CN102229646B - 骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用 - Google Patents

骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用，属于生物制药领域。所述筛选方法包括以下步骤：采用噬菌体展示技术分别进行人成纤维细胞阴性筛选和骨髓间充质干细胞的阳性筛选；筛选之后，提取骨髓间充质干细胞，裂解细胞，再提取和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体片段，对其进行测序，即可获取对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽片段。本发明能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力，在组织工程软骨修复领域里有着深远的意义和广泛的应用前景。

Description

骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学领域，特别涉及一种骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列、筛选方法及应用。
背景技术
经过近20年的发展，组织工程(Tissue Engineering，TE)术已经广泛地应用于临床的各个领域，包括骨组织、软骨、神经、血管、皮肤以及胃肠道和泌尿生殖系统的再生和修复。在组织工程的发展过程中，针对各种组织的支架的不断改进和更新是关键，包括材料的更新、制作方法的改进以及构建理念的不断创新。而近期组织工程学另一个比较明显的理念上的转变，就是“化繁为简”，即与其在体外通过各种复杂的手段和技术来尽可能地去模拟正常组织的组成，然后再植入体内，不如为人体提供一个自我修复的支架，让人体这个天然的“生物反应器”依附这个支架来进行自我修复。因为人体内环境是十分复杂的，所以才会导致很多实验设想与结果相差很大，并且支架植入步骤的繁复也会限制其在临床上的推广和应用。但这样的支架就要求根据需要来进行特定的修饰，从而起到诱导特定细胞粘附、增殖和分化的作用。
正常组织中，细胞周围基质对细胞的生物功能具有重要的意义，通过基质中的蛋白或多肽分子的功能结构域与细胞表面受体结合，激活细胞内复杂的信号通路，对细胞的基因表达、粘附、迁移、增殖以及分化等生物学功能进行调控，而这些功能域也许仅仅只有几个氨基酸片段的长度。这种调控方式，为我们构建活性多肽序列，对组织工程支架进行表面修饰，以模拟细胞周围基质对细胞本身的调控功能提供了理论依据。采用不同类型的多肽对支架进行修饰，也赋予支架不同的生物功能。有研究表明，采用细胞周围基质蛋白对人工支架进行表面修饰，可提高细胞对支架的贴附率和增殖率，进一步的研究发现，在这些细胞周围基质蛋白中，纤粘连蛋白(fibronectin)是促进细胞贴附、迁移的主要成分。实际上，真正影响细胞生物功能的只是纤粘连蛋白中几个氨基酸片段构成的功能域。例如，采用RGD多肽对支架进行修饰，即可提高肌细胞对支架的贴附率，也提高了细胞的增殖效率，说明仅需三个氨基酸片段长度的结构域就能对细胞功能产生显著影响。Duan等4人也有类似的发现，利用角膜细胞特异亲和性多肽序列对支架进行修饰后，可提高角膜上皮细胞对支架的贴附率，并诱导角膜细胞在支架上分层排列，出现类似于生理情况下的组织结构。同时，利用多肽对支架进行修饰，也可调控蛋白分子在组织工程支架上的聚集，Ryadnov等人利用多种多肽片段构建的小分子蛋白对支架进行修饰，利用多肽对特定蛋白分子表现出的亲和性，赋予支架捕获这些蛋白分子的功能，使蛋白分子在支架周围富集，进而调控支架内细胞的生物学功能。Shah等人利用TGF-β高度亲和的多肽序列对多肽兼性分子纳米支架(PA)进行修饰，极大提高了支架对软骨缺损的修复效果，这种支架对干细胞向软骨定向分化的诱导能力大大增强，粘多糖的表达程度也显著提高。说明多肽修饰后的支架，可装载、保护，并缓释生长因子，这种缓释作用，与支架的降解时间以及亲和多肽对支架的修饰程度密切相关，当修饰程度为5％-10％时，植入体内第4周后，支架仍能发挥优良的生长因子缓释功能。而且最关键的是，装载外源性TGF-β和没有转载外源性TGF-β的支架对软骨缺损的最终修复效果没有显著差别，这说明这种TGF-β亲和多肽修饰后的支架，在没有装载外源性生长因子的情况下，可大量富集内源性的TGF-β生长因子，改善支架内的微环境，实现诱导干细胞向软骨分化的功能。
骨髓间充质干细胞做为一种存在骨髓组织中，具有多向分化潜能的干细胞早在上世纪六十年代就由Friedenstein等提出，并对其细胞学特性进行了一定的研究，之后每年都有大量的相关研究结果发表，尤其是近二十年，随着组织工程和再生医学的迅速发展，对种子细胞的需求促使对各种干细胞的研究更加深入。目前，骨髓间充质干细胞的多向分化潜能已经被大量的研究所证实，并且因为其所具有的增殖活性强以及多向分化的特性，已被广泛地应用于心肌、神经、肝脏、胰腺、骨组织以及软骨再生等组织工程领域的各个角落。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：现有技术中还没有一种能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法。
发明内容
本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供一种能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的筛选方法。
本发明另一目的提供骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的氨基酸序列。
本发明又一目的提供骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的应用。
为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：
一种利用改进的噬菌体展示技术筛选能够提高生物材料对于骨髓间充质干细胞特异性亲和能力的骨髓间充质亲干细胞亲和多肽的方法，包括以下步骤：
(1)人骨髓间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养：通过人骨髓间充质干细胞的原代培养并传一代，获得阳性筛选细胞；通过人成纤维细胞的原代培养并传十代以上，获得阴性筛选细胞；
(2)阴性筛选：在阴性筛选细胞中加入噬菌体文库，去除噬菌体文库中与P10代ACL成纤维细胞结合的多肽片段；
(3)阳性筛选：在阳性筛选细胞中加入步骤(2)中阴性筛选后得到的噬菌体多肽文库菌液，获得经阳性筛选后的骨髓间充质干细胞，该细胞结合了噬菌体文库中与其特异性结合的亲和多肽片段；
(4)噬菌体扩增：提取步骤3所得骨髓间充质干细胞，制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增；
(5)测量扩增后的噬菌体提取液的滴度，4℃保存；
以上(1)～(5)步骤重复4轮，第1轮筛选加入噬菌体文库原液，以后每轮加入前一轮细胞裂解液扩增后的噬菌体提取液；
(6)提取每一轮所得的和骨髓间充质干细胞特异性亲和的噬菌体DNA片段，进行测序，筛选出对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列：即序列表中的SEQ ID NO.1EPLQLKM，其DNA序列如序列表中的SEQ ID NO.2所示：
GAGCCGCTGCAGCTGAAGATG。
本发明的另一技术方案是骨髓间充质亲干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的应用及其修饰方法，包括以下步骤：将选出的骨髓间充质干细胞亲和多肽的3’C末端，连接一个半胱氨酸(C)，利用该半胱氨酸(C)残基与聚己内酯(PCL)电纺丝膜经氨化后的表面-NH2共价耦联，使得PCL纳米纤维膜支架具有特异性富集骨髓间充质干细胞的性能。
具体包括以下步骤：
1)将PCL纳米纤维膜置于异丙醇配置的10％w/v的1，6-己二胺中，37℃，放置1h；
2)通过交联剂(4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-SMCC))4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧基磺基琥珀酰亚胺将PCL纳米纤维膜表面的氨基和亲和多肽相连接。
更具体的步骤为：
1)将PCL纳米纤维膜修剪成与24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入24孔板的孔内，每孔加入500μl的10％w/v的1，6-己二胺/异丙醇溶液，37℃，放置1h；
2)去离子水漂洗3～5遍，双蒸水漂洗3～5遍，PBS(0.01M，pH 7.4)冲洗3遍；
3)每孔加入400μl的交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(1mg/ml SMCC，Thermo公司)，室温下放置1h；
4)用含EDTA的缓冲液(500ml 0.01M/pH 7.4的PBS+18.612gEDTA，pH 7.2～7.5)冲洗3遍
5)加入0.1mg/ml多肽溶液(用上述含EDTA的缓冲液配置)，每孔400μl，4℃过夜；
6)去离子水漂洗3遍，-20℃预冻，真空冻干后4℃保存。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：
1、通过噬菌体展示技术获得骨髓间充质干细胞特异性的亲和多肽片段，使之能够靶向性地和骨髓间充质干细胞高度亲合。
2、通过将亲和多肽片段与PCL电纺丝膜进行共价耦联，从而对PCL纳米纤维膜表面进行修饰，使之能够特异性地富集骨髓间充质干细胞，使得该材料作为支架在体内进行软骨再生修复的时候，能够持续性地粘附骨髓间充质干细胞，并产生正常细胞外基质(ECM)，从而达到更好的修复效果。
3、在对该多肽进行种属特异性鉴定的过程中发现该多肽并无明显的种属特异性，所以该亲和多肽序列还可广泛应用于各种细胞学实验和动物实验中，作为一种筛选骨髓间充质干细胞的亲和载体，可以更加高效地筛选、纯化骨髓间充质干细胞。
附图说明
图1是本发明实施例1中提供的人骨髓间充质干细胞原代培养结果图；
图2a、图2b和图2c是本发明实施例1的噬菌体滴度测定中提供的噬菌体蓝斑实验结果；将倍比稀释后的噬菌体10μl加入200μl大肠杆菌菌液中孵育1-5分钟，加入顶层培养基迅速混匀，平铺四环素抗性的LB-tet培养板上，37℃，5％CO2过夜，计算平板上的噬菌体蓝斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。并挑取单个蓝斑在LB/大肠杆菌培养液中扩增，提取噬菌体DNA测序。图2a：蓝斑数量100；图2b、：蓝斑数量101；图2c：蓝斑数量102。
图3是本发明实施例1的噬菌体亲和多肽筛选中提供的四轮筛选的噬菌体的回收率；
图4a是本发明实施例2提供的人的MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；
图4b是针对图4a的的荧光强度的定量分析结果图；
参见图4a和图4b，1nM的FITC荧光标记的骨髓间充质干细胞亲和多肽(BMSC-affinitypeptide sequence)和错配多肽(Scramble peptide)分别与骨髓间充质干细胞孵育1小时后，进行流式细胞分析；由图4b可见，FITC标记的错配多肽与骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为6；FITC标记的亲和多肽与骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为189，亲和多肽组的荧光强度(189)远高于错配多肽组的荧光强度(6)；提示骨髓间充质干细胞亲和多肽对骨髓间充质干细胞的亲和性远高于错配多肽对骨髓间充质干细胞的亲和性。
图5a是是本发明实施例2提供的大鼠的MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；
图5b是针对图5a的的荧光强度的定量分析结果图；
图5c是是本发明实施例2提供的家兔的MSC亲和多肽的流式细胞检测结果图；
图5d是针对图5c的的荧光强度的定量分析结果图；
参见图5a和图5b，大鼠(Rat)：FITC标记的错配多肽与大鼠骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为5；FITC标记的亲和多肽与大鼠骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为65。亲和多肽组的荧光强度(65)远高于错配多肽组的荧光强度(5)；
参见图5c和图5d，家兔(Rabbit)：FITC标记的错配多肽与家兔骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为4；FITC标记的亲和多肽与家兔骨髓间充质干细胞共同孵育，平均荧光强度为74。亲和多肽组的荧光强度(74)远高于错配多肽组的荧光强度(4)；
其中，图4a、图5a和图5c中，左边的峰代表的是错配多肽，右边的峰代表的是亲和多肽。
图6是本发明实施例2提供的激光共聚焦显微镜观察结果；标记FITC的亲和多肽和错配多肽分别与骨髓间充质干细胞共同孵育1h，鬼笔环肽复染细胞骨架，hochest复染胞核，激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况；结果显示亲和多肽序列(EPLQLKM)对于骨髓间充质干细胞的亲和力显著高于错配多肽(MLKPLEQ)；
图7是本发明实施例3提供的利用共价结合方式，将亲和多肽片段连接到聚己内酯(PCL)纳米电纺丝纤维膜表面的示意图；
图8是本发明实施例3提供的的骨髓间充质干细胞特异性多肽修饰的PCL纳米电纺丝纤维膜在激光共聚焦显微镜下观察的多肽连接；
图中显示：连接了FITC标记的亲和多肽片段(EPLQLKM)的聚己内酯(PCL)纳米纤维，可见绿色荧光强度较高，提示较高的连接效率；
图9a和图9b是本发明实施例3提供的骨髓间充质干细胞特异性多肽修饰PCL纳米电纺丝支架的效果；图9a为连接了骨髓间充质干细胞亲和多肽片段；图9b为连接了错配多肽片段；
分别将连接了骨髓间充质干细胞亲和多肽片段(EPLQLKM)和错配多肽片段(MLKPLEQ)的聚己内酯(PCL)纳米纤维膜置于骨髓间充质干细胞悬液中，共同培养，结果显示：连接了亲和多肽的PCL纳米纤维膜相较连接错配多肽的PCL纳米纤维膜更有利于骨髓间充质干细胞的粘附和生长。(蓝色1：hochest-胞核；绿色2：连接多肽的PCL纳米纤维膜；红色3：鬼笔环肽-细胞骨架)。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例1
噬菌体展示技术筛选骨髓间充质干细胞亲和多肽序列：
(1)人骨髓间充质干细胞以及人成纤维细胞原代培养：
a.人骨髓间充质干细胞原代培养及传代
从接受全膝关节置换(TKA)的患者手术过程中获取人骨髓组织，放入含有K2EDTA抗凝的采血管中(BD公司)混匀，用PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2次，将骨髓组织均匀铺于培养皿底，加入含10％FBS的DMEM(LG)完全培养基，观察24～48小时，见有贴壁细胞后，换液，继续培养，之后2～3天换一次液，并传一代。做为阳性筛选细胞(参见图1)。其中DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。
b.人成纤维细胞原代培养及传代
从接受全膝关节置换(TKA)的患者手术过程中获取人前交叉韧带组织，PBS(0.01M，pH 7.4)冲洗，去除表面的膜性组织及血凝块，用眼科剪将其剪碎，37℃下胰酶消化30min去除杂质，加入完全培养基中止消化，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2次，再加入0.2％I型胶原酶(用DMEM配制)，37℃消化2-3小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min，直到组织块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，加入等体积的完全培养基以中和胶原酶，消化后的细胞悬液离心，弃上清液后，用完全培养基重悬、铺板，并传十代以上。做为阴性筛选细胞。
(2)阴性筛选(去除与P10代人ACL成纤维细胞结合的多肽片段)：
a.取一皿P10代ACL细胞，用胰酶消化、PBS(0.01M，PH 7.4)洗涤2～3遍；加入blocking buffer(封闭缓冲液，0.1M NaCO3(pH8.6)，5mg/ml BSA，0.02％NaN3)重悬于1ml EP管中，4℃封闭1h，减少非特异性结合；
b.离心(1500rpm，5min)，弃上清液，加入0.5ml的无血清DMEM(HG)，细胞计数(2×106)；
c.加入1μl的噬菌体文库(Ph.D.-7TM Phage Display Library，NEB)(1×1011PFU/10μl噬菌体原液，100μl)，室温放置30min；
d.离心(10000rpm，5min)，吸取上清液，得到阴性筛选后的噬菌体多肽文库菌液，移至新EP管中备用；
(3)阳性筛选：
a.取一皿P1代人来源BMSC(骨髓间充质干细胞)，用胰酶消化，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2～3遍；加入blocking buffer重悬于1ml EP管中，4℃封闭1h，减少非特异性结合；
b.离心，弃上清液，加入0.5ml的无血清DMEM(HG)，细胞计数(2×106)；
c.加入步骤(2)所得阴性筛选后的噬菌体多肽文库菌液，室温放置30min；
d.离心(10,000rpm，5min)，弃上清液，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤2～3遍，得到阳性筛选后的细胞；；
(4)噬菌体扩增(参见Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit操作手册)：
a.将步骤(3)所得阳性筛选后的细胞制备细胞裂解液，对其内的噬菌体滴度进行扩增：将细胞裂解提取液加入20ml ER2738培养液中(处于early-log)，在37℃摇晃，孵育4.5小时；
b.将步骤1)中的培养液加入离心管中，4℃下，10,000rpm离心10分钟，将上清移入新管中，再次离心(10,000rpm，10min)；
c.抽取80％上清，移到新离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，让噬菌体在4℃下沉淀过夜；
d.次日，10,000rpm，4℃下，将噬菌体菌液离心，15分钟，弃上清，再次离心(10,000rpm，10min)，弃上清液；
e.用1ml TBS(50mM Tris-HCl(pH7.5)，150mM NaCl)重新悬浮噬菌体沉淀，4℃下，离心5分钟。
f.将上清移到新离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次沉淀。在冰上孵育60分钟。4℃，10,000rpm离心10分钟，弃上清液，重新短暂离心，再次弃上清。
g.用200μl的TBS(pH7.5，含0.02％NaN3)重新悬浮沉淀，离心1分钟，将上清移到新离心管中。此即为扩增后的噬菌体提取液。
(5)噬菌体滴度测定(参见Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit操作手册)：
a.接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，37℃，250rpm摇床孵育至对数中期(OD600：～0.5)。
b.微波炉加热融化上层琼脂，分成3ml/份分装到灭菌试管中，每个稀释度的噬菌体一管。保存于45℃备用。
c.37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释梯度取一个平板备用。
d.用LB培养液对噬菌体进行10倍比列稀释。建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
e.当大肠杆菌菌液达对数中期，分成200μl/等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度用一管。
f.每管大肠杆菌菌液中分别加入10μl不同稀释倍数的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5min。
g.将噬菌体感染的大肠杆菌菌液加入45℃预温的顶层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
h.待平板冷却5min后，倒置于37℃孵箱，培养过夜。
i.检查平板，计数有～102个噬菌斑的平板上的斑数(参见图2a、图2b和图2c)。然后，用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。
以上(1)～(5)步骤重复4轮，然后对每一轮的噬菌体提取液进行测序。
(6)噬菌体多肽片段测序(参见Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit操作手册)：
a.噬菌斑的扩增：将大肠杆菌扩增菌液(OD：0.5)按1∶100用LB培养液稀释，每个待测序的噬菌斑克隆分装一管，1ml/管；
b.用灭菌牙签或吸头，在菌斑数在10-100之间的平皿内挑取单克隆蓝色菌斑，放入上述1ml培养管中。共挑取20个单克隆。
c.37℃，250rpm摇床，孵育4.5-5h；
d.孵育后的噬菌体菌液转入离心管中，离心30秒。上清移入新管，再离心。吸取80％上清液转入新离心管，此即为扩增噬菌体贮液，可以4℃贮存几个星期而对滴度影响不大。长期贮存应用灭菌甘油1∶1稀释后，-20℃贮存；
e.从上述扩增的单克隆噬菌体菌液中，吸取500μl到新离心管中；
f.加200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温放置10min；
g.离心10min，弃上清液，再次短暂离心(10000rpm，30sec)吸去残余上清液；
h.噬菌体沉淀彻底重悬于100μl碘化物缓冲液中，加入250μl乙醇。室温孵育10min
i.离心10min，弃上清液。用70％的乙醇洗沉淀，短暂真空干燥；
g.沉淀重悬于20μl双蒸水中，即为噬菌体模版DNA溶液；
k.测序，经过四轮筛选，得到一组对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列。
本发明实施例试验结果：
a、噬菌体亲和多肽筛选：利用噬菌体展示文库(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide LibraryKit；New England Biolabs)，一共进行了4轮筛选，每次筛选后，测定获取噬菌体滴度，乘以菌液总体积，即为筛选后回收的噬菌体总量，同时，将筛选后的噬菌体进行扩增，采用扩增后的噬菌体进行下一轮筛选。第一轮筛选：加入1μl的噬菌体原液(滴度：1×1013PFU/10μl)，裂解细胞后，提取噬菌体滴度为1×103PFU/10μl，将提取的噬菌体扩增后，噬菌体滴度为1×1011PFU/10μl；第二轮筛选：加入扩增后的噬菌体10μl，筛选后，回收噬菌体滴度为4.1×104PFU/10μl，扩增后滴度为1×1011PFU/10μl；第三轮筛选：筛选后，回收噬菌体滴度为5.6×106PFU/10μl，扩增后滴度为1×1011PFU/10μl；第四轮筛选：筛选后，回收噬菌体滴度为3.0×105PFU/10μl。
表1：噬菌体回收率：
Figure BDA0000067118050000091
参见图3，经四轮筛选后获取包含骨髓间充质干细胞亲和噬菌体(EPLQLKM，计算噬菌体回收率，并与噬菌体原液进行比较。含亲和多肽噬菌体回收率：5.60E-06；噬菌体原液的回收率：1.00E-09。获取的骨髓间充质干细胞亲和噬菌体体与噬菌体原液相比较，对骨髓间充质干细胞的亲和性提高了5600倍(5.60E-06/1.00E-09)。
b、多肽序列筛选结果：
每轮筛选之后，采用筛选获取的噬菌体菌液进行滴度测定，从蓝斑数在10～100之间的xgal培养板上随机挑取20个菌落各在1ml大肠杆菌菌液中扩增，提取噬菌体DNA进行测序。经过四轮筛选，得到一组对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列：EPLQLKM(表2)。
表2：多肽序列筛选结果
由上表的测序结果可知，其中第二轮测定的20个噬菌体单克隆中，3个克隆的多肽序列为：EPLQLKM；第三轮测定的20个噬菌体单克隆中，7个克隆的多肽序列为：EPLQLKM；第四轮测定的20个噬菌体单克隆中，10个克隆的多肽序列为：EPLQLKM。第一轮筛选结果缺乏特异性，所以未检测洗脱液中的噬菌体所携带的多肽片段。因此，四轮筛选后，获得对骨髓间充质干细胞具有高度亲和性的多肽序列：EPLQLKM。
实施例2
骨髓间充质干细胞亲和多肽对人以及大鼠和家兔来源骨髓间充质干细胞的亲和性鉴定细胞层面亲和性鉴定：
(1)流式细胞分析
方法：取一皿骨髓间充质干细胞，用0.05％胰蛋白酶-0.02％EDTA，消化5分钟，直到细胞完全脱落，收集悬液，1000rpm，离心5分钟，弃上清液，再次用PBS(0.01M，pH 7.4)悬浮细胞，重复3次，400目滤网过滤细胞后，再次离心(2000rpm，5min)，0.1mlPBS(0.01M，pH 7.4)重新悬浮细胞后，加入1nM的SMSC亲和多肽(FITC-EPLQLKMC)和错配多肽(FITC-MLKPLEQC)，室温孵育1h，离心(2000rpm，5min)，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤3遍，0.5mlPBS(0.01M，pH 7.4)重新悬浮细胞后移入流式细胞管内，进行流式细胞分析。
结果：人来源骨髓间充质干细胞在60mm平皿上原代培养，当细胞融合率大于90％后，分别与1nM FITC标记的骨髓间充质干细胞亲和多肽(FITC-EPLQLKMC)和错配多肽(FITC-MLKPLEQC)孵育1小时后，做流式细胞分析。错配多肽作为空白对照组，平均荧光强度为6；与骨髓间充质干细胞亲和多肽孵育的原代骨髓间充质干细胞，平均荧光强度为189。骨髓间充质干细胞亲和多肽组的荧光强度为错配多肽的31.5倍，说明骨髓间充质干细胞亲和多肽对人来源骨髓间充质干细胞细胞具有显著的亲和性(参图4a和图4b)。
同样，用大鼠和家兔来源的骨髓间充质干细胞进行流式细胞分析，通过在大鼠和家兔中的实验结果，说明获取的亲和多肽序列没有种属特异性，不但对人来源的骨髓间充质干细胞具有亲和性，对大鼠和家兔来源的骨髓间充质干细胞也表现出很高的亲和性(参见图5a、图5b、图5c和图5d)。
(2)激光共聚焦显微镜观察
方法：制作骨髓间充质干细胞细胞爬片，4％多聚甲醛固定10min，PBS(0.01M，pH 7.4)洗涤3遍，标记FITC的亲和多肽和错配多肽分别与细胞爬片共同孵育1h，鬼笔环肽复染细胞骨架37℃1h，hochest复染胞核，室温放置10min，激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况。(参见图6)
结果：用人来源骨髓间充质干细胞制作细胞爬片，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤3遍，标记FITC的亲和多肽和错配多肽分别与细胞爬片共同孵育1h，37℃下，鬼笔环肽复染细胞骨架1h，室温下，hochest复染胞核10min，通过激光共聚焦显微镜观察细胞与多肽结合情况，观察FITC绿色荧光在骨髓间充质干细胞细胞中的分布情况，可见骨髓间充质干细胞亲和多肽可大量聚集在骨髓间充质干细胞周围和内部，而错配的随机多肽则仅有非常少量被骨髓间充质干细胞细胞随机内吞。说明骨髓间充质干细胞亲和多肽对人来源的骨髓间充质干细胞具有很高的亲和性(参见图6)。
实施例3
骨髓间充质干细胞特异性多肽修饰PCL纳米电纺丝纤维膜：
(1)多肽合成：分别合成筛选获得的骨髓间充质干细胞亲和多肽EPLQLKM以及错配多肽MLKPLEQC(对照)(Scilight-peptide Inc，China)，采用FITC荧光染料对多肽进行标记，同时为了对材料表面进行共价修饰，在多肽的3’链接一个半胱氨酸残基(C)以利于同各材料亚氨基(-NH2)共价结合；
(2)将PCL纳米电纺丝纤维膜修剪成与24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入24孔板的孔内，每孔加入500μl的10％w/v的1，6-己二胺/异丙醇溶液中，37℃，放置1h；
(3)去离子水漂洗3～5遍，双蒸水漂洗3～5遍，PBS(0.01M，pH 7.4)冲洗3遍；
(4)每孔加入400ul的交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯(1mg/ml SMCC，Thermo公司)，室温下放置1h；
(5)用含EDTA的缓冲液(500ml 0.01M/pH 7.4的PBS+18.612gEDTA，pH 7.2～7.5)冲洗3遍；
(6)加入0.1mg/ml多肽溶液(用上述含EDTA的缓冲液配置)，每孔400μl，4℃过夜；
(7)去离子水漂洗3遍，-20℃预冻，真空冻干后4℃保存。
(8)激光共聚焦显微镜下观察多肽连接情况(参见图8)。
骨髓间充质干细胞特异性多肽修饰PCL纳米电纺丝支架试验结果：
利用共价结合方式，将亲和多肽片段EPLQLKM以及错配多肽片段MLKPLEQ连接到聚己内酯(PCL)纳米电纺丝支架表面(参见图7)，置于骨髓间充质干细胞悬液中，共同培养。结果显示：连接了亲和多肽的PCL纳米纤维膜相较于连接错配多肽的PCL纳米纤维膜更有利于骨髓间充质干细胞的粘附和生长。(参见图9a和图9b)
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure IDA0000067118130000011

Claims (2)

1.一种骨髓间充质干细胞亲和多肽用于修饰植入人体支架的应用，其中，骨髓间充质干细胞亲和多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。 
2.一种骨髓间充质干细胞亲和多肽修饰植入人体支架的方法，其特征在于， 
骨髓间充质干细胞特异性多肽修饰PCL纳米电纺丝纤维膜，包括以下步骤： 
（1）多肽合成：合成筛选获得的骨髓间充质干细胞亲和多肽EPLQLKM，采用FITC荧光染料对多肽进行标记，在多肽的3’链接一个半胱氨酸残基（C），以利于同各材料亚氨基(-NH2)共价结合； 
（2）将PCL纳米电纺丝纤维膜修剪成与24孔板的孔面积相等的圆形，然后将其放入24孔板的孔内，每孔加入500μl的10%w/v的1,6-己二胺/异丙醇溶液，37℃，放置1h； 
（3）去离子水漂洗3～5遍，双蒸水漂洗3～5遍，PBS冲洗3遍； 
（4）每孔加入400ul的交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亚胺酯，室温下放置1h； 
（5）PBS冲洗3遍； 
（6）加入0.1mg/ml的多肽溶液，每孔400μl，4℃过夜； 
（7）去离子水漂洗3遍，-20℃预冻，真空冻干后4℃保存； 
其中，骨髓间充质干细胞亲和多肽的氨基酸序列为序列表中的SEQ ID NO.1。 
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