CN1868425A

CN1868425A - 一种关节软骨海绵支架

Info

Publication number: CN1868425A
Application number: CN 200510073008
Authority: CN
Inventors: 卢世璧; 张建党; 袁玫; 黄靖香; 孙明学
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2005-05-27
Filing date: 2005-05-27
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2025-05-27
Also published as: CN100477972C

Abstract

本发明公开了一种新的关节软骨海绵支架的制备方法及由该方法制备得到的产品，该关节软骨支架通过以下方法制备而成：1)将新鲜关节软骨冻干后用粉碎机粉碎，过筛，得直径为25－200μm的颗粒备用；2)将颗粒中加入0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡24－48h后用蒸馏水洗3次，用1％TritonX－100在4℃温度下持续振荡48－72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3)1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，用紫外线照射8小时后经25kGy钴60辐照灭菌即得本发明支架。本发明支架具有良好的生物相容性，不为机体所排斥，能为软骨细胞创造接近正常生理的微环境，有利于软骨细胞的生长和繁殖，植入动物软骨缺损处后促软骨再生作用明显。

Description

一种关节软骨海绵支架

技术领域

本发明涉及一种支架，尤其涉及一种关节软骨支架的制备方法及由该方法制备得到的产品，属于生物医学组织工程领域。

背景技术

软骨的自身修复能力极其有限，用组织工程技术构建工程化软骨为修复软骨缺损提供了一种具有良好应用前景的方法。支架是组织工程化软骨构建的重要一环。虽然国内外已发表了多种支架，包括化学合成的和生物提取的，但都存在一些问题，很少进入临床应用，尚无理想的支架。而仿真支架，即对软骨组织进行处理，剔除其中的细胞抗原成分，而保留了组织的细胞外基质，这样获得的材料，具有良好的生物相容性，而且能为细胞创造接近正常生理的微环境，利于细胞的生长和分化代谢，因此是细胞培养支架的首选。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种仿真关节软骨支架，该关节软骨支架具有良好的生物相容性，能为软骨细胞创造接近正常生理的微环境。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：

一种关节软骨支架，由以下方法制备而成：

1、将新鲜关节软骨冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为25-200μm的颗粒备用；

2、向颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡24-48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡48-72h，然后用蒸馏水冲洗48h；

3、1,000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，用紫外线照射8小时后经25kGy钴⁶⁰辐照灭菌即得本发明支架。

上述制备方法中，所用的关节软骨可为人、猪、牛或羊的关节软骨；步骤1)中将新鲜关节软骨冻干后粉碎、过筛后优选得直径为25-38μm的颗粒备用；步骤2)中优选为向颗粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持续振荡48h；加入1％Triton X-100后在4℃温度下优选持续振荡72h。

步骤2)中通过向颗粒中加入0.25％胰蛋白酶并于37℃温度下持续振荡24-48h，能够有效敲除软骨蛋白聚糖，充分保留了II型胶原、及少量GAG和透明质酸等能够促进软骨细胞生长的成分。其中，II型胶原是软骨基质的主要有机成分，它对软骨细胞的发生、分化和迁移具有重要的诱导作用，有利于关节软骨的再生，而糖胺多糖(GAG)及透明质酸可促进软骨细胞的粘附和扩增。

步骤2)中用1％Triton X-100在4℃持续振荡48-72h，其目的是脱去细胞成分，剔除了抗原性。此外，步骤3)中的冻干和用钴⁶⁰消毒等程序，也降低或剔除了抗原成分，保证本发明支架不为机体所排斥。所以，本发明支架具有良好的生物相容性，能为软骨细胞创造接近正常生理的微环境，有利于软骨细胞的生长和繁殖，将本发明支架植入软骨缺损处后具有良好的促软骨再生的效果。

总之，本发明软骨支架具有下述优点：

(1)、所含成分以II型胶原为主，含有少许GAG及透明质酸，为软骨细胞生长提供了最接近体内生理的天然微环境。

(2)、本发明软骨支架的制备经过冻干、脱细胞和Co⁶⁰消毒等步骤，降低或剔除了抗原成分，保证所制备的软骨支架在使用时不被机体排斥。

(3)、成本低、制备简便，所用试剂价廉，易得。

(4)、完全排除了因佐剂带来副作用的可能。

在使用本发明支架时，本领域的普通技术人员可根据需要的体积，采用不同的模具，制成不同大小和形状，这些都是非常容易掌握和实现的，无需付出任何创造性的劳动。

具体来说，本发明支架的使用可参考如下方法：根据关节软骨缺损的大小，制备相应大小的海绵支架，在体外，加入自体软骨细胞或由干细胞诱导的软骨细胞，体外培养2-3天，培养基为高糖DMEM/F-12，加HEPES，立即手术植入软骨缺损处，需要时，再加骨膜固定之。

附图说明

图1为本发明软骨支架的外形图。

图2为本发明软骨支架扫描电镜扫描结果。从照片可见本发明软骨海绵状支架呈交叉的孔隙，孔隙率极高。

图3为接种了软骨细胞的人软骨海绵支架扫描电镜观察结果。从照片可见软骨海绵状支架上布满了软骨细胞。

图4为将家兔关节软骨缺损用本发明海绵支架修复，6个月后显微镜观察结果(放大40倍)。

图5为将猪关节软骨缺损处用本发明海绵支架修复，3个月后显微镜观察结果(放大40倍)。

以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。

具体实施方式

[实施例1]

1、取猪新鲜关节软骨1kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为25μm的颗粒备用；

2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡72h，然后用蒸馏水冲洗48h；

3、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，用紫外线照射8小时后经25kGy钴⁶⁰辐照灭菌即得本发明支架。

[实施例2]

1、取牛新鲜关节软骨3kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为38μm的颗粒备用；

2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡24h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡48h，然后用蒸馏水冲洗48h；

[实施例3]

1、取新鲜人关节软骨0.5kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为200μm的颗粒备用；

2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡36h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡65h，然后用蒸馏水冲洗48h；

[试验例1]

一、试验材料

1、供试样品：实施例3所制备的人软骨海绵支架。

2、实验动物：新西兰家兔，2.5公斤体重(购自北京维通利华实验动物有限公司)。

3、培养基：

1)DMEM配方：(单位：g/L)

精氨酸(L-Arginine-HCl)0.084、胱氨酸(L-Cystine-2HCl)0.0626、谷氨酰胺(L-Glutamine)0.584、甘氨酸(Glycine)0.03、组氨酸(L-Histidine-HCl-H₂O)0.042、异亮氨酸(L-Isolucine)0.105、亮氨酸(L-Lucine)0.105、赖氨酸(L-Lycine-HCl)0.146、蛋氨酸(L-Methionine)0.03、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)0.066、丝氨酸(L-Serine)0.042、苏氨酸(L-Threonine)0.095、色氨酸(L-Tryptophan)0.016、酪氨酸二钠(L-Tyrosine-2Na-2H₂O)0.10376、缬氨酸(L-Valine)0.094、氯化胆碱(Choline Chloride)0.004、叶酸0.004、肌醇0.0072、尼克酰胺0.004、D-泛酸0.004、吡哆醇(Pyridoxal-HCl)0.004、核黄素0.0004、硫胺素(Thiamine-HCl)0.004、氯化钙0.2、硝酸铁(Ferric Nitrate-9H₂O)0.0001、硫酸镁0.09767、氯化钾0.4、氯化钠6.4、磷酸钠0.109、葡萄糖4.5、酚红(Phenol Red-Na)0.0159。

2)F-12配方(单位：g/L)

丙氨酸0.009、精氨酸0.211、天门冬氨酸0.013、天冬酰氨0.015、半胱氨酸0.035、谷氨酸0.0147、谷氨酰氨0.146、甘氨酸0.0751、组氨酸0.0209、异亮氨酸0.0039、亮氨酸0.013、赖氨酸0.0365、蛋氨酸0.0045、苯丙氨酸0.0049、脯氨酸0.0345、丝氨酸0.0105、苏氨酸0.0119、色氨酸0.002、酪氨酸二钠0.0077、缬氨酸0.0117、氯化钙0.0441、氯化钾0.224、磷酸二氢钠0.142、氯化钠7.1、生物素0.0000073、氯化胆碱0.0139、肌醇0.018、尼克酰胺0.000004、D-泛酸0.00048、吡哆醛0.000006、硫胺素0.00034、核黄素0.00004、维生素B-120.00136、叶酸0.000132、D-葡萄糖1.802、酚红0.0013、丙酮酸钠0.110、次黄嘌呤0.0041、胸苷0.00073、碳酸氢钠1.176。

二、试验方法及结果：

1、制备大小为3.5mm的海绵支架，在体外，加入由干细胞诱导的软骨细胞，体外培养3天，培养基为高糖DMEM/F-12(注：DMEM∶F-12＝1∶1)，加HEPES，将实验动物新西兰家兔在膝关节制成直径为3.5mm的软骨关节面缺损，立即手术将接种了细胞的人软骨海绵支架(图3)植入缺损处。3个月及6个月后观察：缺损处已由软骨再生修复。显微镜下组织学结构，见图4。

[试验例2]

一、试验材料

1、供试样品：实施例1所制备的猪软骨海绵支架。

2、实验动物：小型猪(体重为80～100kg)。

3、培养基：DMEM/F-12(同试验例1)。

二、试验方法及结果：

制备大小为5mm的海绵支架，在体外，加入由干细胞诱导的软骨细胞，体外培养3天，培养基为高糖DMEM/F-12(注：DMEM∶F-12＝1∶1)，加HEPES，将实验动物小型猪在膝关节制成5mm直径的软骨关节面缺损，将接种了细胞的猪软骨海绵支架植入缺损处。3个月后观察：缺损处已由软骨再生修复。显微镜下组织学结构，见图5。

Claims

1、一种制备关节软骨支架的方法，包括以下步骤：

1)、将新鲜关节软骨冻干后粉碎，过筛，得直径为25-200μm的颗粒备用；

2)、向颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶振荡24-48h后用蒸馏水洗3次，再用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡48-72h，然后用蒸馏水冲洗48h；

3)、1,000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，用紫外线照射8小时后经25kGy钴⁶⁰辐照灭菌即得。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征是：所述的关节软骨为人、猪、牛或羊的关节软骨。

3、按照权利要求1所述的方法，其特征是：步骤1)中将新鲜关节软骨冻干后粉碎、过筛后得直径为25-38μm的颗粒备用。

4、按照权利要求1所述的方法，其特征是：步骤2)中向颗粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持续振荡48h。

5、按照权利要求1所述的方法，其特征是：步骤2)中向颗粒中加入1％Triton X-100后在4℃温度下持续振荡72h。

6、一种关节软骨支架，其特征是由权利要求1～5任一所述方法制备得到的产品。