WO2011102363A1 - 化学修飾水溶性エラスチン、化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの混合ゲル及びそれらの製造方法 - Google Patents
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- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
Definitions
- the present invention relates to chemically modified water-soluble elastin, a mixed gel of chemically modified water-soluble elastin and collagen, and methods for producing them, which may be used for applications such as artificial blood vessel materials.
- Artificial blood vessels are mainly used as substitutes for blood vessels in the body in the case of cardiovascular diseases and injuries.
- An example of an artificial blood vessel that is currently attracting attention is a hybrid artificial blood vessel in which collagen, gelatin, elastin, fibronectin or the like is introduced into a synthetic polymer material and cells are seeded.
- This hybrid type artificial blood vessel has a problem that cells are peeled off by being influenced by intense blood flow.
- the base material is a synthetic polymer, there is also a problem in terms of biocompatibility.
- an anticoagulant is used so that the blood vessel lumen is not narrowed by a thrombus There is a problem that you have to continue drinking. Furthermore, when this artificial blood vessel is transplanted in the growth phase, there is a problem that the artificial blood vessel must be transplanted again by surgery along with the growth.
- e-PTFE expanded porous polytetrafluoroethylene
- this polymer is excellent in non-adhesiveness and flexibility.
- e-PTFE expanded porous polytetrafluoroethylene
- biopolymers are attracting attention as materials that can replace synthetic polymers.
- collagen is present in large amounts in the living body (occupies about 1/3 of proteins in the living body) and has biocompatibility and cell adhesiveness, and attempts have been made to produce artificial blood vessels using this.
- 100% collagen has a problem in strength.
- Elastin is a protein that is present together with collagen in connective tissues such as the dermis, ligaments, tendons and blood vessel walls of the skin of animals, particularly mammals. Elastin usually exists as an insoluble protein having a three-dimensional network structure in vivo. It is widely known that the above-mentioned water-soluble elastin can be obtained by hydrolyzing such elastin with an acid or an alkali or treating it with an enzyme. Water-soluble elastin has the ability to retain abundant moisture, so it is used as a cosmetic product, especially as a moisturizer, and as a health food with collagen, etc. Has been.
- the water-soluble elastin is mixed with a solubilized cogen to obtain a molding composition (Patent Document 1), or a collagen layer is provided on the inner wall surface of the artificial blood vessel base material.
- a molding composition Patent Document 1
- a collagen layer is provided on the inner wall surface of the artificial blood vessel base material.
- Cross-linking with a cross-linking agent Patent Document 2
- the present inventors have proposed a method for obtaining water-soluble elastin (Patent Document 4).
- An object of the present invention is to provide a medical material such as an artificial blood vessel that is excellent in biocompatibility and has sufficient strength, elasticity, and extensibility by utilizing water-soluble elastin and collagen.
- One aspect of the present invention is to N-acylate part or all of the primary amine and secondary amine contained in the high molecular weight water-soluble elastin molecule, and to form one of the carboxyl groups contained in the molecule.
- a chemically modified water-soluble elastin obtained by coupling a part or all of the amino group with an amino group of an alkyl ester of an amino acid.
- N-acylation includes N-formylation, N-acetylation, N-benzoylation, etc., and N-acetylation is preferred.
- a urethane type or an alkyl type may be used.
- the amino acid used for acid amidation with the amino acid alkyl ester of the carboxyl group of elastin is selected from about 20 types such as glycine, valine, and phenylalanine constituting the protein.
- “high molecular weight water-soluble elastin” means that having a molecular weight of about 10,000 or more, preferably about 30,000 to 300,000.
- Another aspect of the present invention is to N-acylate part or all of a primary amine and a secondary amine contained in a molecule of high molecular weight water-soluble elastin and a part of a carboxyl group contained in the molecule.
- a chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel obtained by mixing a chemically modified water-soluble elastin obtained by coupling all with the amino group of an amino acid alkyl ester and collagen.
- a chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel obtained by mixing substantially the same weight of collagen with the chemically modified water-soluble elastin is preferable.
- a chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel obtained by mixing a chemically modified water-soluble elastin and a smaller or larger amount of collagen. “Substantially the same weight” means that the weight ratio of chemically modified water-soluble elastin to collagen is within 95 to 105% by weight.
- Still another embodiment of the present invention is a method for producing the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel, wherein (1) part of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin. Or (2) coupling part or all of the carboxyl groups contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin with the amino group of a lower alkyl ester of an amino acid; and 3) A chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel comprising a step of preparing a mixed gel by mixing the chemically modified water-soluble elastin obtained through the steps (1) and (2) with collagen in a solution state. It is a manufacturing method. Also in this embodiment, a method of mixing chemically modified water-soluble elastin and collagen of approximately the same weight is preferable. Also preferred is a method of mixing chemically modified water-soluble elastin and a smaller or larger amount of collagen.
- a further aspect of the present invention is as follows: (1) N-acylation of part or all of the primary amine and secondary amine contained in the high molecular weight water-soluble elastin molecule; (2) the high molecular weight water soluble A step of coupling a part or all of the carboxyl group contained in the molecule of elastin with an amino group of a lower alkyl ester of an amino acid, (3) a chemically modified aqueous solution obtained through the steps (1) and (2) Chemically modified water-soluble elastin / collagen mixture comprising the steps of: mixing elastin with collagen in solution to prepare a mixed gel; and (4) irradiating the mixed gel obtained in (3) with radiation. It is a manufacturing method of a gel.
- a method of mixing chemically modified water-soluble elastin and collagen of approximately the same weight is preferable. Also preferred is a method of mixing chemically modified water-soluble elastin and a smaller or larger amount of collagen.
- Yet another aspect of the present invention is the use of the above chemically modified water-soluble elastin as a medical material. Still another aspect of the present invention is the use of the above chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel or the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel produced by the above production method as a medical material. is there.
- the medical material includes an artificial blood vessel material and the like.
- the material obtained from the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel of the present invention is greatly improved in strength, elasticity and extensibility compared to elastin or collagen alone or a mixture thereof, medical treatment such as artificial blood vessels There is a high possibility that it can be used as a material.
- amino acids with high hydrophobicity are used as amino acids for chemical modification, or when peptides with high hydrophobicity are used for chemical modification, the strength, elasticity and An extensible artificial blood vessel material or the like can be produced.
- a curve showing the relationship between temperature and turbidity of unmodified water-soluble elastin (Ela) at pH 5.0, 7.4 and 9.0.
- N-acetyl-OG-methyl ester water-soluble elastin produced by coupling N-acetyl water-soluble elastin (N-Ac-Ela) and glycine (G) methyl ester using WSCI (100 eq) (Cm ( Turbidity curves of G) -Ela) at pH 5.0, 7.4 and 9.0.
- PH of N-acetyl-OG-methyl ester water-soluble elastin (Cm (G) -Ela) prepared by coupling N-Ac-Ela and glycine (G) methyl ester using WSCI (10 eq). Turbidity curves at 0, 7.4 and 9.0.
- PH of N-acetyl-OG-methyl ester water-soluble elastin (Cm (G) -Ela) prepared by coupling N-Ac-Ela and glycine (G) methyl ester using WSCI (50 eq). Turbidity curves at 0, 7.4 and 9.0.
- Col single gel (1.5mg / ml), Ela-Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), Cm (G) -Ela-Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) ml) Stress-strain curve.
- Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) and Cm (G) -Ela / Col mixed gel (Cm (G) -Ela / Col mixed gel) Stress-strain curve with a mixing ratio of 4.5 mg / ml: 1.5 mg / ml.
- Cm (G) -Ela ⁇ Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml)
- Cm (V) -Ela ⁇ Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: A stress-strain curve comparing the stress and strain up to 60% strain of 1.5 mg / ml)
- Cm (F) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5 mg / ml: 1.5 mg / ml) and porcine aorta.
- Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), Cm (G) -Ela / Col mixed Gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) and porcine aorta stress and strain Stress-strain curve compared.
- Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), Cm (G) -Ela / Col mixed Gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) and up to 50% strain of porcine aorta Stress-strain curve comparing the stress and strain.
- water-soluble elastin of the present invention is derived from mammals and birds
- about 78 to 85% of amino acids constituting elastin are composed of proline, glycine, alanine and valine, and about 2 to 4% are aspartic acid and glutamic acid.
- about 1-2% consisting of lysine, histidine, arginine, about 0.1-0.4% consisting of desmosine and isodesmosine, having a molecular weight of about 10,000-300,000, preferably about 30,000-300,000 High molecular weight water-soluble elastin.
- water-soluble elastin of the present invention when the water-soluble elastin of the present invention is derived from fish, about 67 to 77% of the amino acids constituting elastin are composed of proline, glycine, alanine and valine, and about 4 to 6% are composed of aspartic acid and glutamic acid. About 2 to 4% consisting of lysine, histidine and arginine, about 0.1 to 0.4% consisting of desmosine and isodesmosine, and having a molecular weight of about 10,000 to 300,000, preferably about 30,000 to 300,000 It is water-soluble elastin.
- the chemically modified water-soluble elastin of the present invention N-acylates part or all of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin and the carboxyl group contained in the molecule. It is a chemically modified water-soluble elastin obtained by coupling a part or all of it with the amino group of an alkyl ester of an amino acid.
- N-acylation includes N-formylation, N-acetylation, N-benzoylation and the like, and N-acetylation is preferred.
- a urethane type or an alkyl type may be used.
- the amino acid used for the acid amidation with the amino acid alkyl ester of the carboxyl group of elastin may be any of about 20 types such as glycine, valine, and phenylalanine constituting the protein.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel first N-acylates part or all of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin. Step (first step), and then chemically modifying a part or all of the carboxyl groups contained in the resulting N-acylated water-soluble elastin molecule with the amino group of the lower alkyl ester of amino acid (first step). 2 steps), and then the resulting chemically modified water-soluble elastin is mixed in a solution state with almost the same weight, or a small amount or a large amount of collagen in a solution state to produce a mixed gel (third step). Is done.
- the radiation-modified chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel which is a further embodiment of the present invention is a method in which a part or all of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin are first N-acyl. Next, a part or all of the carboxyl groups contained in the obtained N-acylated water-soluble elastin molecule are coupled with amino groups of lower alkyl esters of amino acids and chemically modified (second step). ) Further, chemically modified water-soluble elastin obtained through the first step and the second step is mixed with collagen in a solution state to prepare a mixed gel (third step), and then the obtained mixed gel is used.
- Obtained by irradiation with radiation (fourth step). Also in this embodiment, it is produced by a step of preparing a mixed gel by mixing chemically modified water-soluble elastin in a solution state with almost the same weight, or a smaller amount or a larger amount of collagen.
- the weight ratio of chemically modified water-soluble elastin to collagen is preferably 1/200 to 200/1, more preferably 1/100 to 50/1, and still more preferably 1/50 to 5/1, particularly preferably 1/3 to 3/1.
- the weight ratio is 1/50 to 5/1 is preferable, and when an artificial fiber, an artificial anti-adhesion membrane, an artificial suture or an artificial membrane is produced instead of a substitute for living tissue, it is better that the range of elastin weight / collagen weight is wide.
- the weight ratio is preferably 1/100 to 50/1, and when applied to other than living organisms such as synthetic fibers and synthetic membranes, the range of elastin weight / collagen weight is wider.
- the weight ratio is preferably 1/200 to 200/1.
- the N-terminus of water-soluble elastin and the amino group of the side chain of amino acid residues such as lysine and arginine are acylated, and the carboxyl group of the side chain of amino acid residue such as aspartic acid and glutamic acid, etc.
- amino group of amino acid alkyl ester are coupled to obtain chemically modified water-soluble elastin.
- the charge of elastin disappears.
- hydrophobic interaction between elastin molecules increases, and the resulting chemically modified water-soluble elastin is unmodified. It is considered that it has higher self-assembling properties than elastin.
- insoluble elastin is obtained by removing collagen and other unnecessary proteins from animal biological tissue, and then this insoluble elastin is immersed and dissolved in a solubilizing solution such as oxalic acid or sodium hydroxide. Produces water-soluble elastin.
- Collagen and other unwanted protein removal treatment is an alkaline solution containing at least one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and barium hydroxide, and sodium hydroxide added to the alkaline solution.
- the total amount of potassium hydroxide, calcium hydroxide and barium hydroxide is 0.05 to 0.5 mol, preferably 0.05 to 0.3 mol, and 90 to 105 ° C.
- tissue per liter, It is preferable to immerse the tissue for 5 to 60 minutes, preferably 10 to 20 minutes.
- animal biological tissue is placed in a salt solution containing at least one of sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, and barium chloride. It is also preferable to perform an immersion treatment (pretreatment) for immersion.
- the animal living tissue is not particularly limited, but it is preferable to use a ligament or aortic blood vessel obtained from mammals such as pigs, horses, cows, sheep, etc. in view of a high content of elastin.
- aortic blood vessels of birds and arterial spheres (hearts) of fish with high elastin content may be used.
- Animal biological tissue is preferably homogenized first using a homogenizer.
- any animal tissue such as a mixer or meat chopper can be shredded, and preferably a tool capable of shredding into 3 mm square or less, more preferably paste-like. It is preferable that the size of the shredded animal biological tissue is smaller because the efficiency of removing collagen and other unnecessary proteins can be increased.
- the homogenized animal biological tissue may be degreased by boiling it with hot water or a hot dilute alkaline aqueous solution, or treating it with an organic solvent, for example.
- solubilized solution examples include oxalic acid, formic acid, acetic acid, succinic acid, malic acid, tartaric acid, citric acid, benzoic acid, betaine, difluoroacetic acid, trifluoroacetic acid, phosphoric acid, sulfamic acid, perchloric acid, and trichloroacetic acid.
- An acidic solution containing at least one of them is used.
- the total amount of acid in this acidic solution is 0.05 to 5 mol, preferably 0.1 to 2 mol per liter, and the liquid temperature is preferably 90 to 105 ° C.
- the solubilizing solution may be an alkaline solution containing at least one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, and barium hydroxide.
- the total amount of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide and barium hydroxide added to this alkaline solution is 0.05 to 5 mol, preferably 0.05 to 2 mol per liter, and the liquid temperature is 90 to An alkaline solution at 105 ° C. is preferred.
- the second method includes a pretreatment step including at least one of removal processing of unnecessary parts of animal biological tissue, shredding treatment of animal biological tissue, degreasing treatment of animal biological tissue, and salt treatment; Filtration is performed by repeating the alkali extraction step of immersing the treated animal living tissue in an alkaline solution and filtering off collagen and other unwanted proteins, and the alkali dissolution step of dissolving the residue after the alkali extraction step with alkali a predetermined number of times.
- a method for producing water-soluble elastin by sequentially performing a filtrate recovery step for obtaining a filtrate containing water-soluble elastin and a water-soluble elastin production step for producing water-soluble elastin from the filtrate.
- the alkali used in the alkali dissolution step is preferably any one of sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, barium hydroxide, or a mixture.
- This operation is different from the first method in which collagen and other unwanted proteins are removed from the tissue to obtain insoluble elastin, and then the insoluble elastin is solubilized to obtain water-soluble elastin.
- This is a method for directly obtaining water-soluble elastin without obtaining insoluble elastin. That is, animal living tissue that has been shredded, degreased and salt-treated in an alkaline solution of 0.05 to 0.5 mol per liter, preferably 0.05 to 0.3 mol and 90 to 105 ° C., for 5 to 60 minutes.
- this treated tissue is immersed for 10 to 20 minutes to obtain a treated tissue from which collagen other than elastin and unwanted proteins have been removed, and then this treated tissue is 0.05 to 5 mol per liter, preferably 0.05 to 2 mol (of alkaline solution).
- This is a method of obtaining water-soluble elastin by immersing and dissolving in an alkaline solution at a higher concentration of 90 to 105 ° C. for 5 to 420 minutes, preferably 10 to 240 minutes (longer time).
- the water-soluble elastin obtained by the first or second method as described above neutralizes the aqueous solution containing the water-soluble elastin, and then the neutralized solution is subjected to, for example, dialysis treatment or nanofiltration (NF ) Desalination by membrane treatment using a membrane or the like, and removal of low molecular weight one yields the high molecular weight water-soluble elastin used in the present invention.
- NF nanofiltration
- any collagen known for medical use can be used as the collagen used in the present invention.
- Collagen suitable for medical use is usually extracted from an animal, which is a raw material, with an enzyme or the like under conditions of acid, alkali, neutrality, etc., and is a viscous collagen solution or a solid state obtained by drying this solution. The method of obtaining is generally used.
- the antigenic expression site can be removed by pepsin treatment, and collagen (atelocollagen) more suitable for a medical base material that is not antigenic when transplanted into the body or body surface can be obtained.
- Representative collagens used in the present invention include solubilized collagens such as acid-solubilized collagen, alkali-solubilized collagen, enzyme-solubilized collagen and neutral-solubilized collagen.
- Atelocollagen which has been subjected to removal of telopeptides that are antigenic determinants, is preferred.
- first, part or all of the primary amine and the secondary amine contained in the molecule of the high molecular weight water-soluble elastin are N-acylated, preferably , N-acetylation to obtain N-acetylated water-soluble elastin.
- amino acid residues constituting elastin examples of amino acids having a reactive primary amine or secondary amine (basic amino acids) include lysine, arginine and histidine.
- the primary amine contained in includes a terminal amino group.
- some or all of the primary amine and secondary amine contained in the high molecular weight water-soluble elastin molecule are preferably N-acetylated by an acetylating reagent such as acetic anhydride.
- the degree of acetylation is preferably 95% or more in terms of the modification rate represented by the following formula.
- Modification rate (%) (1 ⁇ B / A) ⁇ 100
- A represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the average value of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the water-soluble elastin.
- B represents a value obtained by subtracting the average value of the absorbance of the blank from the average value of the absorbance (wavelength of 345 nm) of the N-acetylated water-soluble elastin.
- a part or all of the carboxyl groups contained in the obtained N-acylated, preferably N-acetylated water-soluble elastin molecule are then coupled with the amino group of the alkyl ester of the amino acid for chemical reaction.
- a lower alkyl ester having 1 to 4 carbon atoms is preferable, and a methyl ester is particularly preferable.
- a benzyl ester or the like may be used.
- amino acids having a carboxyl group include aspartic acid and glutamic acid, but the carboxyl group contained in the molecule of high molecular weight water-soluble elastin includes a terminal carboxyl group. Is also included.
- N-acylated, preferably N-acetylated water-soluble elastin molecules, in which almost all of the carboxyl groups are coupled to the amino group of an amino acid alkyl ester are preferred.
- a coupling agent such as carbodiimide or a condensing agent.
- the chemically modified water-soluble elastin obtained as described above and the above-described aqueous solution of collagen are prepared, respectively, in an aqueous solution containing almost the same weight, or chemically modified water-soluble elastin for collagen.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel of the present invention is obtained.
- the obtained mixed gel can be used as a base for medical materials such as artificial blood vessels as it is or after undergoing appropriate processing.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel obtained as described above is irradiated with radiation such as electron beams or ⁇ rays in a swollen state or in a dry state. Irradiation chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel is obtained.
- radiation ⁇ rays are preferable, and a dose necessary for increasing the Young's modulus of the mixed gel is preferably doubled or more.
- the mixed gel is sterilized and cross-linked, and the strength of the material is further enhanced. Irradiation conditions are not particularly limited.
- irradiation at 20 to 50 ° C., preferably 30 to 40 ° C., about 0.5 to 50 kGy, preferably about 5 to 40 kGy is appropriate. It is.
- Modification rate of N-acetylation The modification rate of N-acetylation is measured and calculated as follows by the TNBS (2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid) method.
- N-Ac-Ela N-acetylated water-soluble elastin
- Each of water-soluble elastin (Ela), three types of chemically modified water-soluble elastin (Cm-Ela), type I collagen (Col) is PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) or pH 5.0, 7.4, Dissolved in 9.0 solution.
- PBS phosphate buffered saline, pH 7.4
- pH 5.0, 7.4 Dissolved in 9.0 solution.
- Each of these solutions is Ela alone, 3 Cm-Ela alone, Col alone, Ela and Col coexistence state, 3 Cm-Ela and Col coexistence state, wavelength 400 nm, temperature range 5 ° C to 65 ° C, temperature rise 0.5 Turbidity measurement was performed under the conditions of ° C / min and a nitrogen stream.
- the solvent used was ultrapure water or PBS in consideration of physiological conditions, and the measuring instrument was a spectrophotometer with a Peltier temperature controller (manufactured by JASCO Corporation: Ubest-50).
- porcine-derived water-soluble elastin 1) Isolation of porcine-derived insoluble elastin According to the following procedure, unnecessary protein and collagen other than NaCl-soluble and NaOH-soluble elastin were extracted and removed from porcine aortic defatted tissue.
- porcine aortic defatted tissue living tissue
- remove the unnecessary part by scraping off the low elastin content parts such as fat and muscle attached as pretreatment with a blade etc., and then living tissue was shredded by homogenizing using a homogenizer.
- the homogenized biological tissue was treated with hot water, a hot dilute aqueous alkali solution or an organic solvent such as acetone, degreased, and then dried.
- 1M sodium chloride of about 10 times the weight of the defatted dry tissue was added and stirred for 1 hour at room temperature to extract and remove NaCl-soluble unwanted protein. This operation was repeated 5 times, then washed with distilled water and drained by centrifugation (3,000 rpm, 5 minutes).
- water-soluble elastin derived from high molecular weight pig was chemically modified by N-acetylation and coupling of O-amino acid methyl ester.
- this solution was dialyzed for 1 week to remove the solvent and unreacted reagent, and lyophilized to obtain N-acetyl water-soluble elastin.
- the number of mole equivalents (eq) of the reagent is displayed based on the number of moles of the raw material used (1 mole equivalent) determined from the average molecular weight of N-acetyl water-soluble elastin. The same applies to the brief description of the drawings.
- this solution is dialyzed for 1 week to remove the solvent and unreacted reagents and freeze-dried, and three kinds of chemically modified water-soluble elastins, that is, N-acetyl-OG-methyl ester water-soluble elastin (Cm (G) -Ela), N-acetyl-OV-methyl ester water-soluble elastin (Cm (V) -Ela), N-acetyl-OF-methyl ester water-soluble elastin (Cm (F)- Ela).
- N-acetyl-OG-methyl ester water-soluble elastin Cm (G) -Ela
- N-acetyl-OV-methyl ester water-soluble elastin Cm (V) -Ela
- N-acetyl-OF-methyl ester water-soluble elastin Cm (F)- Ela
- FIG. 1 is a curve (turbidity curve) showing the relationship between temperature and turbidity of unmodified Ela at pH 5.0, 7.4 and 9.0
- FIG. 2 is a graph showing N-Ac-Ela and glycine (G) methyl ester with WSCI ( It is a turbidity curve in pH5.0, 7.4, and 9.0 of Cm (G) -Ela produced by coupling using 100 eq). From FIG. 1, Ela does not self-assemble at physiological conditions of 37 ° C. and pH 7.4.
- the reason for not self-assembling is that Ela has an isoelectric point on the acidic side (around pH 5.5). Therefore, in order to bring the isoelectric point near pH 7.4, in the present invention, the amino group is N-acetylated and the carboxyl group is chemically modified by coupling amino acid methyl ester.
- the self-assembly start temperature of the chemically modified water-soluble elastin (Cm-Ela) obtained was shifted to the low temperature side with respect to the self-assembly start temperature of Ela, and physiological conditions (pH 7 It can be seen that the turbidity intensity is sufficiently high at around 4). In addition, since the turbidity intensity is increased, and almost the same turbidity curve was obtained even at different pHs, the modification rate of carboxyl groups and the like by coupling of amino acid methyl ester should be almost complete. I understand.
- FIG. 3 and FIG. 4 are diagrams showing the relationship between the addition amount of the coupling agent (WSCI) and the turbidity curve in the coupling reaction of N-Ac-Ela and amino acid methyl ester.
- FIG. 3 shows a case where WSCI is 10 eq
- FIG. 4 shows a case where WSCI is 50 eq. It can be seen that the amount of WSCI added greatly affects the modification rate, but considering that the WSCI in FIG. 2 is 100 eq, it can be seen that the coupling reaction proceeds almost completely with the use of 100 eq. .
- FIG. 5 shows turbidity curves of three different chemically modified water-soluble elastins, Cm (G) -Ela, Cm (V) -Ela, and Cm (F) -Ela. It can be seen that as the hydrophobicity of the used amino acids glycine (G), valine (V), and phenylalanine (F) increases, the self-assembly start temperature increases and the turbidity intensity also increases. This suggests that Ela's self-assembly is promoted the higher the hydrophobicity of the molecule.
- FIG. 6 shows the turbidity curve of Col alone solution.
- FIG. 7 shows turbidity curves of a mixed solution of Col and Ela and a mixed solution of Col and three types of Cm-Ela.
- the turbidity curve was the same as that of Col alone, and the turbidity intensity was lower than that of Col alone. From this, it is considered that in the case of unmodified Ela, Ela molecules are incorporated into Col in a state where they do not self-assemble due to the gelation property of Col that incorporates surrounding molecules at the start of self-assembly.
- the decrease in turbidity intensity is thought to be due to the incorporation of Ela molecules that are not self-assembled, rather than gelation with Col alone.
- the self-assembly start temperature showed the same self-assembly start temperature as that of each of the 3 types of Cm-Ela, but the turbidity intensity increased. This is because the self-assembly start temperature of the Cm-Ela and Col mixed solution was earlier than the self-assembly start temperature (gelation temperature) of Col alone. This is thought to be due to the influence.
- FIG. 8 shows stress-strain curves of the Col single gel, Ela and Col mixed gel, and Cm (G) -Ela and Col mixed gel.
- the breaking stress of the Col single gel was 89 kPa, and the maximum strain was 84%.
- the Ela-Col mixed gel had a breaking stress of 87 kPa and a maximum strain of 101%, which was the same as that of the Col single gel, and the maximum strain increased in the Col single gel.
- the Cm (G) -Ela / Col mixed gel had a breaking stress of 106 kPa and a maximum strain of 109%. Both the breaking stress and the maximum strain increased compared to the Ela / Col mixed gel. These results are thought to be due to the addition of elasticity to the gel by adding Ela to the Col, and the addition of Cm (G) -Ela, which has a higher self-assembly ability, to add rigidity and greater elasticity.
- FIG. 9 shows stress-strain curves of Cm (G) -Ela and Col mixed gels having different mixing ratios of Cm (G) -Ela to Col.
- Figure 9 shows that Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) has a breaking stress of 106kPa and a maximum strain of 109%.
- the breaking stress of the mixture ratio (4.5 mg / ml: 1.5 mg / ml) was 114 kPa, the maximum strain was 130%, and both the breaking stress and the maximum strain increased. This is thought to be because greater elasticity and rigidity were added by increasing the amount of Cm (G) -Ela added.
- the increase rate of the maximum strain (20%) was larger than the increase rate of the breaking stress (8%), it can be considered that the contribution to the elastic improvement is larger than the stiffness of Ela.
- FIG. 10 shows stress-strain curves of Cm (G) -Ela and Col mixed gel, Cm (V) -Ela and Col mixed gel, Cm (F) -Ela and Col mixed gel, and porcine aorta.
- the stress for 60% strain is 43 kPa for Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5 mg / ml: 1.5 mg / ml), Cm (V) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5).
- Table 1 shows three chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gels of the present invention, Cm (G) -Ela / Col mixed gel (mixing ratio 1.5 mg / ml: 1.5 mg / ml), Cm (V) -Ela-Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), Cm (F) -Ela-Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml) and Cm (G) -Ela ⁇ Col mixed gel 15kGy, 30kGy ⁇ -irradiated 15kGy ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela ⁇ Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5mg / ml), 30kGy ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela The values obtained by comparing the stress of 50% strain of Col mixed gel (mixing ratio 1.5mg / ml: 1.5m
- Col had a molecular weight of about 300,000, but when gelled, it formed Col fibers with a three-dimensional network structure. Then, Cm-Ela having a molecular weight of about 200,000 entered between the Col fibers and self-assembled, so that the collagen fibers were entangled and a more durable structure was formed.
- Cm (G) -Ela ⁇ Col mixed solution (mixing ratio 1.5 mg / ml: 1.5 mg / ml) prepared using PBS (pH 7.4) under low temperature was injected into a tube with a diameter of 8 mm, and then the diameter A mixed solution was formed into a tubular shape between a diameter of 8 mm and a diameter of 5 mm by inserting a 5 mm middle rod. Then, the mixed solution was allowed to stand at 37 ° C. for about 1 hour to gel, and further dried at 37 ° C., then PBS was added and left to stand for 48 hours to swell, and the intermediate rod was removed to produce an artificial blood vessel ( FIG. 11).
- the stress-strain curves of the Ela / Col mixed gel and the ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel are shown in FIG.
- the ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel showed a higher breaking strength than the non-irradiated Ela / Col mixed gel.
- the stress-strain curves of the Cm (G) -Ela / Col mixed gel and the ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel are shown in FIG.
- the breaking strength of the ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel is larger than that of the non-irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel, and also from the ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel (see FIG. 12). Was also big.
- FIG. 14 shows the stress-strain curves of Ela-Col mixed gel, ⁇ -irradiated Ela-Col mixed gel, Cm (G) -Ela-Col mixed gel, ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela-Col mixed gel, and porcine aorta.
- FIG. 15 shows a stress-strain curve up to a strain of 50%.
- the maximum stress of the ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel was about 1.5 times and the maximum strain was about 0.5 times that of the Ela / Col mixed gel (FIG. 12).
- the maximum stress of the ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel was higher than the limit value of the measuring instrument compared to the Cm (G) -Ela / Col mixed gel (FIG. 13). This is presumably because the mixed gel was crosslinked by ⁇ -ray irradiation.
- ⁇ -irradiated Ela / Col mixed gel results in a smaller maximum strain, but the strength is increased, so even the strain of ⁇ -irradiated Ela / Col gel is sufficient as a material. Further, in the ⁇ -irradiated Cm (G) -Ela / Col mixed gel, the limit value of the measuring instrument was reached, so that the strength increased so that the maximum stress and the maximum strain could not be measured. This suggests that ⁇ -ray irradiation is a useful means for preparing a material for an artificial blood vessel, and that a ⁇ -ray irradiation mixed gel can be used as a material for an artificial blood vessel.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel of the present invention can be used as an artificial blood vessel as a substitute for a human blood vessel, and can be used for the treatment of circulatory diseases such as arteriosclerosis and aneurysm. It can also be applied to artificial ligaments, artificial tendons, artificial skin, artificial alveoli, artificial uterus, and the like. Furthermore, it can be applied to cosmetic surgery to be embedded in the skin for wrinkle removal.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel of the present invention is also useful as an artificial tissue in which epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, smooth muscle cells, chondrocytes, etc. are seeded and grown in the mixed gel. is there.
- the chemically modified water-soluble elastin / collagen mixed gel of the present invention comprises an epithelial growth factor, fibroblast growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, transforming growth factor, platelet-derived growth factor.
- Growth factor (growth factor), chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparan sulfate, keratan sulfate, heparin, hyaluronic acid and other glycosaminoglycans, fibronectin, laminin, vitronectin, tenascin, thrombospondin, entactin, osteopontin, vonville It is also useful as an artificial tissue to which cell adhesion proteins such as brand factor and fibrinogen are added.
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Abstract
本発明が解決しようとする課題は、水溶性エラスチンとコラーゲンを利用して、生体適合性に優れ、かつ、十分な弾力性、伸展性、強度を有する人工血管等の医療用材料を提供することである。 上記の課題は、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル、並びに、化学修飾水溶性エラスチンをコラーゲンに対して増量あるいは減量して混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル、さらにこれらの混合ゲルに放射線を照射した化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルにより達成された。
Description
本発明は、人工血管用材料等の用途に利用できる可能性がある、化学修飾水溶性エラスチン、化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの混合ゲル及びそれらの製造方法に関する。
人工血管は、主として循環器系の病気や怪我に際して、生体の血管の代替品として用いられている。人工血管として現在注目を浴びているものの例として、合成高分子材料にコラーゲン、ゼラチン、エラスチン、あるいはフィブロネクチン等を導入して更に細胞を播種したハイブリッド型人工血管がある。このハイブリッド型人工血管は、激しい血流に影響を受けて細胞が剥がれてしまう問題がある。また、基盤となる材料が合成高分子のため生体適合性の面でも問題があり、直径３ｍｍ以下の人工血管を作製して移植した場合、血栓により血管内腔が狭窄しないように抗血液凝固剤を飲み続けなければならないという問題点がある。更に、この人工血管を成長期に移植すると、成長に伴って再度手術により人工血管を移植しなければならないという問題点がある。
これらのハイブリッド型人工血管の基盤として用いられる合成高分子としては、現在、延伸多孔質ポリテトラフルオロエチレン（ｅ－ＰＴＦＥ）が主流であるが、このポリマーは非粘着性、屈曲性に優れているものの、強度の面で問題があり、静脈や小動脈（内径４～８ｍｍ）のみにしか用いられていない。このように合成高分子は問題があるので、合成高分子に代わる材料として生体高分子が着目されている。生体高分子のうちコラーゲンは、生体中に多量存在し（生体中のタンパク質の約１／３を占める。）、生体適合性や細胞接着性もあり、これを利用した人工血管の作製が試みられているが、コラーゲン１００％のものは強度の面で問題がある。
コラーゲンと水溶性エラスチンを組合わせて、後述のごとく医療用材料を作成することも知られている。エラスチンとは、動物、特に哺乳動物の皮膚の真皮、靭帯、腱、血管壁等の結合組織の中に、コラーゲンと共に存在するタンパク質である。エラスチンは、通常、生体内においては、３次元の網目構造の不溶性のタンパク質として存在している。かかるエラスチンを、酸又はアルカリで加水分解したり、酵素で処理することによって、前述した水溶性エラスチンが得られることは広く知られている。水溶性エラスチンは、水分を豊富に保持する能力を有することから、化粧品、特に保湿剤として利用されている他、皮膚に弾力を与える等の美容効果があるとして、コラーゲン等と共に健康食品としても利用されている。
そして、更に水溶性エラスチンは、これを可溶化コーゲンと混合して成型用組成物を得ること（特許文献１）や、人工血管基材の内壁面にコラーゲン層を設け、これに水溶性エラスチンを架橋剤によって架橋させること（特許文献２）が提案されている。また、架橋されたエラスチンとコラーゲン等の生体高分子との混合物を、医療用材料として用いることも提案されている（特許文献３）。しかしながら、実用に耐える人工血管等は未だ開発されていない。また、本発明者らは、水溶性エラスチンを得る方法を提案している（特許文献４）。
本発明の課題は、水溶性エラスチンとコラーゲンを利用して、生体適合性に優れ、かつ、十分な強度、弾性、及び伸展性を有する人工血管等の医療用材料を提供することにある。
上記課題は、下記のような本発明の各態様によって達成される。
本発明の態様の１つは、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンである。Ｎ－アシル化にはＮ－ホルミル化、Ｎ－アセチル化、Ｎ－ベンゾイル化などがあるが、Ｎ－アセチル化が好ましい。また、Ｎ－アシル化にはウレタン型やアルキル型を用いてもよい。前記エラスチンのカルボキシル基のアミノ酸アルキルエステルによる酸アミド化に用いるアミノ酸はタンパク質を構成するグリシン、バリン、フェニルアラニンなどの約２０種類の中から選ばれる。本発明において「高分子量水溶性エラスチン」とは、分子量が約１万以上、好ましくは約３～３０万のものを意味する。
本発明の他の態様は、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンと、コラーゲンを混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルである。この態様においては、化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルが好ましい。また、化学修飾水溶性エラスチンと、それよりも少量又は多量のコラーゲンを混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルも好ましい。「ほぼ同重量」とは、化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの重量比が９５～１０５重量％以内であることをいう。
本発明の更に他の態様は、前記化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法であって、（１）高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化する工程、（２）該高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせる工程、及び、（３）前記（１）と（２）の工程を経て得られた化学修飾水溶性エラスチンを、コラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程からなる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法である。この態様においても、化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合する方法が好ましい。また、化学修飾水溶性エラスチンと、それよりも少量又は多量のコラーゲンを混合する方法も好ましい。
本発明の更なる態様は、（１）高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化する工程、（２）該高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせる工程、（３）前記（１）と（２）の工程を経て得られた化学修飾水溶性エラスチンを、コラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程、及び、（４）前記（３）で得られた混合ゲルに放射線を照射する工程からなる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法である。この態様においても、化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合する方法が好ましい。また、化学修飾水溶性エラスチンと、それよりも少量又は多量のコラーゲンを混合する方法も好ましい。
本発明の更に他の態様は、上記の化学修飾水溶性エラスチンの医療用材料としての使用である。また、本発明の更に他の態様は、上記の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル、又は、上記の製造方法により製造された化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの医療用材料としての使用である。ここで、医療用材料には人工血管材料等が含まれる。
本発明の更に他の態様は、上記の化学修飾水溶性エラスチンの医療用材料としての使用である。また、本発明の更に他の態様は、上記の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル、又は、上記の製造方法により製造された化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの医療用材料としての使用である。ここで、医療用材料には人工血管材料等が含まれる。
本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルから得られた材料は、エラスチン又はコラーゲン単独、あるいはそれらの混合物に比べ、強度、弾性及び伸展性が大幅に改善されるので、人工血管等の医療用材料として利用できる可能性が高い。化学修飾に用いるアミノ酸として疎水度の大きいアミノ酸を用いた場合や、疎水性の大きいペプチドを化学修飾に用いた場合には、ブタやイヌの大動脈の応力と同程度あるいはそれよりも強度、弾性及び伸展性のある人工血管材料等が作製できる。
本発明の水溶性エラスチンは、哺乳動物及び鳥類由来の場合には、エラスチンを構成するアミノ酸の約７８～８５％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、約２～４％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、約１～２％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、約０．１～０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量約１万～３０万、好ましくは約３万～３０万の高分子量水溶性エラスチンである。また本発明の水溶性エラスチンは、魚類由来の場合には、エラスチンを構成するアミノ酸の約６７～７７％がプロリン、グリシン、アラニン、バリンからなり、約４～６％がアスパラギン酸とグルタミン酸からなり、約２～４％がリジン、ヒスチジン、アルギニンからなり、約０．１～０．４％がデスモシンとイソデスモシンからなる、分子量約１万～３０万、好ましくは約３万～３０万の高分子量水溶性エラスチンである。
本発明の化学修飾水溶性エラスチンは、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンである。Ｎ－アシル化には、Ｎ－ホルミル化、Ｎ－アセチル化、Ｎ－ベンゾイル化などがあるが、Ｎ－アセチル化が好ましい。また、Ｎ－アシル化にはウレタン型やアルキル型を用いてもよい。前記エラスチンのカルボキシル基のアミノ酸アルキルエステルによる酸アミド化に用いるアミノ酸は、タンパク質を構成するグリシン、バリン、フェニルアラニンなどの約２０種類のうちのいずれでもよい。
本発明の他の態様である化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルは、先ず、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化する工程（第１工程）、次いで、得られたＮ－アシル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせ化学修飾する工程（第２工程）、その後、得られた化学修飾水溶性エラスチンを、ほぼ同重量の、あるいはそれよりも少量又は多量のコラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程（第３工程）によって製造される。
本発明の更なる態様である放射線照射した化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルは、先ず高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化し（第１工程）、次いで得られたＮ－アシル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせ化学修飾し（第２工程）、さらに第１工程と第２工程を経て得られた化学修飾水溶性エラスチンを、コラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製し（第３工程）、その後に、得られた混合ゲルに放射線を照射することによって得られる（第４工程）。この態様においても、化学修飾水溶性エラスチンを、ほぼ同重量の、あるいはそれよりも少量又は多量のコラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程によって製造される。化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの重量比（化学修飾水溶性エラスチン／コラーゲン）は、好ましくは１／２００～２００／１であり、より好ましくは１／１００～５０／１であり、さらに好ましくは１／５０～５／１であり、特に好ましくは１／３～３／１である。
例えば、本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを使用して生体組織の代替としての人工靭帯、人工皮膚、人工腱、人工血管等を作製する場合は、前記重量比が１／５０～５／１であることが好ましく、生体組織の代替ではなく人工の線維、人工癒着防止膜、人工縫合糸あるいは人工膜等を作製する場合には、エラスチン重量／コラーゲン重量の範囲が広い方がよく、前記重量比が１／１００～５０／１であることが好ましく、また、生体以外の例えば合成繊維や合成膜等に応用していく場合は、エラスチン重量／コラーゲン重量の範囲がさらに広い方がよく、前記重量比が１／２００～２００／１であることが好ましい。
例えば、本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを使用して生体組織の代替としての人工靭帯、人工皮膚、人工腱、人工血管等を作製する場合は、前記重量比が１／５０～５／１であることが好ましく、生体組織の代替ではなく人工の線維、人工癒着防止膜、人工縫合糸あるいは人工膜等を作製する場合には、エラスチン重量／コラーゲン重量の範囲が広い方がよく、前記重量比が１／１００～５０／１であることが好ましく、また、生体以外の例えば合成繊維や合成膜等に応用していく場合は、エラスチン重量／コラーゲン重量の範囲がさらに広い方がよく、前記重量比が１／２００～２００／１であることが好ましい。
本発明においては、水溶性エラスチンのＮ末端及びリジン、アルギニン等のアミノ酸残基側鎖のアミノ基等をアシル化し、引き続き、Ｃ末端及びアスパラギン酸、グルタミン酸等のアミノ酸残基側鎖のカルボキシル基等とアミノ酸アルキルエステルのアミノ基をカップリングさせて化学修飾水溶性エラスチンが得られる。化学修飾によってアミノ基等とカルボキシル基等が保護されることにより、エラスチンの荷電が消失し、その結果、エラスチン分子間の疎水的相互作用が増し、得られた化学修飾水溶性エラスチンは、未修飾エラスチンに比べて高い自己集合性を有するようになるものと考えられる。
水溶性エラスチンを得る方法・手段は色々と提案されている。好ましいのは、本発明者が提案した下記の方法である（特許文献４参照）。
第１の方法は、動物性生体組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理を行って不溶性エラスチンを得、次いでこの不溶性エラスチンをシュウ酸や水酸化ナトリウム等の可溶化液に浸漬・溶解させ、水溶性エラスチンを製造する。コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であって、このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５～０．５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～０．３ｍｏｌで９０～１０５℃としたアルカリ性溶液中に、動物性生体組織を５～６０分間、好ましくは１０～２０分間浸漬して行うのが好ましい。また、コラーゲンやその他の不要タンパク質の除去処理に際しては、アルカリ性溶液による処理の前に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化バリウムの少なくともいずれか一つを含む塩溶液に、動物性生体組織を浸漬させる浸漬処理（前処理）を行うのも好ましい。
動物性生体組織としては、特に制限はないが、エラスチンの含量が多い点で、豚、馬、牛、羊などの哺乳動物から得られた項靱帯や大動脈血管を使用することが好ましい。また鳥類の大動脈血管やエラスチン含量の多い魚類の動脈球（心臓）などを使用してもよい。動物性生体組織は、先ず、ホモジナイザーを用いてホモジナイズするのが良い。ホモジナイズはミキサー、ミートチョッパーなど動物性生体組織を細断できれば良く、好ましくは３ミリメートル角以下、さらに好ましくはペースト状に細断できる器具を用いると良い。細断した動物性生体組織の粒が小さいほど、コラーゲンやその他の不要なタンパク質の除去効率を上げることができるので好ましい。ホモジナイズした動物性生体組織は、例えば、熱水又は熱希薄アルカリ水溶液で煮沸するか、もしくは有機溶媒で処理することによって脱脂処理を行っても良い。
前記可溶化液としては、シュウ酸、蟻酸、酢酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ベタイン、ジフルオロ酢酸、トリフルオロ酢酸、リン酸、スルファミン酸、過塩素酸、トリクロロ酢酸の少なくともいずれか一つを含む酸性溶液が用いられる。そして、この酸性溶液の酸の総量は、１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．１～２ｍｏｌとし、かつ、液温を９０～１０５℃とするのが好ましい。
前記可溶化液は、また、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの少なくともいずれか一つを含むアルカリ性溶液であっても良い。このアルカリ性溶液中に添加した水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムの総量を、１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～２ｍｏｌとし、かつ、液温が９０～１０５℃のアルカリ性溶液とするのが好ましい。
第２の方法は、動物性生体組織の不要部分の除去処理、動物性生体組織の細断処理、動物性生体組織の脱脂処理と塩処理の少なくともいずれか一つを含む前処理工程と、前処理された動物性生体組織をアルカリ性溶液に浸漬してコラーゲンやその他の不要タンパク質を濾別するアルカリ抽出工程と、アルカリ抽出工程後の残渣をアルカリで溶解するアルカリ溶解工程を所定回数繰り返し、濾別により水溶性エラスチンを含む濾液を得る濾液回収工程と、濾液から水溶性エラスチンを生成する水溶性エラスチン生成工程とを順次行って水溶性エラスチンを製造する方法である。前記アルカリ溶解工程で用いるアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウムのいずれか一つ又は混合物が好ましい。
この操作は、前記の、組織からコラーゲンやその他の不要タンパク質を除去して不溶性エラスチンを得て、次いで、この不溶性エラスチンを可溶化して水溶性エラスチンを得る第１の方法とは異なり、組織から不溶性エラスチンを得ることなく、直接水溶性エラスチンを得る方法である。即ち、１Ｌあたり０．０５～０．５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～０．３ｍｏｌで９０～１０５℃としたアルカリ性溶液中に、細断、脱脂、塩処理した動物性生体組織を５～６０分間、好ましくは１０～２０分間浸漬し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去した処理組織を得、次いで、この処理組織を１Ｌあたり０．０５～５ｍｏｌ、好ましくは０．０５～２ｍｏｌ（アルカリ液の濃度がより高濃度）で９０～１０５℃のアルカリ性溶液中に５～４２０分間、好ましくは１０～２４０分間（時間がより長い）浸漬して溶解し、水溶性エラスチンを得る方法である。
前記のごとく第１又は第２の方法で得られた水溶性エラスチンは水溶性エラスチンを含む水溶液を中和し、次いで、その中和溶液を、例えば、透析処理することによって又はナノフィルトレート（ＮＦ）膜等を用いた膜処理によって脱塩し、及び低分子量のものを除去して、本発明で用いられる高分子量水溶性エラスチンが得られる。
本発明で用いられるコラーゲンは、医療用途として知られているどのようなものでも用いることができる。通常、医療用途に適したコラーゲンは、主として原料である動物から、酸、アルカリ、中性等の条件下で酵素などにより抽出し、粘調なコラーゲン溶液又はこの溶液を乾燥させた固体の状態として得る方法が一般的に用いられている。また、更に、ペプシン処理を施すことによって抗原性発現部位を除去し、体内又は体表面に移植した際に抗原性が無い、より医療基材に好適なコラーゲン（アテロコラーゲン）を得ることもできる。本発明で用いられる代表的なコラーゲンとしては、酸可溶化コラーゲン、アルカリ可溶化コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン、中性可溶化コラーゲン等の可溶化コラーゲンが挙げられ、特に、可溶化処理と同時にコラーゲンの抗原決定基であるテロペプタイドの除去処理が施されている、アテロコラーゲンが好適である。
本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造においては、先ず、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化してＮ－アセチル化水溶性エラスチンを得る。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、反応性の第１アミン又は第２アミンを有するアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、リシン、アルギニン及びヒスチジンが挙げられるが、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミンとしては、末端アミノ基も含まれる。
本発明においては、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部が、好ましくは、無水酢酸等のアセチル化試薬によってＮ－アセチル化されるが、Ｎ－アセチル化の程度は、下記式で表される修飾率で９５％以上であるものが好ましい。
修飾率（％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００
Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。Ｂは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
修飾率（％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００
Ａは、水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。Ｂは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチンの吸光度（波長３４５ｎｍ）の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いた値を表す。
本発明においては、次いで、得られたＮ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせ化学修飾し化学修飾水溶性エラスチンを得る。本発明においては炭素数１～４の低級アルキルエステルが好ましいが、特にメチルエステルが好ましい。またベンジルエステルなどのようなものを用いてもよい。エラスチンを構成するアミノ酸残基の中で、カルボキシル基を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸とグルタミン酸があるが、高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基としては、末端カルボキシル基も含まれる。
本発明においては、Ｎ－アシル化、好ましくは、Ｎ－アセチル化水溶性エラスチン分子中に含まれるカルボキシル基のほぼ全部が、アミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングしているものが好ましい。カップリング反応に際しては、カルボジイミド等のカップリング剤又は縮合剤を用いるのが便利である。
次いで、本発明においては、前記のごとくして得られた化学修飾水溶性エラスチンと前述したコラーゲンの各水溶液を作成し、それぞれをほぼ同重量含む水溶液状態、あるいはコラーゲンに対して化学修飾水溶性エラスチンを増量あるいは減量した水溶液状態で混合して混合ゲルを調製する。かかる方法で本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルが得られる。そして、得られた混合ゲルは、そのままあるいは適当な加工を経て、人工血管等医療用材料の基盤として用いることができる。
本発明の更なる態様においては、前記のごとくして得られた化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルに、溶液で膨潤した状態あるいは乾燥状態で、電子線やγ線等の放射線を照射して、放射線照射化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルが得られる。放射線としてはγ線が好ましく、混合ゲルのヤング率を好ましくは２倍以上上昇させるために必要な線量照射する。
γ線等で照射することによって、混合ゲルは滅菌架橋され、更に材料の強度の増強が図られる。照射条件は特に限定されるものではないが、例えば、Ｃｏ－６０γ線の場合、２０～５０℃、好ましくは３０～４０℃で０．５～５０ｋＧｙ程度、好ましくは５～４０ｋＧｙ程度の照射が適当である。
γ線等で照射することによって、混合ゲルは滅菌架橋され、更に材料の強度の増強が図られる。照射条件は特に限定されるものではないが、例えば、Ｃｏ－６０γ線の場合、２０～５０℃、好ましくは３０～４０℃で０．５～５０ｋＧｙ程度、好ましくは５～４０ｋＧｙ程度の照射が適当である。
以下、実施例により本発明を詳述する。各種測定法は以下のとおりである。
［Ｎ－アセチル化の修飾率］
Ｎ－アセチル化の修飾率は、ＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）法より以下のようにして測定し計算される。１ｍｇ／ｍｌのＮ－アセチル化水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）水溶液に、４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液を、それぞれ１ｍｌ加えた。４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液をそれぞれ１ｍｌ加えただけのものを、ブランクとした（ｎ＝３）。作製した溶液をアルミホイルで遮光し、４０℃で２時間反応させた。反応終了後、作製した溶液０．１７ｍｌに１０％ＳＤＳ１ｍｌ、１Ｎ・ＨＣｌを０．５ｍｌ加え、３４５ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。また、修飾率は以下の式より求めた。
Ｎ－アセチル化の修飾率は、ＴＮＢＳ（２，４，６－トリニトロベンゼンスルホン酸）法より以下のようにして測定し計算される。１ｍｇ／ｍｌのＮ－アセチル化水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）水溶液に、４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液を、それぞれ１ｍｌ加えた。４％の炭酸水素ナトリウム溶液、０．１％のＴＮＢＳ水溶液をそれぞれ１ｍｌ加えただけのものを、ブランクとした（ｎ＝３）。作製した溶液をアルミホイルで遮光し、４０℃で２時間反応させた。反応終了後、作製した溶液０．１７ｍｌに１０％ＳＤＳ１ｍｌ、１Ｎ・ＨＣｌを０．５ｍｌ加え、３４５ｎｍにおける吸光度をそれぞれ測定した。また、修飾率は以下の式より求めた。
エラスチン水溶液の吸光度の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いたものをＡ、N-Ac-Ela水溶液の吸光度の平均値からブランクの吸光度の平均値を引いたものをＢとする。修飾率は、修飾率（％）＝（１－Ｂ／Ａ）×１００で表される。
［濁度測定］
水溶性エラスチン（Ela）、３種類の化学修飾水溶性エラスチン（Cm-Ela）、Ｉ型コラーゲン（Col）の各々をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4）又はpH5.0、7.4、9.0の溶液に溶解した。これらの各溶液をEla単独、３種Cm-Ela単独、Col単独、ElaとCol共存状態、３種Cm-ElaとCol共存状態で波長４００ｎｍ、温度範囲５℃から６５℃、温度上昇０．５℃／ｍｉｎ、窒素気流下の条件で濁度測定を行った。溶媒は超純水又は生理的条件下を考慮してＰＢＳを用い、測定機器はペルチェ式温度コントローラー付分光光度計（日本分光（株）製:Ubest-50）を用いた。
水溶性エラスチン（Ela）、３種類の化学修飾水溶性エラスチン（Cm-Ela）、Ｉ型コラーゲン（Col）の各々をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4）又はpH5.0、7.4、9.0の溶液に溶解した。これらの各溶液をEla単独、３種Cm-Ela単独、Col単独、ElaとCol共存状態、３種Cm-ElaとCol共存状態で波長４００ｎｍ、温度範囲５℃から６５℃、温度上昇０．５℃／ｍｉｎ、窒素気流下の条件で濁度測定を行った。溶媒は超純水又は生理的条件下を考慮してＰＢＳを用い、測定機器はペルチェ式温度コントローラー付分光光度計（日本分光（株）製:Ubest-50）を用いた。
［ブタ由来水溶性エラスチンの作製］
１）ブタ由来不溶性エラスチンの単離
以下の手順に従ってブタ大動脈脱脂組織からNaCl可溶及びNaOH可溶のエラスチン以外の不要タンパク質やコラーゲンを抽出、除去した。
１）ブタ由来不溶性エラスチンの単離
以下の手順に従ってブタ大動脈脱脂組織からNaCl可溶及びNaOH可溶のエラスチン以外の不要タンパク質やコラーゲンを抽出、除去した。
ブタ大動脈脱脂組織（生体組織）を用い、前処理として付着している脂肪や筋肉などエラスチン含量の低い部分を、刃物などを用いて削ぎ落とすことで不要部分の除去処理を行い、次いで、生体組織をホモジナイザーを用いてホモジナイズすることで細断処理を行った。ホモジナイズした生体組織を熱水、熱希薄アルカリ水溶液又はアセトン等の有機溶媒で処理して脱脂処理を行った後に乾燥させた。ついで脱脂乾燥組織重量の約１０倍容量の１Ｍ塩化ナトリウムを加え、室温で１時間撹拌してNaCl可溶の不要タンパク質を抽出、除去した。この操作を５回繰り返し、その後蒸留水で洗浄し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ、５分）により水切りした。
上記のようにして脱脂及び塩処理した生体組織の重量に対して約１０倍容量（重量１ｇ当たり１０ｍｌ）の０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を加え、１００℃で１５分間撹拌し、エラスチン以外のコラーゲンや不要タンパク質を除去する工程を行った。そして、生体組織とアルカリ性溶液とを分離した。分離したアルカリ性溶液を、例えば、ビューレット法にて総タンパク質の定量を行い、アルカリ性溶液中に含まれる総タンパク質量が０．１ｍｇ／ｍＬ以下になるまで、この操作を繰返した。その後、冷却して遠心分離（５，０００ｒｐｍ、２０分）により洗浄し、残渣を乾燥して不溶性エラスチンを得た。
２）高分子量ブタ由来水溶性エラスチンの調製
ブタ由来不溶性エラスチンにその乾燥重量の１０倍容量の０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、１００℃で３０分撹拌した。反応後、溶液を速やかに氷冷し酢酸又は塩酸で中和した。その後、分子量６，０００～８，０００以上を分画する透析膜を用いて１週間透析した。その後、凍結乾燥し高分子量ブタ由来水溶性エラスチンを得た。
ブタ由来不溶性エラスチンにその乾燥重量の１０倍容量の０．５Ｎの水酸化ナトリウムを加え、１００℃で３０分撹拌した。反応後、溶液を速やかに氷冷し酢酸又は塩酸で中和した。その後、分子量６，０００～８，０００以上を分画する透析膜を用いて１週間透析した。その後、凍結乾燥し高分子量ブタ由来水溶性エラスチンを得た。
［化学修飾水溶性エラスチンの作製］
下記のとおり、高分子量ブタ由来水溶性エラスチンをＮ－アセチル化及びＯ－アミノ酸メチルエステルのカップリングによる化学修飾を行った。
下記のとおり、高分子量ブタ由来水溶性エラスチンをＮ－アセチル化及びＯ－アミノ酸メチルエステルのカップリングによる化学修飾を行った。
１）Ｎ－アセチル水溶性エラスチンの作製
前記で得られたブタ由来水溶性エラスチンを、少量のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に溶解したものに、ピリジン（１００ｅｑ）と無水酢酸（１００ｅｑ）を加え、１晩撹拌した。ニンヒドリン試験によってアセチル化が定量的に進行したことを確認した後、反応液をエバポレーターにより減圧濃縮した。このＮ－アセチル化は、ＴＮＢＳ法よりアミノ基等の修飾率が９５％以上になるまで、数回繰り返し行った。その後、この溶液を１週間透析して溶媒や未反応試薬を除去し、凍結乾燥してＮ－アセチル水溶性エラスチンを得た。
なお、本発明において、Ｎ－アセチル水溶性エラスチンの平均分子量から求めた使用原料のモル数（１モル当量）を基準にして、試薬のモル当量数（ｅｑ）を表示した。図面の簡単な説明においても同様である。
前記で得られたブタ由来水溶性エラスチンを、少量のトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）に溶解したものに、ピリジン（１００ｅｑ）と無水酢酸（１００ｅｑ）を加え、１晩撹拌した。ニンヒドリン試験によってアセチル化が定量的に進行したことを確認した後、反応液をエバポレーターにより減圧濃縮した。このＮ－アセチル化は、ＴＮＢＳ法よりアミノ基等の修飾率が９５％以上になるまで、数回繰り返し行った。その後、この溶液を１週間透析して溶媒や未反応試薬を除去し、凍結乾燥してＮ－アセチル水溶性エラスチンを得た。
なお、本発明において、Ｎ－アセチル水溶性エラスチンの平均分子量から求めた使用原料のモル数（１モル当量）を基準にして、試薬のモル当量数（ｅｑ）を表示した。図面の簡単な説明においても同様である。
２）アミノ酸メチルエステルのカップリング反応
前記で得られたＮ－アセチル水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）を、少量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したものに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を加えた。１５分撹拌後、３種類のアミノ酸メチルエステル、即ち、グリシン（G）のメチルエステル（H-G-OMe）、バリン（V）のメチルエステル（H-V-OMe）、フェニルアラニン（F）のメチルエステル（H-F-OMe）の各々と、トリエチルアミンを溶かした少量のＤＭＦ溶液を加えた。一昼夜撹拌後、この溶液を１週間透析し、溶媒や未反応試薬等を除去し、凍結乾燥して３種類の化学修飾水溶性エラスチン、即ち、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｇ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(G)-Ela）、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｖ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(V)-Ela）、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｆ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(F)-Ela）を得た。
前記で得られたＮ－アセチル水溶性エラスチン（N-Ac-Ela）を、少量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したものに、水溶性カルボジイミド（ＷＳＣＩ）を加えた。１５分撹拌後、３種類のアミノ酸メチルエステル、即ち、グリシン（G）のメチルエステル（H-G-OMe）、バリン（V）のメチルエステル（H-V-OMe）、フェニルアラニン（F）のメチルエステル（H-F-OMe）の各々と、トリエチルアミンを溶かした少量のＤＭＦ溶液を加えた。一昼夜撹拌後、この溶液を１週間透析し、溶媒や未反応試薬等を除去し、凍結乾燥して３種類の化学修飾水溶性エラスチン、即ち、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｇ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(G)-Ela）、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｖ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(V)-Ela）、Ｎ－アセチル－Ｏ－Ｆ－メチルエステル水溶性エラスチン（Cm(F)-Ela）を得た。
未修飾Elaの結果を図１に、N-Ac-Elaにアミノ酸メチルエステルをＷＳＣＩを用いてカップリングした結果を、図２～４に示した。図１は、未修飾ElaのpH5.0、7.4及び9.0における温度と濁度の関係を示す曲線（濁度曲線）、図２は、N-Ac-Elaとグリシン（G）メチルエステルをＷＳＣＩ（１００ｅｑ）を用いてカップリングさせて作製したCm(G)-ElaのpH5.0、7.4及び9.0における濁度曲線である。図１より、Elaは生理条件である３７℃、ｐＨ７．４では自己集合していない。自己集合しない理由としては、Elaは等電点が酸性側（ｐＨ５．５付近）にあるからである。そこで、等電点をｐＨ７．４付近に持ってくるために、本発明では、アミノ基をN-アセチル化、カルボキシル基をアミノ酸メチルエステルのカップリングによる化学修飾を行うものである。
その結果、得られた化学修飾水溶性エラスチン（Cm-Ela）の自己集合開始温度は、図２に示したように、Elaの自己集合開始温度に対して低温側にシフトし、生理条件（ｐＨ７．４付近）において十分な濁度強度を示していることが分かる。また、濁度強度が上昇していること、更に、異なるｐＨでもほぼ同じ濁度曲線が得られたことから、アミノ酸メチルエステのカップリングによるカルボキシル基等の修飾率は、ほぼ完全であることが分かる。
図３と図４とは、N-Ac-Elaとアミノ酸メチルエステルのカップリング反応に際しての、カップリング剤（ＷＳＣＩ）の添加量と濁度曲線との関連を示す図である。図３はＷＳＣＩが１０ｅｑ、図４はＷＳＣＩが５０ｅｑの場合である。添加するＷＳＣＩの量が修飾率に大きく影響していることが分かるが、図２のＷＳＣＩが１００ｅｑであることを考慮すると、１００ｅｑの使用でカップリング反応はほぼ完全に進行していることが分かる。
図５には、３種類の異なる化学修飾水溶性エラスチンであるCm(G)-Ela、Cm(V)-Ela、Cm(F)-Elaの濁度曲線を示した。用いたアミノ酸であるグリシン（G）、バリン（V）、フェニルアラニン（F）の疎水度が高くなるにつれ、自己集合開始温度は早くなり、濁度強度も増加していることが分かる。これはElaの自己集合は、分子の疎水性が高いほど促進されるということを示唆している。
［水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル及び化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの作製］
コラーゲンと水溶性エラスチン、又は、コラーゲンと化学修飾水溶性エラスチンが各々１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌとなるように、またコラーゲンと化学修飾水溶性エラスチンが１．５ｍｇ／ｍｌ：４．５ｍｇ／ｍｌとなるように、総量２ｍｌの溶液を調製した。溶媒はＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた。これを３７℃で１時間静置しゲル化させた。その後、乾燥させてガラス化し、ついでＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２ｍｌ加えて４８時間静置することで膨潤させて本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを得た。
コラーゲンと水溶性エラスチン、又は、コラーゲンと化学修飾水溶性エラスチンが各々１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌとなるように、またコラーゲンと化学修飾水溶性エラスチンが１．５ｍｇ／ｍｌ：４．５ｍｇ／ｍｌとなるように、総量２ｍｌの溶液を調製した。溶媒はＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いた。これを３７℃で１時間静置しゲル化させた。その後、乾燥させてガラス化し、ついでＰＢＳ（ｐＨ７．４）を２ｍｌ加えて４８時間静置することで膨潤させて本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを得た。
［化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの各種性能の測定］
［濁度曲線］
図６はCol単独溶液の濁度曲線を示す。図７には、ColとEla混合溶液及びColと３種Cm-Ela混合溶液の濁度曲線を示した。ElaとCol混合溶液において濁度曲線はCol単独と同型であり、濁度強度はCol単独時より低下した。このことから、未修飾Elaでは自己集合開始時には周囲の分子を取り込むColのゲル化の特性により、Ela分子は自己集合しない状態でColに取り込まれていると考えられる。濁度強度の低下については、Col単独でゲル化するよりも、自己集合していないEla分子の取り込みによるものと考えられる。３種Cm-ElaとCol混合溶液では、それらの自己集合開始温度は３種Cm-Elaの各々の単独の場合と同様な自己集合開始温度を示したが、濁度強度は上昇した。これは、Cm-ElaとCol混合溶液の自己集合開始温度が、Col単独時の自己集合開始温度（ゲル化温度）より早かったことから、その自己集合開始時に、Cm-Elaの自己集合が大きく影響を与えているためであると考えられる。
図６はCol単独溶液の濁度曲線を示す。図７には、ColとEla混合溶液及びColと３種Cm-Ela混合溶液の濁度曲線を示した。ElaとCol混合溶液において濁度曲線はCol単独と同型であり、濁度強度はCol単独時より低下した。このことから、未修飾Elaでは自己集合開始時には周囲の分子を取り込むColのゲル化の特性により、Ela分子は自己集合しない状態でColに取り込まれていると考えられる。濁度強度の低下については、Col単独でゲル化するよりも、自己集合していないEla分子の取り込みによるものと考えられる。３種Cm-ElaとCol混合溶液では、それらの自己集合開始温度は３種Cm-Elaの各々の単独の場合と同様な自己集合開始温度を示したが、濁度強度は上昇した。これは、Cm-ElaとCol混合溶液の自己集合開始温度が、Col単独時の自己集合開始温度（ゲル化温度）より早かったことから、その自己集合開始時に、Cm-Elaの自己集合が大きく影響を与えているためであると考えられる。
［引張試験］
ElaとColの混合ゲル及びCm-ElaとColの混合ゲルの、各々の初期長が５ｍｍになるように両端をネジ式材料試験機（オートグラフＡＧ－Ｓ－Ｊ、（株）島津製作所）に固定した後、各ゲルの厚みと幅を測定し、それぞれ横断面積を求めた。ついで各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで３ｍｍ（ひずみ６０％）だけ伸展したときの応力とひずみの関係を測定した。さらに各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで破断まで引張り、破断応力を測定し、破断まで引っ張ったときの応力とひずみの関係を測定した。
ElaとColの混合ゲル及びCm-ElaとColの混合ゲルの、各々の初期長が５ｍｍになるように両端をネジ式材料試験機（オートグラフＡＧ－Ｓ－Ｊ、（株）島津製作所）に固定した後、各ゲルの厚みと幅を測定し、それぞれ横断面積を求めた。ついで各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで３ｍｍ（ひずみ６０％）だけ伸展したときの応力とひずみの関係を測定した。さらに各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで破断まで引張り、破断応力を測定し、破断まで引っ張ったときの応力とひずみの関係を測定した。
Col単独ゲル、ElaとCol混合ゲル、Cm(G)-ElaとCol混合ゲルの応力－ひずみ曲線を図８に示した。図８より、Col単独ゲルの破断応力は89kPa、最大ひずみは84％であった。Ela・Col混合ゲルの破断応力は87kPa、最大ひずみは101％であり、これはCol単独ゲルと同程度の破断応力を示し、最大ひずみはCol単独ゲルで増加した。またCm(G)-Ela・Col混合ゲルの破断応力は106kPa、最大ひずみは109％であり、これは破断応力、最大ひずみともにEla・Col混合ゲルよりも増加した。これらの結果はColにElaを加えることによりゲルに弾性が付加され、さらに自己集合能の高いCm(G)-Elaを加えることにより、剛性とさらに大きな弾性が付加されたためであると考えられる。
Colに対してCm(G)-Elaの混合比が異なるCm(G)-ElaとCol混合ゲルの応力－ひずみ曲線を図９に示した。図９より、Cm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg／ml：1.5mg／ml）の破断応力106kPa、最大ひずみ109％に比べて、Cm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比4.5mg／ml：1.5mg／ml）の破断応力は114kPa、最大ひずみは130％であり、破断応力、最大ひずみともに増加した。これはCm(G)-Elaの添加量を増やすことにより、さらに大きな弾性と剛性が付加されたためであると考えられる。また破断応力の増加率（8％）よりも最大ひずみの増加率（20％）が大きかったことから、Elaの剛性よりも弾性向上への寄与がより大きいことが考えられる。
Cm(G)-ElaとCol混合ゲル、Cm(V)-ElaとCol混合ゲル、Cm(F)-ElaとCol混合ゲル、及びブタ大動脈の応力－ひずみ曲線を図１０に示した。図１０より、６０％ひずみに対する応力はCm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg／ml：1.5mg／ml）で43kPa、Cm(V)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg／ml：1.5mg／ml）で63kPa、Cm(F)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg／ml：1.5mg／ml）で78kPaであった。すなわち疎水性の大きいアミノ酸メチルエステルでカップリングした化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンの混合ゲルほど応力は大きかった。これより、Elaの混合ゲルにおける応力向上への寄与の大きさは、Elaの自己集合能の大きさに依存することが考えられる。
表１には、本発明の３種の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルであるCm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg/ml:1.5mg/ml）、Cm(V)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg/ml:1.5mg/ml）、Cm(F)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg/ml:1.5mg/ml）及びCm(G)-Ela・Col混合ゲルに15kGy、30kGyのγ線照射した15kGyγ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg/ml:1.5mg/ml）、30kGyγ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲル（混合比1.5mg/ml:1.5mg/ml）の５０％ひずみに対する応力を、ブタ大動脈やイヌ腹部大動脈と比較した値を示した。
表１より、疎水度の大きいアミノ酸メチルエステルでカップリングした、化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの混合ゲルCm(F)-Ela・Col混合ゲルの５０％ひずみに対する応力は、ブタ大動脈及びイヌ腹部大動脈の応力に近い強度を示した。さらにγ線照射したCm(G)-Ela・Col混合ゲルの応力はブタ大動脈及びイヌ腹部大動脈の応力よりも大きな強度を示した。このことから、本発明の混合ゲル及びγ線照射混合ゲルは、生体組織の血管と同等あるいはそれ以上の強度、弾性、伸展性を示すことより、ヒトの血管に十分使用できる可能性が示唆された。
そして、化学修飾水溶性エラスチンの添加量を増加させることにより、また、アミノ酸よりももっと疎水度の大きいペプチド（例えば、Ｆ－Ｆ、Ｆ－Ｆ－Ｆ）のアルキルエステルをカップリングさせた化学修飾水溶性エラスチンを作製し、コラーゲンとの混合ゲルを作製すれば、更に大きな強度の人工血管用材料が得られる可能も示唆される。
［ＴＥＭ観察］
グリッド作製において、２％コロジオン処理したグリッドはSuper High Clean Vacuum Coater SVC-700 Turbo（サンユー電子（株）製）を用いて、カーボンを約２００Åの厚さで蒸着され、試料を吸着させる前にQuick Coater SC-701（サンユー電子（株）製）を用いて、ベンジルアミンをカーボン膜状に薄く散布する処理を行った。試料は凍結乾燥したゲルを剃刀で薄く切り、その切片を作製したグリッドにそのまま置き、倍率×６４００でＴＥＭによる観察を行った。
グリッド作製において、２％コロジオン処理したグリッドはSuper High Clean Vacuum Coater SVC-700 Turbo（サンユー電子（株）製）を用いて、カーボンを約２００Åの厚さで蒸着され、試料を吸着させる前にQuick Coater SC-701（サンユー電子（株）製）を用いて、ベンジルアミンをカーボン膜状に薄く散布する処理を行った。試料は凍結乾燥したゲルを剃刀で薄く切り、その切片を作製したグリッドにそのまま置き、倍率×６４００でＴＥＭによる観察を行った。
その結果、Colは分子量３０万程度だが、ゲル化すると三次元網目構造を持つCol線維を形成していた。そして、このCol線維の間に分子量２０万程度のCm-Elaが入り込み自己集合することで、コラーゲン線維に絡み合い、より丈夫な構造が形成されている状態が観察された。
［人工血管の作製］
低温下でＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製したCm(G)-Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）を径８ｍｍの管内に注入し、次いで径５ｍｍの中棒を挿入することにより径８ｍｍと径５ｍｍの間に混合溶液を管状に形成させた。その後、混合溶液を３７℃で約１時間静置してゲル化させ、さらに３７℃で乾燥した後にＰＢＳを加えて４８時間静置して膨潤させ、中棒を抜いて人工血管を作製した（図１１）。
低温下でＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて調製したCm(G)-Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）を径８ｍｍの管内に注入し、次いで径５ｍｍの中棒を挿入することにより径８ｍｍと径５ｍｍの間に混合溶液を管状に形成させた。その後、混合溶液を３７℃で約１時間静置してゲル化させ、さらに３７℃で乾燥した後にＰＢＳを加えて４８時間静置して膨潤させ、中棒を抜いて人工血管を作製した（図１１）。
［化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルに対する放射線の照射］
Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）、Cm(G)-Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）を３７℃、１時間でゲル化させて、凍結乾燥し、ＰＢＳ ２ｍｌを加えて４８時間膨潤させた。その後、γ線照射を、照射量１５ｋＧｙ及び３０ｋＧｙ、照射温度は４０～５０℃で行った。そして、放射線照射された本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを得た。
Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）、Cm(G)-Ela・Col混合溶液（混合比１．５ｍｇ／ｍｌ：１．５ｍｇ／ｍｌ）を３７℃、１時間でゲル化させて、凍結乾燥し、ＰＢＳ ２ｍｌを加えて４８時間膨潤させた。その後、γ線照射を、照射量１５ｋＧｙ及び３０ｋＧｙ、照射温度は４０～５０℃で行った。そして、放射線照射された本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルを得た。
［放射線照射された本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの引張試験］
上記で得られた放射線照射混合ゲルを、初期長が５ｍｍとなるようにネジ式材料試験機（オートグラフＡＧ－Ｓ－Ｊ、（株）島津製作所製）に固定した。ゲルの厚みと幅を測定し、断面積を求めた。混合ゲルを０．０５ｍｍ／ｓの変位速度で伸展したときの応力とひずみの関係を測定し、また２．５ｍｍ（ひずみ５０％）だけ伸長したときの応力とひずみの関係を測定した。さらに各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで破断まで引張り、破断応力を測定し、破断まで引っ張ったときの応力とひずみの関係を測定した。
上記で得られた放射線照射混合ゲルを、初期長が５ｍｍとなるようにネジ式材料試験機（オートグラフＡＧ－Ｓ－Ｊ、（株）島津製作所製）に固定した。ゲルの厚みと幅を測定し、断面積を求めた。混合ゲルを０．０５ｍｍ／ｓの変位速度で伸展したときの応力とひずみの関係を測定し、また２．５ｍｍ（ひずみ５０％）だけ伸長したときの応力とひずみの関係を測定した。さらに各ゲルを変位速度０．０５ｍｍ／ｓで破断まで引張り、破断応力を測定し、破断まで引っ張ったときの応力とひずみの関係を測定した。
未照射とγ線照射時の比較のために、Ela・Col混合ゲルとγ線照射Ela・Col混合ゲルの応力－ひずみ曲線を図１２に示した。γ線照射Ela・Col混合ゲルは、非照射Ela・Col混合ゲルより大きな破断強度を示した。Cm(G)-Ela・Col混合ゲルとγ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルの応力-ひずみ曲線を図１３に示した。γ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルの破断強度は、非照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルよりも大きく、また、γ線照射Ela・Col混合ゲル（図１２参照）よりも大きかった。
Ela・Col混合ゲル、γ線照射Ela・Col混合ゲル、Cm(G)-Ela・Col混合ゲル、γ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲル、ブタ大動脈の応力-ひずみ曲線を図１４、ひずみ５０％までの応力－ひずみ曲線を図１５に示した。
図１２から明らかなように、Ela・Col混合ゲルに対してγ線照射Ela・Col混合ゲルの最大応力は約１．５倍、最大ひずみは約０．５倍であった（図１２）。また、Cm(G)-Ela・Col混合ゲルに対して、γ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルの最大応力は測定機器の限界値を超えるほど高かった（図１３）。これはγ線照射により混合ゲルが架橋されたためと考えられる。また、γ線の照射に関わらず、Ela・Col混合ゲルに対してCm(G)-Ela・Col混合ゲルの最大応力が高かったことから、Elaの自己集合能は、混合ゲルの強度に寄与していると考えられる。実際に各混合ゲルとブタ大動脈の応力-ひずみ曲線を比較すると、γ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルは、ブタ大動脈よりも強度が大きかった（図１４及び図１５）。
γ線照射Ela・Col混合ゲルでは、最大ひずみが小さくなる結果となったが、強度が大きくなっているので、γ線照射Ela・Colゲルのひずみでも素材として十分である。また、γ線照射Cm(G)-Ela・Col混合ゲルでは、測定機器の限界値に達したため、最大応力と最大ひずみが測定できないほど強度が増加していた。このことからγ線照射は人工血管用素材作製のための有用な手段であり、γ線照射混合ゲルは人工血管用素材として使用できるということが示唆された。
本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルは、人工血管としてヒト血管の代替として用いることができ、動脈硬化や動脈瘤等の循環器疾患の治療に用いることができる。また、人工靭帯、人工腱、人工皮膚、人工肺胞、人工子宮などにも応用できる。更に、シワとりなどのために皮膚に埋め込む美容整形にも応用できる。
また、本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルは、その混合ゲルに上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、軟骨細胞等を播種して増殖させた人工組織としても有用である。
さらに、本発明の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルは、その混合ゲルに上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、インスリン様成長因子、血管内皮細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子等の成長因子（増殖因子）、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、トロンボスポンジン、エンタクチン、オステオポンチン、フォンビルブランド因子、フィブリノーゲン等の細胞接着性タンパク質を加えた人工組織としても有用である。
Claims (14)
- 高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチン。
- 高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化すると共に、該分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸のアルキルエステルのアミノ基とカップリングさせて得られる化学修飾水溶性エラスチンと、コラーゲンを混合して得られる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル。
- 化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの重量比（化学修飾水溶性エラスチン／コラーゲン）が、１／２００～２００／１である請求項２記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル。
- 化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合して得られる請求項２又は３記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル。
- 化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンを混合して得られる混合ゲルに、放射線を照射したことを特徴とする請求項２～４のいずれか１項記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル。
- （１）高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化する工程、（２）該高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせる工程、及び、（３）前記（１）と（２）の工程を経て得られた化学修飾水溶性エラスチンを、コラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程からなる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- 化学修飾水溶性エラスチンとコラーゲンとの重量比（化学修飾水溶性エラスチン／コラーゲン）が、１／２００～２００／１である請求項６記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- 化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合することからなる請求項６又は７記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- （１）高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれる第１アミン及び第２アミンの一部又は全部をＮ－アシル化する工程、（２）該高分子量水溶性エラスチンの分子中に含まれるカルボキシル基の一部又は全部をアミノ酸の低級アルキルエステルのアミノ基とカップリングさせる工程、（３）前記（１）と（２）の工程を経て得られた化学修飾水溶性エラスチンを、コラーゲンと溶液状態で混合して混合ゲルを調製する工程、及び、（４）前記（３）で得られた混合ゲルに放射線を照射する工程からなる化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- 化学修飾水溶性エラスチンと、ほぼ同重量のコラーゲンを混合して放射線照射することからなる請求項９記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- 化学修飾水溶性エラスチンをコラーゲンよりも少量又は多量に混合して放射線照射することからなる請求項９記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの製造方法。
- 請求項１に記載の化学修飾水溶性エラスチンの医療用材料としての使用。
- 請求項２～５のいずれか１つに記載の化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲル又は請求項６～１１のいずれか１つに記載の製造方法により製造された化学修飾水溶性エラスチン・コラーゲン混合ゲルの医療用材料としての使用。
- 医療用材料が人工血管材料である、請求項１３に記載の使用。
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