WO2002096978A1

WO2002096978A1 - Elastine reticulee et son procede de production

Info

Publication number: WO2002096978A1
Application number: PCT/JP2002/005275
Authority: WO
Inventors: Keiichi Miyamoto
Original assignee: Keiichi Miyamoto
Priority date: 2001-05-30
Filing date: 2002-05-30
Publication date: 2002-12-05
Also published as: JP4214051B2; DE60228573D1; EP1403304B1; JP4667486B2; US20040136977A1; US7125960B2; EP1403304A4; US20060204529A1; JP2008291258A; EP1403304A1; JPWO2002096978A1

Description

明細書

エラスチン架橋体およびその製造方法

技術分野

本発明は、生体適合性機能性材料、およびその製造方法、医療用器具、架橋剤、外科治療方法、さらに再生組織に関する。

背景技術

事故、災害その他の理由で神経組織が切断された患者に対する治療方法の一つとして、人工材料によるチューブを神経欠損部に連結して、該チューブ内に神経組織の再生を誘導する方法が行われている。該チューブとしては、シリコーン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレンテレフ夕レート、アルギン酸、ポリ乳酸等のチューブの内面を、コラ一ゲンゃラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングしたものが用いられている。

また、血管が切断された患者に対する治療方法の一つとして、シリコ —ン、ポリウレタン、ポリエステルなどの合成高分子繊維を編んだ布を管状とし、その内面をコラーゲンゃラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコーティングした人工血管を、血管切断部位に移植し、該人工血管内部に内皮細胞を誘導させる方法が行われている。

発明の開示

前述のシリコーンチューブやポリウレタンチューブなどの内面は、細胞接着性がないためこれまでは、コラーゲンゃラミニンなどの細胞接着性タンパク質をコ一ティングしたチューブゃ該人工血管を、前述のような治療方法に用いた場合には、長期の治療の間に該細胞接着性夕ンパク質が脱離し、神経や血管などの組織の再生が不十分であった。

さらに、動物内に移植するチューブや人工血管には、人体および各組織の動きに連動するだけの弾性が求められているが、シリコーンやポリエステルを主原料とするチューブや人工血管のヤング率（弾性率）は、適応された組織のヤング率（弾性率）が 1 X 1 0 ⁴〜 2 X 1 0 ⁶ Paであるのに対し、 1 x 1 0 ⁷ P a以上であるため、接合部に強いストレスが起こり、その結果、血栓が生じるなどの問題を抱えており、人体の組織と同じ弾性を有する材料が求められていた。

本発明者は前述の従来技術の課題に鑑み鋭意研究を重ねた結果、水溶性エラスチンを架橋剤により架橋することにより、コ一ティングしたコラーゲンゃラミニン等の細胞接着性夕ンパク質の脱離が起こらず、生体の移植に適合し得るだけの弾性を有するエラスチン架橋体を得ることができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。

本発明は下記の構成を有する。

( 1 ) 水溶性エラスチンから選ばれた 1種以上を含有する架橋原料が、水溶性架橋剤で架橋されてなるエラスチン架橋体。

( 2 ) 架橋原料がさらにコラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ —ナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セル口ース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、ダルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- α (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメ夕クリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビ二ールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1種以上を含有する（ 1 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 3 ) 水溶性エラスチンの含有率が 0. 5〜9 9. 5重量％の範囲である（ 1 ) 記載のエラスチン架橋体。

(4) ヤング率が 1 X 1 0²〜 1 X 1 0⁷ P aの範囲である（ 1 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 5 ) 内部構造が空隙を有するスポンジ構造である（ 1 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 6 ) 空隙の平均直径が 2 0 m未満の範囲である（ 5 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 7 ) 空隙の平均直径が 2 0 ζπ！〜 2 mmの範囲である（ 5 ) 記載のェラスチン架橋体。

( 8 ) コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸- デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン- ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジヱランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセル口 Γ "ス、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 m-a (形質転換増殖因子ひ）、 E6F (上皮増殖因子）、 VE6F (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神絰栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォ口エチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコ一ル、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1種以上が化学的に結合されてなる ( 1 ) または（ 2 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 9 ) 化学的結合が架橋剤を用いた架橋である（ 8 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 1 0 ) コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンである夕ンパク質、ポリグル夕ミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマ夕ン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギーナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、ダルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- a (形質転換増殖因子 α )、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1種以上を含有する（ 1 )、 (2) または（8) 記載のエラスチン架橋体。

(1 1) 水溶性架橋剤が分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にァミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物である

( 1 ) 記載のエラスチン架橋体。

( 12) 水溶性架橋剤が、下記一般式で表される水溶性化合物であることを特徴とする（ 1) 記載のエラスチン架橋体。

<一般式>

(Rい R ₃は下記の構造式で表される <A>または の何れかであり、と R₃とは同じであっても異なっていてもよく、）

< A>

(R₄、 R₅は H、 CH₃、 C ₂ H ₅のいずれかであり、 R₄と R₅とは同じであっても異なっていてもよい。）

(R₂は下記の構造式で表される < C >または <D >の何れかで表される化合物であり、）

< O

(11は1〜20までの整数である。）

<D >

(m、 1は 0〜 1 5までの整数であり、 X、 Yは、 CH₂または 0の何れかであり、 Xと Yとは同じであっても異なっていてもよく、 Zは Cまたは Nの何れかであり、 R₆、 R₇、 R₈、 R_gは、 H、 CH₃、 C₂H₅の何れかであり、それそれ同じであっても異なっていても良い。）

( 13) ( 1 ) 〜（ 12) の何れか 1項記載のエラスチン架橋体からなるエラスチン成形体。

( 14) 形状が、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状である（ 13) 記載のエラスチン成形体。

( 1 5) ( 1) 記載のエラスチン架橋体を用いた医療用器具。

( 16) ( 1 5) 記載の医療用器具を用いることを特徴とする外科治療方法。

( 17) ( 1 ) 記載のエラスチン架橋体、（ 1 5 ) 記載の医療用器具を用いることを特徴とする再生医療。

( 18) ( 1 ) 記載のエラスチン架橋体を用いて得られた再生組織 <

( 1 9) 分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にァミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物を含有する架橋剤。

(20) 化合物が、下記一般式で表される化合物である（ 1 9 ) 記載の架橋剤。 <一般式 >

( R₃は下記の構造式で表される < A>または の何れかであり、と R₃とは同じであっても異なっていてもよく、）

< A>

(R₄、 R₅は H、 CH₃、 C₂H₅のいずれかであり、 R₄と R₅とは同じであっても異なっていてもよい。）

< O

"(CH₂

(nは 1〜20までの整数である。）

< D >

(m、 1は 0〜 1 5までの整数であり、 X、 Yは、 C H ₂または 0の何れかであり、 Xと Yとは同じであっても異なっていてもよく、 Zは Cまたは Nの何れかであり、 R₆、 Rい R₈、 R ₉は、 H、 C H₃、 C ₂H ₅の何れかであり、それそれ同じであっても異なっていても良い。）

( 2 1 ) ( 1 9 ) 記載の水溶性架橋剤を用いた架橋反応により、水溶性エラスチンを架橋することを特徴とするエラスチン架橋体の製造方法。

( 2 2 ) 架橋反応時の反応温度が 4〜 1 5 0 Cの範囲であることを特徴とする（ 2 1 ) 記載のエラスチン架橋体の製造方法。

図面の簡単な説明

図 1は、実施例 8の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（ 2 5 °Cで反応）。

図 2は、実施例 9の本発明のエラスチン架橋体の電子顕微鏡写真図である（ 5 0 °Cで反応）。

図 3は、実施例 1 0のエラスチン 1 %ゼラチン架橋成形体を示す図でめ^ )

図 4は、実施例 1 1のエラスチン 1 0 %ゼラチン架橋成形体を示す図である。

図 5は、実施例 1 2のエラスチン 9 0 %ゼラチン架橋成形体を示す図である。

図 6は、実施例 1 3のエラスチン 0 % /ゼラチン架橋成形体を示す図である。図 7は、エラスチン 0〜 9 0 % /ゼラチン架橋成形体比較写真図である o

図 8は、実施例 1 4のへパリン含有エラスチン架橋成形体を示す図である。

図 9は、実施例 1 5のへパリン含有確認試験を示す図である。

図 1 0は、実施例 1 6のシート状エラスチン架橋体を示す図である。図 1 1は、実施例 1 7のシ一ト状エラスチン架橋体を示す図である。図 1 2は、実施例 1 7の糸状エラスチン架橋体を示す図である。

図 1 3は、実施例 1 7のペレツト状エラスチン架橋体を示す図である c 図 1 4は、細胞接着性タンパク質上での神経細胞芽腫細胞（ I M R— 3 2 ) の増殖カーブを示す図である。記号はゼラチン（厶），エラスチン ( · ) , アルブミン（口）、 N oはタンパク質をコートした培養プレート上の初期細胞数、 N tは測定時の細胞数を意味する。

図 1 5は、実施例 1 9の線維芽細胞増殖因子含有エラスチン/へパリン架橋体を示す図である。

発明の実施の形態

本発明に使用する水溶性エラスチンとは特に限定されるものではないが、エラスチンを加水分解して得られるものであり、具体的には、動物の頸靭帯などを熱シユウ酸処理して得られる α—エラスチン若しくは/? —エラスチン、エラスチンをアルカリエタノール処理して得られる一エラスチン、エラス夕一ゼにより酵素処理した水溶性エラスチンおよびエラスチン生合成経路における前駆体であるトロポエラスチンなどの少なくとも 1種以上のエラスチンを使用することができる。トロポエラスチンは特に限定されるものではなく動物細胞からの抽出物でも、遺伝子組換え法により得られるトロポエラスチン遺伝子産物の少なくとも 1種類以上を使用することができる。

弾性タンパク質であるエラスチンは、通常、生体内において、大動脈や声帯など弾性が要求される体内組織に多く存在する。生体内に存在するエラスチンは、疎水性アミノ酸の含有量が多いことと、デスモシン、ィソデスモシンなどの強固な架橋構造を有することから水不溶性の性質を持つ。該エラスチンは、こうした架橋構造により油状コイルと呼ばれる特有の構造を形成するために弾性を有している。

本発明のエラスチン架橋体は、生体内エラスチンの架橋構造を分解し水溶性にした水溶性エラスチンから選ばれた 1種以上を水溶性架橋剤で架橋して得ることができる。また本発明のエラスチン成形体は、前述の水溶性エラスチンと水溶性架橋剤を混ぜ合わせ水溶性エラスチン水溶液とした後、成形用のテンプレートなどに流し込み、加熱などで架橋させて得ることができる。

本発明のエラスチン架橋体は、水溶性エラスチンおよび架橋剤以外の第 3成分を含有するものであってもよい。該成分は特に限定されるものではない。該成分には、例えばコラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質ゃポリグル夕ミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ一ナン、寒天、キサンタンガム、カードラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセル口一ス、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、ダルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- α (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメ夕クリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロビレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはそれらの 1種以上を含有しても何ら問題はない。特にコラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、ラミニン、へパリン、コンドロイチン硫酸など細胞外マトリクス成分や bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）などの細胞増殖因子は細胞の接着および増殖を高めるために好ましい。

本発明のエラスチン架橋体に含有する水溶性エラスチンの割合は、ェラスチン架橋体に対して 0 . 5〜 9 9 . 5重量％の範囲であることが好ましい。更に好ましくは 1〜 9 5 %であり、この範囲であれば生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができる。

水溶性エラスチンは、全重量の約 9 4 %が疎水性アミノ酸、約 1 %が側鎖にアミノ基を含むアミノ酸（リジン、アルギニン、ヒスチジン）で形成された疎水性夕ンパク質である。本発明に使用する水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンの側鎖のァミノ基と反応し、架橋反応するものであれば何れの水溶性架橋剤であっても使用することができる。該水溶性架橋剤としては例えば、グルタルアルデヒド、エチレングリシジルェ一テルなどや下記一般式で表される分子中心領域に疎水性部を有し、両末端に活性エステル基を有する化合物などを挙げることができる。中でも下記一般式で表される化合物を架橋剤として用いると、生体に適した弾性を有する成形性良好な成形体を得ることができ好ましい。

<一般式 >

( Rい R ₃は下記の構造式で表される < A >または の何れかであり、 R j^と R ₃とは同じであっても異なっていてもよく、）

< A >

(R₄、 R₅ H、 CH₃、 C₂H₅のいずれかであり、 R₄と R₅とは同じであっても異なっていてもよい。）

(R ₂は下記の構造式で表される < C >または <D >の何れかで表される化合物であり、）

< O

(riは 1〜 20までの整数である。）

<D >

(m、 1は 0〜 1 5までの整数であり、 X、 Yは、 CH₂または 0の何れかであり、 Xと Yとは同じであっても異なっていてもよく、 Zは Cまたは Nの何れかであり、 R₆、 ₇, R₈、 R₉は、 H、 CH₃、 C₂H₅の何れかであり、それそれ同じであっても異なっていても良い。）

分子中心領域に疎水性部を有する化合物は、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと、疎水相互作用により強固で安定した構造体を形成するしかし、疎水性部を多く含む化合物は、有機溶媒には可溶ではあるが、水に難溶または不溶となり水系で取り扱いにくい。本発明の水溶性架橋剤は上記一般式で表されるジカルボン酸化合物の両末端を 4- hydroxyphenyldimethyl-sulfoniummethylsulfate ( 4ヒドロキシフエ二ルジメチルースルホニゥムメチルサルフェイト：以下 DSP) で活性エステル化させたもので、疎水性アミノ酸を多く含むエラスチンと強固な安定した構造体を取る疎水性部を有しながら、かつ水に溶解し水系で取り扱える特徴を有するものである。

また本発明の水溶性架橋剤は、その化学式の両末端の活性エステル基が、水溶性エラスチンのアミノ酸とペプチド結合し、架橋する。従って、本発明の水溶性架橋剤により架橋して得られたエラスチン架橋体は、生体内で生分解を受け易い特徴を有する。その生分解速度は、エラスチン架橋体の架橋度と関係するため、架橋条件を変え架橋度を変えることにより制御することができる。

本発明のエラスチン架橋体の構造は、特に限定するものではないが、体液や培養液などが浸透できるように空隙を有するスポンジ構造であることが好ましい。該空隙の大きさは特に限定されるものではないが、その平均直径が 2 0 z m未満の場合、ヤング率（弾性率）が高く硬い架橋体を得やすい。また、 2 0〃m〜 2 m mの範囲の場合、ヤング率（弾性率）が低く膨潤度の高い成形可能な架橋体を得やすい。

本発明のエラスチン架橋体は、弾性に優れる架橋体であるが、生体に適合し易くするためにヤング率（弾性率） l x l 0 ²〜 l x l 0 ⁷ P aの範囲が好ましく、特に 1 X 1 0 ³〜 2 X 1 0 ⁶ P aの範囲が好ましい。

本発明のエラスチン成形体の形状は特に限定されるものではないが、医療用途への適用では、糸状、膜状、棒状、ペレツト状またはチューブ状などであることが好ましい。

さらに、本発明のエラスチン架橋体は、それのみで特定の構造体を形成してもよく、あるいはエラスチン架橋体以外の成分と複合体を形成させても良い。また、エラスチン架橋体以外の構造体の表面コーティングに用いても良い。複合体を形成させる成分としては、特に限定されるものではないが、例えばコラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フィブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンなどのタンパク質やポリグル夕ミン酸、ポリリジンなどのポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ一ナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、ダルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナン等の糖質、 (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）などの細胞増殖因子、その他ポリメ夕クリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロェチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンェ —テル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコ一ル、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、ポリリンゴ酸などの化合物を挙げることができる。さらにはこれらを 1種以上を用いてもよい。これによりエラスチンにない細胞接着性ゃ坑血栓性等の生体機能を付与でき、また目的とする組織の増殖速度を速めることもできる。

水溶性エラスチンと水溶性架橋剤との架橋反応の条件は特に限定されるものではないが、反応温度は常圧またはォ一トクレーブなどの加圧下で 4 ~ 1 5 0 °Cの範囲であることが好ましい。特に架橋の操作性の点から 1 0〜 1 2 0 °Cの範囲が好ましい。また本発明のエラスチン架橋体が空隙を有するスポンジ状である場合には、反応温度を制御することにより、空隙の直径を制御することができる。例えば、反応温度が 4〜 5 0 °Cの範囲では、空隙の平均直径が 2 0 m以上の架橋体を得ることができ、 5 0〜 1 5 0 °Cの範囲では空隙の平均直径が 2 0 z m未満の架橋体を得ることができる。

本発明のエラスチン架橋体の成形方法は特に限定されるものではないが、一般的な合成樹脂の成形に用いられる成形用の型を用いて得ることができる。例えば水溶性エラスチンと本発明の水溶性架橋剤を混ぜ合わせ、水溶性エラスチン水溶液とした後、成形器に流し込み、ォ一トクレ —プなどで加熱し架橋させると、その錶型を反映した糸状、膜状、棒状、ペレヅト状またはチューブ状などのエラスチン架橋体を得ることができる

本発明のエラスチン架橋体は、生体と同じ領域の弾性を有するため伸縮性に優れ、化粧品、医療用具として有効に用いることができる。特に限定されるわけではないが、例えば化粧品としては、スキンケア商品としてのフェイスマスク用基材として利用できる。医療用具としても特に限定されるわけではないがカテーテル、シャンテ、創傷被覆剤等の部品に成形し適用したものは、従来にない柔軟な機能を提供することとなる ₍ またこれらを再生医療用材料として本発明の医療器具を体内に埋め込んだ場合には、目的とする組織が体内で順調に増殖し易くなる。特に前述した神経細胞や血管に対して有効である。

さらに細胞増殖速度を速め、生体適合性を改善するために、エラスチン架橋体と第 3成分を含有させて本来のエラスチンにはない機能を付与することもできる。例えば、坑血栓性があり細胞増殖因子と相互作用するへパリンゃ細胞増殖因子を含有させることができる。

これらの第 3成分は、エラスチン架橋体を作製するときに、予め原料として加えておき架橋体を形成させてもよく、またエラスチン架橋体を形成させた後、その構造体に含浸させたり、その後乾燥させて物理的に吸着させたりしても良い。また更には、第 3成分の脱理を抑えるために該エラスチン架橋体に化学的に固定化しても良い。

本発明のェラスチン架橋体は D D S (ドラヅグ ·デリバリ一 ' システム）の一つである徐放担体としても使用できる。特に本発明のエラスチン架橋体は高いヤング率（弾性率）と空隙を有するスポンジ構造体を得ることができ、神経、血管などの治療に効果を発揮することができる。本発明の医療用具は、前述のような機能、効果を有することから、外科治療法に用いた場合には特に有効である。例えば現在シートの片面にフイブリン、トロンビン等の血液凝固成分を固着させたコラーゲンシートが、手術後の止血用接着剤として用いられている。これは、手術によつて生じた内臓の出血個所をシ一トで多い、血液凝固成分による止血とコラーゲン膜による物理的圧迫による止血の相乗効果と、取扱い易さを狙ったものであるが、コラーゲンシートは伸縮性が乏しく、心臓のような激しく動く臓器に適用した場合、圧着性が良くなかった。これに本発明のエラスチン架橋膜を使用することで、伸縮性が高く臓器の動きに対応できる膜を得ることができる。また更には、本発明のエラスチン架橋膜とコラーゲンの複合体を形成させれば、エラスチンの持つ伸縮性とコラーゲンの持つ細胞接着性の両者の特徴を有する、極めて生体適合性の高い膜が得られる。

本発明のエラスチン架橋体は、前述の様に体内に埋め込み、血管や神経の再生の場としても利用できるが、この機能を体外でも利用することができる。すなわち、再生医療用培養基材として、本発明の膜表面、チュ一ブ内に、方向付けされた胚性幹（E S ) 細胞、体性幹細胞、間葉系幹細胞などを移植、培養することで、希望する形態の臓器を形成させることが可能となる。本発明のエラスチン架橋体は、成形性が良いだけでなく生分解性でもあるため、ある程度培養し、.. 形を形成させた臓器を培養基材ごと移植するカートリッジ型の再生医療方法と再生組織を提供でぎる。 W 02

17 実施例

以下実施例をもって本発明を詳細に説明する。本実施例においては特に断りがない限り「％」は「重量％」を意味する。

実験例 1 (水溶性エラスチンの調製）

粉末状水不溶性エラスチン（エラスチン · プロダクト（Elastin product) 社製） 20g に対し 0.25M シユウ酸 150ml を加え、 100 °Cにて 1 時間処理する。冷却後、遠心分離（3000rpm，30iiin ) し、上澄みを集めセルロース性透析チューブ（分画分子量 6 千〜 1 万）に入れ、脱ィォン水に対して 48時間透析しシユウ酸を除去する。その後凍結乾燥して水溶性エラスチンを得た。原料エラスチンと水溶性エラスチンのアミノ酸分析結果を表 1に示した。

【表 1】エラスチン水溶性エラスチン

(mol%) (mol%)

ァスパラギン酸 0. 612 0. 542

トレ才ニン 0. 778 0. 983

セリン 0. 665 0. 964

グノレタミン酸 1. 668 1. 923

グリシン 33. 22 30. 869

ァラニン 22. 78 25. 512

システィン 0. 376 0. 562

ノリン 13. 374 12. 652

イソロイシン 2. 568 2. 249

ロイシン 6. 235 6. 001

チロシン 0. 703 0. 976

フエニノレアラニン 2. 967 3. 023

リシン 0. 279 0. 381

ヒスチジン 0. 037 0. 063

ァノレギニン 0. 516 0, 68

ヒドロキシプロリン 1. 168 1. 007

プロリン 11. 699 11. 612

八き- '

に： I μ Γ 100. 00 100. 00 実験例 2 (架橋剤としてグルタルアルデヒドを使用しエラスチン架橋体を作製）

脱イオン水に、実験例 1で得た水溶性エラスチン 90mg を加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に 250mM グルタルアルデヒド水溶液（東京化成社製） 48. 7 1 を加え、直後にゲル状のェラスチン架橋体を得た。該ゲル状のエラスチン架橋体は成形用の直径 2mm、長さ 2cm円柱状のテンプレートに流し込もうとしたが、流動性が小さく流し込むことはできなかった。 250 m Mグルタルアルデヒド水溶液の添加量を前述の 1八 0の量に下げても、テンプレートに流し込むことが困難であった。

実験例 3 (架橋剤としてエチレングリコールジグリシジルエーテルを使用しエラスチン架橋体を作製）

脱イオン水 41 . 6〃1 に、実験例 1で得た水溶性エラスチン 36mgを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に 287mM エチレングリコ一ルジグリシジルェ一テル水溶液 42. を加えよくかき混ぜ、その溶液を直径 2mm、長さ 2cm 円柱状のテンプレートに流し込み、 50°C；、 1 時間加熱してゲル状のエラスチン架橋体を得た。得られたゲル状のェラスチン架橋体を脱イオン水で充分洗浄し両端を指で引っ張り簡易伸張試験を行った結果、伸長の変形に対して壊れやすかつた。

実験例 4 (架橋剤として水溶性カルポジイミドを使用しエラスチン架橋体を作製）

脱イオン水に、実験例 1で得た水溶性エラスチン 50mgを加え溶解させ、水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液に 274mM 水溶性力ルボジイミド（WSCD、ペプチド研究所社製）水溶液 10.4 l を加え、更に 645 m アジピン酸水溶液 24.4 z l 加えよくかき混ぜ、 30 %エラスチン水溶液を作成した。結果、長鎖ジカルボン酸は脱イオン水には溶解せず（ァルカリ性の場合は溶解するが、その場合はカルポジイミドとの反応性が速く、やはり溶解不完全のまま一部固化し、各種テンプレート（型：ガラス管、膜作成用型など）に流し込むのは不可能であった。

実験例 5 (架橋剤として光反応性スクシンィミドエステルを使用しエラスチン架橋体を作製）

脱イオン水 1mlに、実験例 1で得た水溶性エラスチン 13mgおよび光反応性スクシンイミドエステル（NHS-ASA、 N—ヒドロキシスクシンィミジル一 —アジドアレチゾレ酸 ( N-hydroxysuccinimidyl-4-Azidosalicylic Acid) , ピアス社製（PIERCE) ) 4mgを加え溶解させ、室温で 1 日反応させた。反応終了後、未反応物を除去し精製し、光反応性エラスチン 7mg を得た。これに脱イオン水 20 / 1 を加えて光反応性エラスチン水溶液とし、 365 nmの紫外線（UV) 照射を 90分間行いゲル状化させた。ゲル化後は脱イオン水で充分洗浄した。結果、架橋剤は水不溶性であるため反応性は低く、有機溶媒中ではエラスチンが不溶化するためやはり反応性が悪かつた。光照射に関しても、エラスチン水溶液の濃度が薄い（数％) 場合は UV 光が透過するが、 10%以上の濃度では、光の照射面のみの反応で集結するためゲル化率が悪く、テンプレート内での反応はほぼ不可能であつた。

実験例 6 (架橋剤としてアジピン酸スクシンィミドエステルを使用しェラスチン架橋体を作製）

脱イオン水 119 μ. \ に、実験例 1で得た水溶性エラスチン 60 mg を加え溶解させた後、 385 mMアジピン酸スクシンィミドエステル水溶液を 21 加え、該水溶液を直径 2mm、長さ 2cm円柱状のテ,ンプレートに流し込み、 80°Cで 1 時間加熱しゲル化させた。結果、架橋剤が一部不溶化しているためか、生成したゲルは弱い（テンプレートの形はなしていない）。ドデカンジカルボン酸スクシンィミドエステルは水に不溶のため反応しなかったら実験例 7 (水溶性架橋剤 [ A ]の作製）

ジカルボン酸の力ルポキシル基を 4-hydroxyphenyldimethyl- sulfoniummethylsulfate ( 4—ヒドロキシフエ二ルジメチル一スルホ二ゥムメチルサルフェイト：以下 DSP) により活性エステル化させた。 DSP による活性エステル化には、ペプチド化学等で報告されている方法（K. Kouge, T. Koizumi, H. Okai, and T. Kato. (1987) Bull. Chem. Soc. Jpn., 60, 2409. (日本化学会報誌）を用いて、以下の実験を行った。ドデカンジカルボン酸（2.5 mmol)と DSP (5 mmol)をァセトニトリル (35ml) に 60°Cで溶解し、放冷後 dicyclohexylcarbodiimide (ジシクロへキシルカルポジィミド：以下 DCC) (5醒 ol)を加え 25°Cで 5 時間撹拌した。その後反応中に生じたジシクロへキシル尿素（以下 DC-Urea) をガラスフィル夕一でろ過し除去した。更に、反応溶液（ろ液）をェ一テル（70ml) に滴下して固化させた。該固形物を減圧乾燥して、本発明の水溶性架橋剤 [A] l . 4 gを得た。得られた架橋剤の純度は 1H-NMR (JNM-EX-500, JE0L) による測定で 9 8 %であった。

実験例 8 (架橋剤として実験例 7で得た水溶性架橋剤 [ A ]を使用しエラスチン成形体を作製）

脱イオン水 1 m 1に、実験例 1で得た水溶性エラスチン 2 0 0 m gを加えてよく撹拌し、 2.0 %水溶性エラスチン水溶液を得た。該水溶液の温度を 2 5 °Cとし、これに実験例 Ίで得た水溶性架橋剤 [A] 7 2 /mol (該水溶液中のエラスチンのアミノ基量（24 zmol) の 3倍量）を加え 5 分間撹拌した。次にトリェチルァミンを 24 /mol 加え更に 5分間撹拌した後、直径 2mm、長さ 2cm 円柱状のテンプレートに流し込み 2日間静置しゲル化させ、脱イオン水で充分洗浄し乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。また、得られたエラスチン成形体を 1 1 0 °Cで 1 0分間ォ一トクレープ処理を行い、形状に変化が見られない滅菌されたエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のヤング率を引つ張り強度試験機を用いて測定した結果を表 2に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を 9 0倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図 1に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は 62 m であった。空隙の異なるエラスチン架橋体の弾性率を表 2に示した【表 2】

実験例 9 (架橋剤として実験例 7で得た水溶性架橋剤 [ A ]を使用し架橋条件を変えエラスチン成形体を作製）

該水溶液の温度を 5 0 °Cとし静置時間を 6時間とした以外は、実験例 8の製造に準じて架橋反応並びに成形を行い、乳白色で弾性に富む棒状のエラスチン成形体を得た。得られたエラスチン成形体のャング率を引つ張り強度試験機を用いて測定した結果を表 2に示す。但し測定は得られたエラスチン成形体をそのまま使用し水中にて行った。また、得られたエラスチン成形体の切断面を 9 0倍の倍率で走査型顕微鏡撮影した物を図 2に示す。電子顕微鏡写真から、エラスチン架橋体の内部構造は、空隙を有するスポンジ構造であり、その平均直径は 9 mであった。

実験例 1 0 (エラスチン含有量を全体の 1 %としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）

実験例 1で得た水溶性エラスチン 0.8mgおよびゼラチン 72mg に脱ィオン水 148 z lを加えて溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤 278mM、 39^ 1 (架橋剤はエラスチンのアミノ基量の 2倍に相当）加え、 30%水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、 120°C、 30 分間オートクレーブで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図 3 ) を得た。

実験例 1 1 (エラスチン含有量を全体の 1 0 %としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製） '

実験例 1で得た水溶性エラスチン 8mgおよびゼラチン 72mgに脱ィォン水 148 ^ 1 を加えて溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤 278mM、 39 l (架橋剤はエラスチンのアミノ基量の 2倍に相当）加え、 30%水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、 120°C；、 30 分間オートクレープで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図 4) を得た。

実験例 1 2 (エラスチン含有量を全体の 90%としたエラスチン架橋体およびその成形体を作製）

実験例 1で得た水溶性エラスチン 72ingおよびゼラチン 8mgに脱イオン水 148 1 を加えて溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤 278mM_N 39 l (架橋剤はエラスチンのアミノ基量の 2倍に相当）加え、 30%水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、 120°C；、 30 分間オートクレープで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図 5 ) を得た。

実験例 13 (エラスチン含有量を全体の 0%としたゼラチン架橋体およびその成形体を作製）

ゼラチン 80mgに脱イオン水 148 lを加えて溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤 278mM、 39/ l (架橋剤はエラスチンのアミノ基量の 2倍に相当）加え、 30%水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、 120°C、 30 分間オートクレープで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体およびその成形体（図 6 ) を得た。

実験例 1 0〜 1 3の結果をまとめると、エラスチン含有が 0%の場合は膨潤が大きいが（水中で、 6 時間後、テンプレートの直径の 2.3 倍程度にまで膨潤した）、 1 %含有のゲルからは形状がしっかりしたゲルが形成された（図 7 ：エラスチン含有 0,1,10,90%)。他のゲルの膨潤性は 1% ゲルでテンプレートの 1.5倍程度、 10%ゲルでテンプレートの 1.4倍程度、 90%ゲルでテンプレートの 1.1倍程度であった。

エラスチンの含有率が高くなるにつれ、その形状安定性は高い。伸長させた場合は、弾性率は不明だが含有率の低いゲルの方がちぎれやすく、強度が低い。ゲルの色は水溶性エラスチン溶液が黄色なため含有率が高くなるにつれ、その影響が出て黄色味を帯びた。

実験例 1 4 (架橋原料がさらに糖質を含有したエラスチン架橋体およびそのエラスチン成形体を作製）

実験例 1で得た水溶性エラスチン 75mgおよびへパリン 5iiigに脱イオン水 148 1 を加えて溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤 278mM、 39〃1 (架橋剤はエラスチンのアミノ基量の 2倍に相当）加え、 30 %水溶性エラスチン水溶液を作製した。該水溶液を成形型に流し込み、 120。C、 30 分間オートクレープで加熱しエラスチン架橋体およびその成形体（図 8 ) を得た。

実験例 1 5 (へパリン含有の確認）

作成したゲルを脱イオン水で充分洗浄した後、 1 % トルイジンプル —"0"水溶液中で染色した。トルイジンブルー" 0"はへパリンに結合すると青紫に染色される。図 9よりへパリンがゲルに取り込まれていることが確認できた。

実験例 1 6 (エラスチン膜の作製）

リペルシラン処理（シリコンコート）したスライドガラスを 2 枚用い、スぺ—サ—としてシリコンゴムシ—トを用いた成形用の型を用意し、実験例 1で得た 30% 水溶性エラスチン水溶液と実験例 7で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して 3倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気 '水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で 80°C、 30分間加熱処理し、エラスチン膜（図 1 0 ) を得た。実験例 1 7 (エラスチン各種成形体の調製）

各種成形用の型を用意し、 30% 水溶性エラスチン水溶液と実験例 7で作製した水溶性架橋剤（エラスチンのアミノ基に対して 3倍モル）を混合した溶液を流し込み、外部より空気 '水が入らないようにした。この状態を保ちながら水中で 80° (、 30 分間加熱処理し、チューブ状（図 1 1 )、糸状（図 1 2 )、ペレツト状（図 1 3 ) の成形物を得た。実験例 1 8 (細胞培養方法と増殖速度）

組織培養用プラスチックシャーレ（6穴）にエラスチン膜（厚さ 0.5mm, lcmx lcm) をおき、培養液を 2ml 加え 37°Cで 30分間静置した。培養液は MEMハンクス粉末 2.57gに脱イオン水 215ml を加え溶解した後、重曹溶液（7.5% ) を 1. 17ml、グルタミン溶液（200mM) を 2.5ml、非必須アミノ酸溶液を 2.5ml 添加、ゲンタマイシン 5ml そして牛胎児血清を 25ml添加して作製した。

これに神経細胞芽腫細胞（ニューロブラストーマ、 IMR-32 (ATCC No. CCい 127)を 1. 0 X 10⁴ cel l/ml濃度で 100 / 1播種して 24時間 37°Cでィンキュベーションした後、経時的に細胞数を細胞計測板あるいは直接観察にて計測した。

対象として、アルブミンコートを用いた場合の、細胞増殖性を評価したまた培地は毎日交換した。実験回数は 3回行った。

(結果）エラスチン（シート）の細胞播種から 3 日後の細胞増殖率は約 4 倍程度。アルブミンコートの場合は細胞播種から 3 日後の細胞増殖率は約 1.5倍程度であった。増殖曲線を図 1 4に示した。

実験例 1 9 (繊維芽細胞増殖因子（ F G F ) とへパリンを含有したエラ水溶性エラスチン 75 mg およびへパリン 5 mg に脱イオン水 148 を加え溶解させた後、実験例 7で作製した水溶性架橋剤（278 mM) 39 μ 1 を加え、 30%エラスチン水溶液を作成する。溶液を成形型に流し込み、 120°C (ォ一トクレーブ）で 30 分加熱して反応させた。作成したゲルを 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5 )で洗浄した後、 2〃§/]111塩基性繊維芽細胞増殖因子（bFGF )を含む 0.1Mリン酸緩衝液（pH7.5 )に 24時間浸し、ゲルに含有したへパリンに吸着させた。得られた成形物を図 1 5に示した。

産業上の利用可能性

本発明のエラスチン架橋体は、細胞接着性夕ンパク質の脱理が起こらず、生体移植に適合し得る弾性を有した材料であるため、従来の材料に生じていた長期の治療の間に該細胞接着性夕ンパク質が脱離する問題や、神経や血管などの組織の再生が不十分である問題などを解決する効果を 3」る。

また、本発明の水溶性架橋剤は、水溶性エラスチンを架橋し、錄型があればどんな成形も可能な弾性を有するエラスチン架橋体が得られるため、その成形体を糸状や膜状、棒状、ペレット状、チューブ状、更には再生医療用材料や医療用器具材料などに加工し、幅広い用途での利用を可能とする効果を有する。

更に、本発明のエラスチン架橋体は、空隙を有するスポンジ構造を形成することから、薬剤などの浸透や、他の材料との複合を容易に行うことができ、新しい医療用材料の提供を可能とする効果を有する。

Claims

O 02/096978 26 請求の範囲

1 . 水溶性エラスチンから選ばれた 1種以上を含有する架橋原料が、水溶性架橋剤で架橋されてなるエラスチン架橋体。

2 . 架橋原料がさらに、コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セル口一ス、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ一ナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 - (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮.増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神絰栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロェチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンェ —テル、ポリテトラメチレングリコ一ル、ポリエチレングリコ一ル、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1 種以上を含有する請求項 1記載のエラスチン架橋体。

3 . 水溶性エラスチンの含有率が 0 . 5〜 9 9 . 5重量％の範囲である請求項 1記載のエラスチン架橋体。

4 . ヤング率が 1 X 1 0 ²〜 1 X 1 0 ⁷ P aの範囲のである請求項 1記載のエラスチン架橋体。

5 . 内部構造が空隙を有するスポンジ構造である請求項 1記載のエラスチン架橋体。

6 . 空隙の平均直径が 2 0 z m未満の範囲である請求項 5記載のエラスチン架橋体。

7 . 空隙の平均直径が 2 0 π！〜 2 m mの範囲である請求項 5記載のェラスチン架橋体。

8 . コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグル夕ミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ —ナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- α (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、シリコーン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコ一ル、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1種以上が化学的に結合された請求項 1または 2記載のエラスチン架橋体。

9 . 化学的結合が架橋剤を用いた架橋である請求項 8記載のエラスチン架橋体。

1 0 . コラーゲン、ゼラチン、フイブロネクチン、フイブリン、ラミニン、カゼイン、ケラチン、セリシン、トロンビンであるタンパク質、ポリグルタミン酸、ポリリジンであるポリアミノ酸、ポリガラクチュロン酸、へパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン、デキストラン硫酸、硫酸化セルロース、アルギン酸、デキストラン、カルボキシメチルキチン、ガラクトマンナン、アラビアガム、トラガントガム、ジエランガム、硫酸化ジエラン、カラャガム、カラギ一ナン、寒天、キサンタンガム、力一ドラン、プルラン、セル口 —ス、デンプン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、大豆水溶性多糖、グルコマンナン、キチン、キトサン、キシログルカン、レンチナンである糖質、 bFGF (塩基性線維芽細胞増殖因子）、 TGF- α (形質転換増殖因子ひ）、 EGF (上皮増殖因子）、 VEGF (血管内皮増殖因子）、 CTNF (毛様体神経栄養因子）である細胞増殖因子、ポリメタクリル酸メチル、ポリジメチルシロキサン、ポリテトラフルォロエチレン、シリコ —ン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフ夕レート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ力プロラクトン、ポリプロピレンエーテル、ポリテトラメチレングリコール、ポリエチレングリコ一ル、ポリ乳酸、ポリビニールアルコール、およびポリリンゴ酸から選ばれた 1種以上を含有する請求項 1、 2または 8記載のエラスチン架橋体。

1 1 . 水溶性架橋剤が分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にァミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物である請求項 1記載のエラスチン架橋体。

1 2 . 水溶性架橋剤が、下記一般式で表される,水溶性化合物であることを特徴とする請求項 1記載のエラスチン架橋体。

<一般式 >

[ R ! s R ₃は下記の構造式で表される < A >または の何れかであり、と R ₃とは同じであっても異なっていてもよく、

< A >

(R₂は下記の構造式で表される < C>または <D>の何れかで表される化合物であり、）

< O

'^^{C 2} ~ (nは 1〜 20までの整数である。）

<D >

(m、 1は 0〜 1 5までの整数であり、 X、 Yは、 CH₂または◦の何れかであり、 Xと Yとは同じであっても異なっていてもよく、 Zは Cまたは Nの何れかであり、 Rい R₇、 R₈、 R₉は、 H、 C H ₃ s C₂H₅の何れかであり、それそれ同じであっても異なっていても良い。）

13. 請求項 1〜 1 2の何れか 1項記載のエラスチン架橋体からなるェラスチン成形体。

14. 形状が、糸状、膜状、棒状、ペレット状またはチューブ状である請求項 13記載のエラスチン成形体。

1 5. 請求項 1記載のエラスチン架橋体を用いた医療用器具。

1 6. 請求項 1 5記載の医療用器具を用いることを特徴とする外科治療方法。

17. 請求項 1記載のエラスチン架橋体、請求項 1 5記載の医療用器具を用いることを特徴とする再生医療。

18. 請求項 1記載のエラスチン架橋体を用いて得られた再生組織。

1 9. 分子中心領域に疎水性部を有し、両末端にァミノ基と反応する活性エステル基を有する水溶性化合物を含有する架橋剤。

20. 化合物が、下記一般式で表される化合物である請求項 1 9記載の架橋剤。

<一般式 >

(Rい R ₃は下記の構造式で表される <A>または の何れかであり、 R iと R₃とは同じであっても異なっていてもよく、）

< A>

(R₄、 R₅は H、 CH₃、 C ₂ H₅のいずれかであり、 R₄と R₅とは同じであっても異なっていてもよい。）

(R ₂は下記の構造式で表される < 0または<0>の何れかで表される化合物であり、）

<C>

"(CH₂

(nは 1〜 20までの整数である。）

<D >

(m、 1は 0〜 1 5までの整数であり、 X、 Yは、 C H₂または 0の何れかであり、 Xと Yとは同じであっても異なっていてもよく、 Zは Cまたは Nの何れかであり、： R₆、 R₇、 R₈、 R_gは、 H、 CH₃、 C₂H₅の何れかであり、それそれ同じであっても異なっていても良い。）

2 1. 請求項 1 9記載の水溶性架橋剤を用いた架橋反応により、水溶性エラスチンを架橋することを特徴とするエラスチン架橋体の製造方法。

22. 架橋反応時の反応温度が 4〜 1 50°Cの範囲であることを特徴とする請求項 2 1記載のエラスチン架橋体の製造方法。