缺损部位可获得良好的修复效果。
综上,本发明的软骨支架具有下述优点:
(1)软骨源性胶原海绵支架主要成分为II型胶原,含少量GAG及透明质酸,为软骨细胞生长提供了良好的支架;
(2)本发明的制备方法包括冻干、脱细胞、端肽去除以及灭菌等步骤,极大降低了支架的抗原成分,从而不会导致免疫反应;
(3)本发明克服了现有软骨脱细胞支架不均一的技术缺陷,提供了一种均一的软骨源性胶原海绵支架;
(4)在置于模具冷冻干燥时可根据需要选择不同的模具从而获得不同规格的支架,适于各种软骨缺损的修复;
(5)本发明的方法成本低廉,适于推广。
以下通过实施例形式的具体实施方式,对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1本发明软骨源性胶原海绵支架的外观。
图2本发明软骨源性胶原海绵支架扫描电镜图(SEM×400),支架孔隙率高(90.16%),空隙互相交通,本发明制备的材料结构均一,现有技术方法制备的支架中有明显颗粒。
图3公开文献(杨自权,何君仁,李刚等.可塑形脱细胞软骨基质材料的制备及性状研究.中国修复重建外科杂志.2008;22(10):1232-1237)得到的软骨基质材料的HE染色图和扫描电镜图,图A:HE染色示脱细胞软骨基质材料由不规则的红染软骨微颗粒组成,表面粗糙;图B:扫描电镜示脱细胞软骨基质材料呈多孔状海绵结构,孔径30~150μm,孔径大小不一,有明显颗粒。
图4本发明软骨源性胶原海绵材料组织学观察:4A:HE染色(×200)见材料结构均一,无细胞残留;4B:MASSON染色(×200)示材料主要由胶原构成。
图5本发明软骨源性胶原海绵大鼠体内植入8周(HE×100),表明本发明所制备的支架不引起免疫排斥(可以看到周围组织长入材料,有散在的淋巴细胞和浆细胞,巨噬细胞及分叶状粒细胞极少,材料周围没有发现明显的纤维包裹层)
具体实施方式:
实施例1:制备本发明的软骨源性胶原海绵支架
1、取新鲜猪耳软骨在-70℃冰箱预冻后,置于真空冻干机冷冻干燥24hr,液氮冷冻粉碎机粉碎30min,8号筛网取粒径90μm以下软骨微粒;
2、按体积比V/V 1∶8~1∶12将软骨微粒与胰酶EDTA混合液(0.25%Trypsin+0.1%EDTA,TNE)混合,4℃振荡12~30hr,以1000g离心10min弃上清,反复PBS清洗3次,离心弃上清;
3、按体积比1∶10将软骨微粒与0.5mol/L HAc混合,加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比2∶100),4℃下连续搅拌12~24hr。
4、110g离心5min,取上清液,用1mol/L NaOH调节pH值至5.6,弃上清,蒸馏水反复清洗3次,离心弃上清,得到软骨源性胶原。
5、将步骤4的软骨源性胶原按W/W:2/100,与0.05mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6hr,置于所需形状的模具中,-70℃冰箱预冻后置于冷冻干燥机内48h后取出。
6、紫外线照射8hr.
7、蒸馏水反复清洗3次,去除可能残存的HAc;冻干,封装,辐照灭菌。
本实施例制备的软骨源性胶原海绵,呈白色多孔海绵状,质地均一;模具塑形后形态规则,不易变形(图1)。
扫描电镜观察:材料呈多层蜂巢样结构,支架孔径及大小分布较均匀(图2),并且孔隙相互贯通,吸水性:2029%±253%,经Image-Pro Plus(v6.0)图像分析软件分析,孔径:(90.66±21.26)μm,支架孔隙率:90.10%±2.42%;
现有技术制备的产品扫描电镜示脱细胞软骨基质材料呈多孔状海绵结构,孔径30~150μm,孔径大小不一,有明显颗粒(图3B),其平均孔隙率89.37%。
组织学观察:HE染色(×200)见材料结构均一,无细胞残留(图4A);MASSON染色(×200)示材料主要由胶原构成(图4B);
现有技术制备的产品HE染色示脱细胞软骨基质材料由不规则的红染软骨微颗粒组成,表面粗糙(图3A);
实施例2:制备本发明的软骨源性胶原海绵支架
1、取新鲜猪肋软骨在-70℃冰箱预冻后,置于真空冻干机冷冻干燥24hr,液氮冷冻粉碎机粉碎30min,8号筛网取粒径90μm以下软骨微粒;
2、按体积比V/V 1∶8~1∶12将软骨微粒与胰酶EDTA混合液(0.25%Trypsin+0.1%EDTA,TNE)混合,4℃振荡12~30hr,以1000g离心10min弃上清,反复PBS清洗3次,离心弃上清;
3、按体积比1∶5将软骨微粒与0.5mol/L HAc混合,加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比3∶100)。4℃下连续搅拌24hr。
4、110g离心5min,取上清液,用1mol/L NaOH调节pH值至5.6,弃上清,蒸馏水反复清洗3次,离心弃上清,得到软骨源性胶原。
5、将步骤4的软骨源性胶原按W/W:2/100,与0.05mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6hr,置于所需形状的模具中,-70℃冰箱预冻后置于冷冻干燥机内48h后取出。
6、紫外线照射8hr.
7、蒸馏水反复清洗3次,去除可能残存的HAc;冻干,封装,辐照灭菌。
实施例3:制备本发明的软骨源性胶原海绵支架
1、取新鲜牛耳软骨在-70℃冰箱预冻后,置于真空冻干机冷冻干燥24hr,液氮冷冻粉碎机粉碎30min,8号筛网取粒径90μm以下软骨微粒;
2、按体积比V/V 1∶8~1∶12将软骨微粒与胰酶EDTA混合液(0.25%Trypsin+0.1%EDTA,TNE)混合,4℃振荡12~30hr,以1000g离心10min弃上清,反复PBS清洗3次,离心弃上清;
3、按体积比1∶10将软骨微粒与0.5mol/L HAc混合,加入胃蛋白酶(胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比1∶100)。4℃下连续搅拌24hr。
4、110g离心5min,取上清液,用1mol/L NaOH调节pH值至5.6,弃上清,蒸馏水反复清洗3次,离心弃上清,得到软骨源性胶原。
5、将步骤4的软骨源性胶原按W/W:3/100,与0.05mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6hr,置于所需形状的模具中,-70℃冰箱预冻后置于冷冻干燥机内48h后取出。
6、紫外线照射8hr.
7、蒸馏水反复清洗3次,去除可能残存的HAc;冻干,封装,辐照灭菌。
实施例4软骨源性胶原海绵支架的体内植入及组织学评价
取健康成年SD大鼠24只,雌雄各半,体重180-200g。在脊柱两旁各选三点,同侧实验点相距3cm,在10%水合氯醛腹腔麻醉后切开皮肤、在皮下筋膜浅面用钝器解剖法制备皮下囊,无菌条件下将实验组和对照组材料(I型胶原)分别植入到大鼠脊柱两侧皮下,每个囊内植入一个植入物,植入物之间不能相互接触。分别于术后1、2、4、8周取出植入物各6个。软组织标本在4%多聚甲醛固定液中固定24小时,石蜡包埋,进行HE及Masson染色,显微镜下观察。
组织学观察结果:材料经HE染色见软骨细胞消失,整体呈纤维网状结构,未见细胞碎屑及蓝染的核物质(图4A),Masson染色见大量的胶原纤维存在(图4B)。
皮下植入试验:
1周:实验组见以淋巴细胞和浆细胞为主的炎性细胞浸润,较大的脱细胞软骨颗粒材料周围血管化明显,纤维增生不明显;对照组以单核巨噬细胞和粒细胞为主的炎性浸润,周围血管增生可见。
2周:实验组炎性细胞主要聚集在较大的软骨粒周围,可观察到材料的降解现象,材料周围及内部可见大量血管生成,成纤维细胞长入。对照组可见组织界面明显,交界处巨噬细胞和淋巴细胞为主的炎性细胞大量聚集。
4周:实验组材料降解明显,炎性细胞浸润减轻且分散;对照组交界面组织侧纤维增生活跃,材料侧炎性细胞明显浸润。
8周:实验组仍可以看到少量残余材料结构,周围组织长入材料,有散在的淋巴细胞和浆细胞,巨噬细胞及分叶状粒细胞极少,材料周围没有发现明显的纤维包裹层,材料内均匀分布成纤维细胞(图5);对照组炎性细胞浸润更明显,材料周围有纤维包裹层,材料降解慢,血管化不明显。
结果表明:本发明支架无免疫排斥反应。
实施例5支架细胞毒性评价:
采用MTT法检测支架浸提液对细胞的毒性。将无血清DMEM培养液与材料采用国家标准制备浸提液,并用DMEM和FBS配成含10%FBS的50%及100%浓度的浸提液。胎兔股骨取骨髓,采用密度梯度离心法体外分离培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代细胞进行实验。将200μl密度为1.0×104/ml的BMSCs种植到96孔板上,待细胞贴壁后分别与50%(B组)及100%(C组)浓度的浸提液,以及DMEM培养液作对照(A组)。每天观察两种浓度浸提液及对照DMEM各6孔,于培养后2,4,6d每孔加入20μl MTT溶液37℃下培养4h后,加入150μl DMSO,酶联免疫检测仪在570nm测定吸光度(A)值。
表1.不同浓度浸提液细胞增殖活力(n=6,X±S)
注:
1:RGR=(实验组吸光值-空白对照)/(正常对照组吸光值-空白对照)2:单纯DMEM培养液组3:50%浸提液组4:100%浸提液组
Δ与不含浸提液对照组比较P值>0.05,*与不含浸提液对照组组比较P值<0.05
结果表明:本发明的支架无细胞毒性,适于细胞粘附生长和增殖。
上述实验表明,本发明得到的软骨源性胶原海绵支架结构均一,制备方法简单,成本低廉,生产原料来源限制小,适于工业标准化生产,临床使用方便,为临床提供了一种可靠的、修复效果良好的软骨缺损修复材料。
Claims (2)
1.一种制备软骨源性胶原海绵支架的方法,包括以下步骤:
a、将新鲜软骨片冷冻干燥后粉碎,得到软骨微粒;
b、将软骨微粒脱细胞;
c、按体积比V/V 1:5~1:10 将步骤b的脱细胞软骨微粒与0.5mol/L HAc混合,以胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比1~3:100,加入胃蛋白酶,低温下连续搅拌12~24小时,离心取上清液,调节pH值至5.6,离心取沉淀,蒸馏水清洗,离心弃上清,得到软骨源性胶原;
d、按重量比1~3:100,将步骤c的软骨源性胶原与0.05 mol/L HAc混合,低温下连续搅拌2~6 小时,置于模具中,冷冻干燥36~60小时后取出,紫外线照射6~10小时,得到软骨源性胶原海绵支架;
步骤b中脱细胞的方法为:按体积比V/V 1:8~1:12将软骨微粒与0.25%胰酶与0.1%EDTA组成的胰酶EDTA混合液TNE混合,低温振荡12~30小时,离心,弃上清,PBS清洗,离心弃上清,得到软骨微粒备用。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征是:还包括步骤:
e、蒸馏水清洗步骤d得到的软骨源性胶原海绵支架,去除残留HAc,冻干,封装,辐照灭菌。
3、根据权利要求1所述的方法,其特征是:步骤a所述的软骨为猪、牛或羊的耳软骨或肋软骨,软骨微粒小于90μm;所述冷冻干燥为,先-70℃预冻后,冷冻干燥机干燥24hr,然后冷冻粉碎30min。
4、根据权利要求1所述的方法,其特征是:步骤c中软骨微粒与HAc的体积比为1:10,胃蛋白酶与软骨微粒湿重重量比为2:100,用1mol/L NaOH调节pH值。
5、根据权利要求1的所述的方法,其特征:步骤d中软骨源性胶原与0.05 mol/L HAc的重量比为2:100,模具形状根据软骨缺损修复所需形状进行适应性变化。
6、根据权利要求2所述的方法,其特征是:步骤e所述辐射灭菌采用25kGy 60Co照射。
7、一种软骨源性胶原海绵支架,其特征是:其由权利要求1~6任意一项所述方法制备得到的。
8、根据权利要求7所述的胶原海绵支架,其特征是:其形状与软骨缺损修复需要相适配。
9、根据权利要求7或8所述的胶原海绵支架,其特征是:其为通过选择模具制备得到的任意规格、形状的适于各种软骨缺损修复的软骨源性胶原海绵支架。
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