JP6712014B2

JP6712014B2 - 水溶性エラスチン

Info

Publication number: JP6712014B2
Application number: JP2017247823A
Authority: JP
Inventors: 衣織前田; 照男鎌田
Original assignee: E&C HEALTH CARE INC.; Kyushu Institute of Technology NUC
Current assignee: E&C HEALTH CARE INC.; Kyushu Institute of Technology NUC
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2020-06-17
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN109957004A; JP2019112357A

Description

本発明は、動物性生体組織由来のエラスチンに関する。

エラスチンは、動物、例えば哺乳動物の靭帯や血管壁等の組織中に存在するタンパク質であり、皮膚に弾力を与える効果や、保水効果を有することから、健康食品や、化粧品での利用が進んでいる。特許文献１には、動物性生体組織から水溶性エラスチンを得る具体例が記載されている。

特許第４０７８４３１号公報

エラスチンには、アンジオテンシン変換酵素（以下、「ＡＣＥ」とも言う）の活性を阻害する作用がある。ＡＣＥとは、血圧の上昇に寄与する酵素であり、ＡＣＥの活性を阻害できれば、血圧の上昇を抑制可能である。また、エラスチンは、コアセルベーション能を有し、自己集合によって物質を包含することができることから、ドラッグデリバリーシステム等への利用が期待される。そして、ＡＣＥの活性の阻害作用は低分子のエラスチンで高く、コアセルベーション能は高分子のエラスチンで高くなることが知られている。

ここで、動物性生体組織から得られた水溶性エラスチンは、それを得る際になされた処理に応じて、分子量の範囲が決定される。例えば、特許文献１に記載の水溶性エラスチンの製造方法では、得られる水溶性エラスチンの分子量が１〜３万である。そのため、一の水溶性エラスチンは、高分子のエラスチン特有の性質及び低分子のエラスチン特有の性質を併せ持つことはできないと考えられていた。
本発明は、かかる事情に鑑みてなされるもので、ＡＣＥの活性を安定的に阻害すると共に、高いコアセルベーション能を有する水溶性エラスチンを提供することを目的とする。

前記目的に沿う本発明に係る水溶性エラスチンは、動物性生体組織由来の水溶性エラスチンにおいて、質量比で、分子量が１万以下の割合が４０％以上７０％以下であり、分子量が１万を超え３万以下の割合が１０％以上３０％以下であり、分子量が３万を超え３０万以下の割合が１０％以上４０％以下である。

本発明に係る水溶性エラスチンは、デスモシン及びイソデスモシンのモル比が０．４％を超え０．８％以下であるのが好ましい。

本発明に係る水溶性エラスチンは、該水溶性エラスチンを、カットオフ値が３０，０００の３０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液、及び、該３０ｋフィルタを透過した濾液を、カットオフ値が１０，０００の１０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液それぞれのデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、遠心分離を行っていない該水溶性エラスチンのデスモシン及びイソデスモシンのモル比より大きいのが好ましい。

本発明に係る水溶性エラスチンは、該水溶性エラスチンを、カットオフ値が３０，０００の３０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、該３０ｋフィルタを透過した濾液を、カットオフ値が１０，０００の１０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比より小さいのが好ましい。

本発明に係る水溶性エラスチンの製造方法は、動物性生体組織をアルカリ性溶液で溶解してエラスチン溶解溶液を得る溶解工程と、前記エラスチン溶解溶液を中和する中和工程と、中和された前記エラスチン溶解溶液を精密濾過膜（ＭＦ膜）、限外濾過膜（ＵＦ膜）及びナノ濾過膜（ＮＦ膜）のいずれか１で濾過する脱塩工程とを有し、前記エラスチン溶解溶液を、中和処理の前から脱塩処理が完了するまでコアセルベーションを抑制する温度に保つ。

本発明に係る水溶性エラスチンは、分子量分布がブロードである（広い）ため、ＡＣＥの活性を安定的に阻害すると共に、高いコアセルベーション能を有する。

（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ試料Ｎｏ．１及び試料Ｎｏ．１１の分子量分布を示すグラフである。水溶性エラスチンにおけるＡＣＥの活性阻害率の計測結果を示すグラフである。

続いて、添付した図面を参照しつつ、本発明を具体化した実施の形態につき説明し、本発明の理解に供する。
本発明の一実施の形態に係る水溶性エラスチンの製造方法は、動物性生体組織（本実施の形態では豚の大動脈血管）をアルカリ性溶液で溶解してエラスチン溶解溶液を得る溶解工程と、エラスチン溶解溶液を中和する中和工程と、中和されたエラスチン溶解溶液を精密濾過膜（ＭＦ膜）、限外濾過膜（ＵＦ膜）及びナノ濾過膜（ＮＦ膜）の少なくとも１で濾過して脱塩する脱塩工程とを有して、水溶性エラスチンを製造する。

動物性生体組織としては、例えば、豚の大動脈血管以外に、豚の項靭帯、牛の項靭帯、牛の大動脈血管、もしくは、魚の動脈球を用いることができるが、これに限定されない。
動物性生体組織は、エラスチンの含有率が低い脂肪部分等が取り除かれた後、希アルカリによりエラスチン以外の成分を除去する除去工程を経た後、溶解工程で、アルカリ性溶液に浸漬される。本実施の形態では、アルカリ性溶液として、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、及び、水酸化バリウムの少なくとも１を含有し、アルカリ化合物の濃度が０．０５〜０．５Ｎ（好ましくは、０．１〜０．３Ｎ）の溶液を採用している。除去工程は、コラーゲン等を除去して、最終的に得る水溶性エラスチンにおけるエラスチン（デスモシン／イソデスモシン）の純度を高めるための工程であるが、この工程を省略することも可能である。

動物性生体組織が浸漬されたアルカリ性溶液は、加熱され、動物性生体組織が溶解するまで、８０〜１０５℃、好ましくは、９０〜１００℃の範囲で温度が保たれる。
そして、動物性生体組織の全てが、溶解することによって、エラスチンを含有するエラスチン溶解溶液（動物性生体組織が溶解した溶液）が得られる。

次に、エラスチン溶解溶液に塩酸等を投入してエラスチン溶解溶液を中和し（中和工程）、その後、ナノ濾過膜（ＮＦ膜）による濾過によって脱塩し（脱塩工程）、水溶性エラスチンを得る。
本実施の形態では、中和処理を行う前から脱塩処理が完了するまで、エラスチン溶解溶液を冷却し３５℃以下（好ましくは３０℃以下、より好ましくは２０℃以下）の温度に保つ。エラスチンは高温（例えば、４０℃以上）でコアセルベーションが促進されるため、エラスチン溶解溶液を３０℃以下に保つことで、コアセルベーションを抑制することができる。コアセルベーションが生じると、エラスチンが固形物となり、水溶性エラスチンを得るまでの種々の処理で取り除かれるため、冷却は収率の向上のために有効である。

上述した製造方法によって得られた水溶性エラスチン（本発明の一実施の形態に係る動物性生体組織由来の水溶性エラスチン）について、ゲル濾過クロマトグラフィーによる分子量分布の計測を行ったところ、質量比で、分子量が１万以下の割合が４０％以上７０％以下であり、分子量が１万を超え３万以下の割合が１０％以上３０％以下であり、分子量が３万を超え３０万以下の割合が１０％以上４０％以下であった。そして、当該水溶性エラスチンは、ＡＣＥの活性を安定的に阻害可能で、高いコアセルベーション能を有することが確認された。

また、アミノ酸分析によって、当該水溶性エラスチンは、デスモシン及びイソデスモシンのモル比が０．４％を超え０．８％以下であり、エラスチンの含有量が多いことが確認された。更に、当該水溶性エラスチンを、カットオフ値が３０，０００のフィルタ（以下、「３０ｋフィルタ」とも言う）で遠心分離して得た濃縮液、及び、３０ｋフィルタを透過した濾液を、カットオフ値が１０，０００のフィルタ（以下、「１０ｋフィルタ」とも言う）で遠心分離して得た濃縮液それぞれのデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、遠心分離を行っていない（遠心分離不実施）の当該水溶性エラスチンのデスモシン及びイソデスモシンのモル比より大きいこと、並びに、３０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、３０ｋフィルタを透過した濾液を、１０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比より小さいことが確認された。

次に、豚の大動脈血管を基にして得た水溶性エラスチンの分子量分布を質量比で示す。

表１において、試料Ｎｏ．１〜１０は、上述した本特許の製造方法によって得られた水溶性エラスチン（本発明に係る水溶性エラスチン）であり、アルカリ性溶液に水酸化ナトリウムを使用し、ＮＴＲ−７４１０（ナノ濾過膜）を用いた濾過によって脱塩を行った。これに対し、試料Ｎｏ．１１の水溶性エラスチンは、アルカリ性溶液に水酸化ナトリウムを用いた点で試料Ｎｏ．１〜１０と共通するが、透析膜Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（登録商標）３，５００ｃｕｔによる透析によって脱塩した点で試料Ｎｏ．１〜１０の水溶性エラスチンとは相違する。
なお、表１の分子量分布において、「〜１万」は１万以下を意味し、「１万〜３万」は１万を超え３万以下を意味し、「３万〜３０万」は３万を超え３０万以下を意味する。

試料Ｎｏ．１〜１０は全て、１万以下の分子量の割合が４０％以上７０％以下、１万を超え３万以下の分子量の割合が１０％以上３０％以下、３万を超え３０万以下の分子量の割合が１０％以上４０％以下であった。これに対し、試料Ｎｏ．１１は、１万以下の分子量の割合が４０％未満であり、試料Ｎｏ．１〜１０に比べ、分子量１万未満の低分子の含有率が少なかった。
試料Ｎｏ．１及びＮｏ．１１の分子量分布を図１（Ａ）、（Ｂ）にそれぞれグラフで示す。

分子量分布を計測したゲル濾過クロマトグラフィーの実験条件を以下に示す。
カラム：ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）Ｇ２０００ＳＷＸＬ
流速：０．２ｍｌ／ｍｉｎ
溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液＋０．３ＭＮａＣｌ
波長：２２０ｎｍ
注入量：６０μＬ

また、試料Ｎｏ．１〜１０と同じ製造方法によって豚の大動脈血管から得た水溶性エラスチン（以下、「試料Ｎｏ．１２」とも言う）をカットオフ値が３０，０００の３０ｋフィルタ及びカットオフ値が１０，０００の１０ｋフィルタで順に分画した各サンプルに対しアミノ酸分析を計測した実験について記載する。
試料Ｎｏ．１２の分画のために用いたユニット及びフィルタを以下に示す。
遠心式フィルタユニット：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）Ｐｌｕｓ−７０
３０ｋフィルタ：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）３０ｋ
１０ｋフィルタ：Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（登録商標）１０ｋ

本実験では、まず、３０ｋフィルタを装着した遠心式フィルタユニットで試料Ｎｏ．１２を遠心分離して濃縮液（以下、「３０ｋ濃縮液」とも言う）及び濾液を得、次に、その濾液を、１０ｋフィルタを装着した遠心式フィルタユニットで遠心分離して濃縮液（以下、「１０ｋ濃縮液」とも言う）及び濾液（以下、「１０ｋ濾液」とも言う）を得た。なお、３０ｋフィルタ及び１０ｋフィルタは使用前に超純水による洗浄を行った。そして、３０ｋ濃縮液、１０ｋ濃縮液及び１０ｋ濾液それぞれを、高速アミノ酸分析計（Ｌ−８９００）によってアミノ酸分析した。アミノ酸分析結果を表２に示す。

表２において、Ｄｅｓはデスモシン、Ｉｄｅはイソデシモシン、Ｇｌｙはグリシン、Ａｌａはアラニン、Ｖａｌはバリン、Ｐｒｏはプロリン、Ａｓｐはアスパラギン酸、Ａｓｎはアスパラギン、Ｇｌｕはグルタミン酸、Ｇｌｎはグルタミン、Ｌｙｓはリシン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ａｒｇはアルギニンをそれぞれ意味し、「全体」は遠心分離を行っていない試料Ｎｏ．１２を意味する。

表２に示す結果より、全体に対するデスモシン及びイソデスモシンのモル比が０．４０４％、即ち、０．４％を超え０．８％以下であること、１０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６８３％）及び３０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６４３％）が共に、全体に対するデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．４０４％）より大きいことが確認できる。

そして、１０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６８３％）及び３０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６４３％）が共に、遠心分離不実施の試料Ｎｏ．１２のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．４０４％）より大きいこと、並びに、３０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６４３％）が１０ｋ濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比（０．６８３％）より小さいことが確認できる。

また、水溶性エラスチンについて、ＡＣＥの活性阻害率を実験により計測した。
計測対象物は、１）試料Ｎｏ．１１と同じ製造方法によって豚の大動脈血管から得た水溶性エラスチン（以下、「比較例１」と言う）、２）比較例１をエラスターゼによる酵素分解で低分子化した水溶性エラスチン（以下、「比較例２」と言う）、３）試料Ｎｏ．１〜１０と同じ製造方法によって豚の大動脈血管から得た水溶性エラスチン（以下、「実施例」）である。計測結果を、図２に示す。

比較例１、２及び実施例のＡＣＥの活性阻害率はそれぞれ、８．４％、４８．０％、４１．５％であった。なお、ＡＣＥの活性阻害率は次のようにして求めた。即ち、エラスチンを加えなかった状態でのＡＣＥの活性を１００として、比較例１、２又は実施例をＡＣＥに加えた際のＡＣＥの活性がＸであれば、ＡＣＥの活性阻害率＝１００−Ｘ％、とした。

比較例１、２のＡＣＥの活性阻害率の計測結果より、エラスチンを低分子化することによって、ＡＣＥの活性阻害率が高くなることが確認された。この点、エラスチンは人体に取り込まれると時間の経過により分解されて低分子化されることが知られており、実施例に含まれる高分子のエラスチンは時間の経過によって低分子となり、ＡＣＥの活性を安定的に阻害できるようになると考えられる。

比較例１、２及び実施例の計測結果より、ＡＣＥの活性阻害率の差は、比較例１と比較例２の差が３９．６％（＝４８．０−８．４％）と大きかったのに対し、実施例と比較例２との差は６．５％（＝４８．０−４１．５％）と小さかった。よって、実施例は低分子化せず、上述した高分子量の分布の割合（即ち、分子量が１万以下の割合が４０％以上７０％以下であり、分子量が１万を超え３万以下の割合が１０％以上３０％以下であり、分子量が３万を超え３０万以下の割合が１０％以上４０％以下である割合）を確保しながらＡＣＥの活性を安定的に阻害できることが確認できた。これは、実施例に含まれる、特に、分子量が１万以下の低分子のエラスチンが作用しているためであると考察される。

そして、高分子のエラスチンが体内で時間の経過により低分子となってＡＣＥの活性阻害能が高くなることを考慮すると、実施例は高分子のエラスチンとの相乗効果が有効に発揮され、人体に摂取されることで、ＡＣＥの活性を安定的に阻害する作用を継続可能であると考えられる。よって、実施例は血圧の上昇抑制剤として有効である。

以上、本発明の実施の形態を説明したが、本発明は、上記した形態に限定されるものでなく、要旨を逸脱しない条件の変更等は全て本発明の適用範囲である。
例えば、動物性生体組織をアルカリ性溶液ではなく、酸性溶液や分解酵素によって溶解して、本発明に係る水溶性エラスチンを得るようにしてもよい。

Claims

動物性生体組織由来の水溶性エラスチンにおいて、質量比で、分子量が１万以下の割合が４０％以上７０％以下であり、分子量が１万を超え３万以下の割合が１０％以上３０％以下であり、分子量が３万を超え３０万以下の割合が１０％以上４０％以下であることを特徴とする水溶性エラスチン。
請求項１記載の水溶性エラスチンにおいて、デスモシン及びイソデスモシンのモル比が０．４％を超え０．８％以下であることを特徴とする水溶性エラスチン。
請求項１又は２記載の水溶性エラスチンにおいて、該水溶性エラスチンを、カットオフ値が３０，０００の３０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液、及び、該３０ｋフィルタを透過した濾液を、カットオフ値が１０，０００の１０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液それぞれのデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、遠心分離を行っていない該水溶性エラスチンのデスモシン及びイソデスモシンのモル比より大きいことを特徴とする水溶性エラスチン。
請求項１又は２記載の水溶性エラスチンにおいて、該水溶性エラスチンを、カットオフ値が３０，０００の３０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比は、該３０ｋフィルタを透過した濾液を、カットオフ値が１０，０００の１０ｋフィルタで遠心分離して得た濃縮液のデスモシン及びイソデスモシンのモル比より小さいことを特徴とする水溶性エラスチン。