CN106620854A - 一种类弹性蛋白‑蚕丝纤维多孔复合材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种类弹性蛋白‑蚕丝纤维多孔复合材料，其制备原料中包括类弹性蛋白多肽和蚕茧，具体步骤包括，将蚕茧剪碎，脱胶获得蚕丝纤维；将类弹性蛋白多肽与蚕丝纤维进行交联制得所述多孔复合材料。本发明的复合材料易于加工成型，采用钴60辐照灭菌后未影响材料性能；并且本发明的复合材料对周围组织无不良影响，能与周围组织融为一体；同时，本发明的复合材料，其降解速率与骨或软骨再生速度匹配，能持续稳定地为细胞生长提供支撑作用。

Description

一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料及其在制备组织工程骨和软骨支架材料等中的应用。
背景技术
肿瘤切除，创伤和先天性畸形是临床上导致骨和软骨缺损的主要原因。目前，修复骨及软骨缺损的金标准是自体组织移植，但自体组织移植会给患者带来二次创伤，而且取材量有限，因此，骨和软骨缺损修复依然是医学界的难点。组织工程(tissue engineering,TE)技术为骨和软骨组织缺损修复提供了有效的方法。TE的基本原理是从机体内获得少量的细胞(又称种子细胞)在体外培养扩增，然后使扩增的细胞粘附在生物材料上形成细胞-材料复合物，将该复合物植入机体的组织或器官病损部位，修复创伤。TE的基本要素包括种子细胞，促进细胞和组织再生的生物活性分子，以及用以维持人工组织特定形态的支架材料。
近年来，出现了多种用于骨及软骨组织工程的材料，如静电纺丝高分子材料，其优点是构建了类似于细胞外基质的微米或纳米拓扑结构，但材料孔径较小，不利于细胞进入材料内部从而限制了组织向内生长。其次，还有水凝胶材料，其可以方便实现细胞的包埋，但其生物惰性和不可降解性以及难以塑形性限制了它的应用。
发明内容
鉴于现有骨和软骨组织工程材料的缺点和不足，本发明的目的是提供一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料，该材料用于制备组织工程骨和软骨支架材料，具有足够的空隙结构，降解速率与骨或软骨再生速度匹配、并且具有一定的弹性，且不易从缺损处脱落。
本发明的技术方案如下：
一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料，所述多孔复合材料的制备原料中包括类弹性蛋白多肽和蚕茧。
所述多孔复合材料的制备方法，包括以下步骤，
将蚕茧剪碎，脱胶获得蚕丝纤维；
将类弹性蛋白多肽与蚕丝纤维进行交联制得所述多孔复合材料。
所述脱胶的步骤包括，蚕茧剪碎后浸泡于热的脱胶剂中，经清洗、透析除盐后干燥得到所述蚕丝纤维；或者蚕茧剪碎后置于去离子水中，在高于大气压条件下煮沸后取出干燥保存。
所述脱胶剂为0.01M～1M的盐酸溶液、0.01M～1M的氢氧化钠溶液、0.01M～1M的尿素溶液或0.01M～1.9M的碳酸钠溶液。
所述浸泡或煮沸的时间均为0.5～24小时。
所述交联的步骤包括，将蚕丝纤维浸没在质量浓度为0.01％～5％的类弹性蛋白多肽溶液中冻干成型，37℃～65℃真空干热交联0.5～72小时后，真空状态下温度缓慢降至室温后取出得到所述复合材料。
本发明提供另外一种交联的步骤，包括，将蚕丝纤维浸没在质量浓度为0.01％～5％的类弹性蛋白溶液中冻干成型后浸没在交联用溶液中反应得到交联材料，交联材料经清洗、真空干燥后得到所述多孔复合材料。
所述交联用溶液为质量浓度为0.01％～2％京尼平、质量浓度为0.01％～2％原花青素溶液，或是质量浓度为0.01％～2％戊二醛和质量浓度为0.01％～2％聚乙二醇的混合溶液。
所述反应的条件为4℃～37℃反应0.5～72h。
本发明的多孔复合材料用于制备组织工程骨或软骨支架。
本发明的有益效果是：
1本发明的多孔复合材料易于加工成型，采用钴60辐照灭菌后未影响材料的理化特性及生物相容性；并且本发明的复合材料对周围组织无不良影响，能与周围组织融为一体；
2本发明的多孔复合材料具有良好的生物相容性，受试动物无炎症反应，无疾病或死亡，其降解产物对细胞、组织、机体无毒性；
3本发明的多孔复合材料，其降解速率与骨或软骨再生速度匹配，能持续稳定地为细胞生长提供支撑作用；
4本发明的多孔复合材料具有一定的弹性，不易从缺损处脱落；
5本发明的多孔复合材料孔隙率高且具有通孔结构，能为细胞均匀分布和生长提供足够的空间。
附图说明
图1为对比例及各实施例的扫描电子显微镜图。
图2为对比例及各实施例：(a)断裂强力；(b)断裂伸长率测试结果；(c)类弹性蛋白(ELP)、蚕丝纤维(S)、类弹性蛋白-蚕丝纤维冻干材料(S-ELP)和类弹性蛋白-蚕丝纤维干热交联材料(S-ELP-DHT)的杨氏模量测试结果。每种材料测试4个样品，统计结果以平均值±标准差表示(***p<0.001)。
图3(a)分别为S和S-ELP-DHT材料接种骨髓间充质干细胞后植入裸鼠皮下1个月和2个月后的大体形貌观察图；(b)为本发明方法制备的纤维多孔材料接种骨髓间充质干细胞后植入裸鼠皮下1个月和2个月后的显微CT结果。
图4分别为S和S-ELP-DHT材料接种骨髓间充质干细胞后植入裸鼠皮下1个月和2个月后的组织学染色结果(依次为苏木精-伊红(HE,haematoxylin and eosin)染色，蕃红O(S-O,safranin O)染色，甲苯胺蓝染色(TB,toluidine blue)，马森三色染色(MTS,Masson’s trichrome staining)，I型胶原(Col I,collagen type I)和III型胶原(Col III,collagen type III)免疫荧光染色；标尺从上至下依次为1000μm，500μm和200μm)，在含有方框图片的下方，所有图片均是选取对应纵列方框内区域放大后拍摄。
图5分别为S和S-ELP-DHT材料接种软骨细胞后植入裸鼠皮下1个月和2个月后的形貌观察及组织学染色结果(依次为大体观察，苏木精-伊红(HE,haematoxylin and eosin)染色，蕃红O(S-O,safranin O)染色，甲苯胺蓝染色(TB,toluidine blue)，马森三色染色(MTS,Masson’s trichrome staining)，II型胶原(Col II,collagen type II)和X型胶原(Col X,collagen type X)免疫荧光染色；标尺从上至下依次为10mm，1000μm，500μm和200μm)，在含有方框图片的下方，所有图片均是选取对应纵列方框内区域放大后拍摄。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明在配制类弹性蛋白多肽溶液或其他溶液时或者清洗时所用去离子水可用普通生活用水、单蒸水、双蒸水、生理盐水或磷酸缓冲液替代。另外，本发明所用真空干燥的方法可以用加热烘干、吸湿剂干燥、自然风干、低温冷冻干燥、超临界点干燥替代。
弹性蛋白(elastin)广泛存在于软骨、椎间盘、血管、肝脏等组织细胞外基质中，与微纤维共同组成弹性纤维(elastic fibre)，赋予组织回弹、抗张和变形伸缩的能力。依据天然弹性蛋白氨基酸序列设计合成的具有弹性蛋白特征的人工多肽，称为类弹性蛋白(elastin-like polypeptide，ELP)(或类弹性蛋白多肽)。ELP是基于天然弹性蛋白的保守五肽串联重复序列(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，VPGXG)制备的基因工程产物，其中Xaa可以是除了Pro以外的任一种氨基酸。
本发明类弹性蛋白多肽是利用基因工程、微生物发酵和常规蛋白质分离纯化技术制备的冻干粉，具体的制取可参考专利(申请号：201110162563.7)，或者直接从西北大学生命科学学院陕西省生物技术重点实验室购买得到。
本发明所述多孔复合材料是医学植入物，优选支架，神经导管，疝网，维系带，用于肌腱、气管或支气管的骨架，尤其前交叉韧带，或骨以及软骨的骨架植入。
本发明的蚕茧为家蚕蚕茧，来源不限。
实施例1
本实施例提供一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料的制备方法，具体步骤为：
将B.mori蚕茧剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去离子水为溶剂，配制1.9M的碳酸钠溶液，加热至100℃，将烘干的蚕茧碎片浸泡在煮沸的碳酸钠溶液中30分钟，取出后用去离子水超声清洗3次(10分钟/次)，用去离子水透析除盐后干燥，获得蚕丝纤维(或者也可将B.mori蚕茧剪成碎片后置于去离子水中，在高于大气压条件下煮沸0.5～24小时后取出得到蚕丝纤维，干燥保存)；
将10mg冻干蚕丝纤维浸没在1mL质量浓度为1％的类弹性蛋白溶液中冻干成型，记作S-ELP，之后S-ELP于65℃真空干热交联(真空干热交联即真空、干燥及加热同时满足时交联)48小时。真空状态下缓慢降温至室温后将材料取出，得到多孔复合材料，记作S-ELP-DHT，4℃下密闭保存。
实施例2
本实施例提供一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料的制备方法，具体步骤为：
将B.mori蚕茧剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去离子水为溶剂，配制1M的盐酸溶液，加热至100℃，将烘干的蚕茧碎片浸泡在煮沸的盐酸溶液中24小时，取出后用去离子水超声清洗3次(10分钟/次)，用去离子水透析除盐后干燥，获得蚕丝纤维；
将10mg冻干蚕丝纤维浸没在1mL质量浓度为0.01％的类弹性蛋白溶液中冻干成型后浸没在质量浓度0.01％京尼平溶液中，4℃反应48小时后得到京尼平交联复合材料(记做S-ELP-Genipin)，用去离子水震荡清洗3次，真空干燥，4℃密闭保存。
实施例3
本实施例提供一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料的制备方法，具体步骤为：
将B.mori蚕茧剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去离子水为溶剂，配制0.01M的氢氧化钠溶液，加热至100℃，将烘干的蚕茧碎片浸泡在煮沸的氢氧化钠溶液中30分钟，取出后用去离子水超声清洗3次(10分钟/次)，用去离子水透析除盐后干燥，获得蚕丝纤维；
将10mg冻干蚕丝纤维浸没在1mL质量浓度为1％的类弹性蛋白溶液(用去离子水配制)中冻干成型，记作S-ELP，将冻干成型的S-ELP浸没在2％原花青素溶液(用去离子水配制)中，37℃反应0.5小时后得到原花青素交联复合材料(S-ELP-PA)，用去离子水震荡清洗3次，真空干燥，4℃密闭保存。
实施例4
本实施例提供一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料的制备方法，具体步骤为：
将B.mori蚕茧剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去离子水为溶剂，配制1M的尿素溶液，加热至100℃，将烘干的蚕茧碎片浸泡在煮沸的尿素溶液中30分钟，取出后用去离子水超声清洗3次(10分钟/次)，用去离子水透析除盐后干燥，获得蚕丝纤维；
将10mg冻干蚕丝纤维浸没在1mL质量浓度为5％的类弹性蛋白溶液中冻干成型后浸泡于含0.2％GA和0.2％PEG溶液中，4℃交联处理72小时，取出材料，用去离子水反复冲洗，冻干，得到多孔复合材料，记作S-ELP-GA/PEG，4℃密闭保存。
对比例1
本对比例提供一种蚕丝纤维支架，该蚕丝纤维支架也可用于医学植入物，具体制备步骤为：
将B.mori蚕茧剪成碎片烘干，存于干燥器中，以去离子水为溶剂，配制1.9M的碳酸钠溶液，加热至100℃，将烘干的蚕茧碎片浸泡在煮沸的碳酸钠溶液中30分钟，取出后用去离子水超声清洗3次(10分钟/次)，用去离子水透析除盐后干燥，获得蚕丝纤维支架，记做Silk(S)。
效果验证
图1分别为对比例1、实施例1中的S-ELP、实施例1—4的材料扫描电子显微镜观察图(放大500倍图片中标尺为100μm，1000倍图片中标尺为50μm，3000倍图片中标尺为50μm)，依次为蚕丝纤维支架、S-ELP、S-ELP-DHT、京尼平交联(S-ELP-Genipin)、原花青素交联(S-ELP-PA)和戊二醛/聚乙二醇交联(S-ELP-GA/PEG)的材料形貌。图2分别为对比例1、实施例1中的S-ELP、实施例1-4的材料力学性能测试结果。图3、图4和图5是实施例1制备的多孔复合材料S-ELP-DHT的动物实验结果。
对比例1的蚕丝纤维虽具有三维结构，但纤维之间的交叉节点没有力的作用，因此断裂强力、弹性模量(杨氏模量)较低，面临无法承重和不易塑形的问题。相较于对比例1的蚕丝纤维，实施例1中的S-ELP、实施例1—4的复合材料中的蚕丝纤维被ELP和(或)交联剂包裹，特别是在蚕丝纤维之间的交叉点，整个交叉部位被包裹(见图1)。在图2中，验证了根据图1推测的结果，S-ELP与对比例1的蚕丝纤维相比，断裂强力大幅提高，但由于ELP冻干后易发生脆性断裂，韧性较低，使得其断裂伸长率较低，并且由于ELP和蚕丝纤维是通过单纯的物理吸附作用而结合，附着不均一也导致了测试结果的标准差偏大。综合断裂强力和断裂伸长率的结果，实施例1—4中制备复合材料的方法(干热交联、京尼平交联、原花青素交联、戊二醛/聚乙二醇交联)可提高单一材料(ELP或S)的力学性能，提高了单纯共混材料(S-ELP)力学性能的稳定性。
将本对比例方法制备的蚕丝纤维支架以及S-ELP-DHT材料接种骨髓间充质干细胞后的复合物分别植入裸鼠皮下，分别在1个月和2个月后取出。饲养的裸鼠在试验期内无死亡，伤口愈合良好，无感染。取出样品形貌见图3(蚕丝纤维支架/骨髓间充质干细胞复合物以及S-ELP-DHT/骨髓间充质干细胞复合物分别植入裸鼠皮下1个月和2个月后的形貌观察(a)大体观察；(b)显微CT，标尺为2mm)。图3中显微CT结果表明该纤维多孔材料接种骨髓间充质干细胞后的复合物中有新生骨组织形成。对比例1中，蚕丝材料/MSCs复合物中出现了少量骨组织，通过用VG Studio软件旋转该样品的三维影像，可观察到新生骨组织大部分分布在材料的边缘，材料内部基本无新生骨形成，大部分为结缔软组织；实施例1中，S-ELP-DHT/MSCs复合物表面被基质包裹而变得光滑，在薄薄的结缔组织下有骨组织形成，可观察到骨小梁，通过用VG Studio软件可观察到骨小梁的三维空间排列、密度分布和骨小梁间的连接特点。
如图4(蚕丝纤维支架/骨髓间充质干细胞复合物以及S-ELP-DHT/骨髓间充质干细胞复合物分别植入裸鼠皮下1个月和2个月后的组织学染色结果)，图4的组织学染色结果确认复合物成骨，且观察到骨组织中有未降解蚕丝。可见，本发明方法制备的多孔复合能够满足组织工程骨支架材料的要求，能够用于组织工程骨支架材料的构建。对比例1中，蚕丝纤维/MSCs复合物植入裸鼠皮下1个月和2个月后，在材料边缘形的致密组织，形成新生骨组织类骨质。实施例1的S-ELP-DHT/MSCs复合物植入裸鼠皮下1和月和2个月后，在材料内部形成的致密组织，为软骨和新生骨组织类骨质。制备的蚕丝纤维支架以及S-ELP-DHT材料接种软骨细胞后的复合物分别植入裸鼠皮下，分别在1个月和2个月后取出。饲养的裸鼠在试验期内无死亡，伤口愈合良好，无感染。取出样品形貌及组织学染色结果见图5。如图5所示(蚕丝纤维支架/软骨细胞复合物以及类弹性蛋白-蚕丝纤维干热交联复合材料(S-ELP-DHT)/软骨细胞复合物分别植入裸鼠皮下1个月和2个月后的组织学染色结果)，该纤维多孔材料接种软骨细胞后的复合物中有新生软骨组织形成，且观察到软组织中有未降解蚕丝。可见，本发明方法制备的纤维多孔材料能够满足组织工程软骨支架材料的要求，能够用于组织工程软骨支架材料的构建。相较于对比例1的蚕丝纤维/软骨细胞复合物，实施例1的S-ELP-DHT/软骨细胞复合物植入裸鼠皮下1个月和2个月后，在材料内部形成更多新生软骨组织。

Claims (10)

1.一种类弹性蛋白-蚕丝纤维多孔复合材料，其特征在于，所述多孔复合材料的制备原料中包括类弹性蛋白多肽和蚕茧。
2.权利要求1所述多孔复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
将蚕茧剪碎，脱胶获得蚕丝纤维；
将类弹性蛋白多肽与蚕丝纤维进行交联制得所述多孔复合材料。
3.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述脱胶的步骤包括，蚕茧剪碎后浸泡于热的脱胶剂中，经清洗、透析除盐后干燥得到所述蚕丝纤维；或者蚕茧剪碎后置于去离子水中，在高于大气压条件下煮沸后取出干燥保存。
4.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述脱胶剂为0.01M～1M的盐酸溶液、0.01M～1M的氢氧化钠溶液、0.01M～1M的尿素溶液或0.01M～1.9M的碳酸钠溶液。
5.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述浸泡或煮沸的时间均为0.5～24小时。
6.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述交联的步骤包括，将蚕丝纤维浸没在质量浓度为0.01％～5％的类弹性蛋白多肽溶液中冻干成型，37℃～65℃真空干热交联0.5～72小时后，真空状态下温度缓慢降至室温后取出得到所述复合材料。
7.如权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述交联的步骤包括，将蚕丝纤维浸没在质量浓度为0.01％～5％的类弹性蛋白溶液中冻干成型后浸没在交联用溶液中反应得到交联材料，交联材料经清洗、真空干燥后得到所述多孔复合材料。
8.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述交联用溶液为质量浓度为0.01％～2％京尼平、质量浓度为0.01％～2％原花青素溶液，或是质量浓度为0.01％～2％戊二醛和质量浓度为0.01％～2％聚乙二醇的混合溶液。
9.如权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述反应的条件为4℃～37℃反应0.5～72h。
10.权利要求1所述多孔复合材料用于制备组织工程骨或软骨支架。
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