CN102906109B - 化学修饰水溶性弹性蛋白、化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原的混合凝胶以及它们的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明要解决的课题在于,利用水溶性弹性蛋白和胶原而提供生体适应性优异且具有充分的弹性、伸展性、强度的人工血管等医疗用材料。上述的课题通过以下的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶而达成。即,使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联,从而得到化学修饰水溶性弹性蛋白,将该化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的胶原混合而得到的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶;以及将化学修饰水溶性弹性蛋白相对于胶原增量或减量后混合而得到的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶;以及对这些混合凝胶照射放射线后的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。
Description
技术领域
本发明涉及存在能够利用于人工血管用材料等用途的可能性的化学修饰水溶性弹性蛋白、化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原的混合凝胶以及它们的制造方法。
背景技术
人工血管主要在循环器官系统的疾病、损伤时被用作生体的血管的代替品。作为现在受到瞩目的人工血管的例子,有在合成高分子材料中导入胶原、明胶、弹性蛋白或纤连蛋白等而再播种细胞的混合型人工血管。该混合型人工血管存在受激烈的血流影响而细胞剥离的问题。此外,由于构成基底的材料为合成高分子,因而在生体适应性方面也存在问题,在制作直径为3mm以下的人工血管并进行了移植的情况下,存在为了防止因血栓使血管内腔狭窄而不得不连续地饮用抗血液凝固剂这样的问题。进而,在成长期移植该人工血管时,存在随着成长而不得不通过再度手术来移植人工血管这样的问题。
作为被用作这些混合型人工血管的基底的合成高分子,现在,以延伸多孔聚四氟乙烯(e-PTFE)为主流,该聚合物的非粘附性、弯曲性优异,但是在强度方面存在问题,只能用于静脉、小动脉(内径为4~8mm)。这样,由于合成高分子存在问题,因此作为代替合成高分子的材料的生体高分子受到注目。生体高分子中,胶原在生体中大量存在(占生体中的蛋白质的约1/3。),还具有生体适应性、细胞黏附性,正在尝试利用胶原进行人工血管的制作,而100%胶原的人工血管在强度方面存在问题。
此外,还已知将胶原和水溶性弹性蛋白组合并像后述那样制成医疗用材料的方案。弹性蛋白是指在动物尤其是哺乳动物的皮肤的真皮、韧带、肌腱、血管壁等结缔组织中与胶原共存的蛋白质。弹性蛋白通常在生体内以三维网状结构的不溶性蛋白质的形式存在。众所周知,通过对该弹性蛋白用酸或碱进行水解或者用酶进行处理,从而可以得到上述水溶性弹性蛋白。水溶性弹性蛋白由于具有保持丰富的水分的能力,因此除了作为化妆品尤其是保湿剂而被利用以外,还具有对皮肤赋予弹力等美容效果,与胶原等一起作为健康食品而被利用。
而且,进一步提出了将水溶性弹性蛋白与可溶化胶原混合而得到成型用组合物的方案(专利文献1);以及在人工血管基材的内壁面设置胶原层,利用交联剂使水溶性弹性蛋白与其交联的方案(专利文献2)。此外,还提出了将被交联的弹性蛋白与胶原等生体高分子的混合物用作医疗用材料的方案(专利文献3)。但是,还尚未开发出经得住实用的人工血管等。此外,本发明人等提出了得到水溶性弹性蛋白的方法(专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特公平6-30616号公报
专利文献2:日本特开平8-33661号公报
专利文献3:国际公开第2002/96978号小册子
专利文献4:日本特开2007-45722号公报
发明内容
本发明的课题在于,利用水溶性弹性蛋白和胶原而提供生体适应性优异且具有充分的强度、弹性以及伸展性的人工血管等医疗用材料。
上述课题通过如下述那样的本发明的各方案而达成。
本发明的方案之一为,一种化学修饰水溶性弹性蛋白,其通过使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联而得到。N-酰化有N-甲酰化、N-乙酰化、N-苯甲酰化等,优选N-乙酰化。此外,N-酰化可以使用氨基甲酸酯型、烷基型。在上述弹性蛋白的羧基与氨基酸烷基酯进行的酰胺化中使用的氨基酸,可从构成蛋白质的甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等约20种中进行选择。本发明中,“高分子量水溶性弹性蛋白”是指分子量为约1万以上、优选为约3~30万的物质。
本发明的另一方案为,一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,其通过将化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原混合而得到,所述化学修饰水溶性弹性蛋白通过使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联而得到。在该方案中,优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的胶原混合而得到的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。此外,还优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与比其少量或多量的胶原混合而得到的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。“大致相同重量”是指化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原的重量比为95~105重量%以内。
本发明的另一方案为,一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其是上述化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括:(1)使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化的工序;(2)使该高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联的工序;以及,(3)将经由上述(1)和(2)的工序得到的化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序。在该方案中,也优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的胶原混合的方法。此外,还优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与比其少量或多量的胶原混合的方法。
本发明的再一方案为,一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括:(1)使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化的工序;(2)使该高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联的工序;(3)将经由上述(1)和(2)的工序得到的化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序;以及,(4)对上述(3)中得到的混合凝胶照射放射线的工序。在该方案中,也优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的胶原混合的方法。此外,还优选将化学修饰水溶性弹性蛋白与比其少量或多量的胶原混合的方法。
本发明的另一方案为上述的化学修饰水溶性弹性蛋白的作为医疗用材料的用途。此外,本发明的另一方案为上述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶或通过上述的制造方法制造的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的作为医疗用材料的用途。在此,医疗用材料包括人工血管材料等。
由本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶得到的材料,与弹性蛋白或胶原单独、或者它们的混合物相比,强度、弹性及伸展性得到大幅地改善,因此能够作为人工血管等的医疗用材料来利用的可能性高。在使用疏水度大的氨基酸作为在化学修饰中使用的氨基酸的情况下、或者在化学修饰使用疏水性大的肽的情况下,能够制作与猪、狗的大动脉的应力为同等程度或者具有比其更高的强度、弹性及伸展性的人工血管材料等。
附图说明
图1是表示未修饰水溶性弹性蛋白(Ela)在pH5.0、7.4及9.0下的温度与浊度的关系的曲线(浊度曲线)。
图2是使用WSCI(100eq)使N-乙酰基水溶性弹性蛋白(N-Ac-Ela)和甘氨酸(G)甲酯进行偶联而制作的N-乙酰基-O-G-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(G)-Ela)在pH5.0、7.4及9.0下的浊度曲线。
图3是使用WSCI(10eq)使N-Ac-Ela和甘氨酸(G)甲酯进行偶联而制作的N-乙酰基-O-G-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(G)-Ela)在pH5.0、7.4及9.0下的浊度曲线。
图4是使用WSCI(50eq)使N-Ac-Ela和甘氨酸(G)甲酯进行偶联而制作的N-乙酰基-O-G-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(G)-Ela)在pH5.0、7.4及9.0下的浊度曲线。
图5是3种不同的化学修饰水溶性弹性蛋白(Cm-Ela)即N-乙酰基-O-G-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(G)-Ela)、N-乙酰基-O-V-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(V)-Ela)、N-乙酰基-O-F-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(F)-Ela)在pH7.4下的浊度曲线。
图6是胶原(Co1)单独的浓度为1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml时在pH7.4下的浊度曲线。
图7是Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(G)-Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(V)-Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(F)-Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)在pH7.4下的浊度曲线。
图8是Col单独凝胶(1.5mg/ml)、Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)的应力-应变曲线。
图9是Cm(G)-Ela相对于Col的混合比不同的Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)及Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为4.5mg/ml∶1.5mg/ml)的应力-应变曲线。
图10是对3种不同的混合凝胶即Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(V)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(F)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)以及猪大动脉的到60%应变为止的应力和应变进行了比较的应力-应变曲线。
图11是由Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)制作的内径为5mm、外径为8mm的人工血管。
图12是Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)和γ射线照射Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)的应力-应变曲线。
图13是Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)和γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)的应力-应变曲线。
图14是对Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、γ射线照射Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)以及猪大动脉的应力和应变进行了比较的应力-应变曲线。
图15是对Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、γ射线照射Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)以及猪大动脉的到50%应变为止的应力和应变进行了比较的应力-应变曲线。
具体实施方式
本发明的水溶性弹性蛋白在来自哺乳动物及鸟类的情况下,构成弹性蛋白的氨基酸的约78~85%由脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸构成,约2~4%由天冬氨酸和谷氨酸构成,约1~2%由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成,约0.1~0.4%由锁链赖氨素和异锁链赖氨素构成,是分子量为约1万~30万、优选为约3万~30万的高分子量水溶性弹性蛋白。此外,本发明的水溶性弹性蛋白在来自鱼类的情况下,构成弹性蛋白的氨基酸的约67~77%由脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸构成,约4~6%由天冬氨酸和谷氨酸构成,约2~4%由赖氨酸、组氨酸、精氨酸构成,约0.1~0.4%由锁链赖氨素和异锁链赖氨素构成,是分子量为约1万~30万、优选为约3万~30万的高分子量水溶性弹性蛋白。
本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白是通过使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联而得到的化学修饰水溶性弹性蛋白。N-酰化有N-甲酰化、N-乙酰化、N-苯甲酰化等,优选N-乙酰化。此外,N-酰化可以使用氨基甲酸酯型、烷基型。在上述弹性蛋白的羧基与氨基酸烷基酯进行的酰胺化中使用的氨基酸可以是构成蛋白质的甘氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸等约20种中的任一种。
作为本发明的另一方案的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶通过以下工序来制造:首先,使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化的工序(第1工序);接着,使所得的N-酰化水溶性弹性蛋白分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联而进行化学修饰的工序(第2工序);然后,将所得的化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的或比其少量或多量的胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序(第3工序)。
作为本发明的再一方案的照射放射线后的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶通过以下工序获得:首先,使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化(第1工序);接着,将所得的N-酰化水溶性弹性蛋白分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联而进行化学修饰(第2工序);再将经由第1工序和第2工序得到的化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶(第3工序);然后,对所得的混合凝胶照射放射线(第4工序)。在该方案中,可以通过将化学修饰水溶性弹性蛋白与大致相同重量的或者比其少量或多量的胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序来制造。化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原的重量比(化学修饰水溶性弹性蛋白/胶原)优选为1/200~200/1,更优选为1/100~50/1,进一步优选为1/50~5/1,特别优选为1/3~3/1。
例如,在使用本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶而制作人工韧带、人工皮肤、人工肌腱、人工血管等来代替生体组织的情况下,上述重量比优选为1/50~5/1,在制作不代替生体组织的人工纤维、人工防粘连膜、人工缝合线或人工膜等的情况下,弹性蛋白重量/胶原重量的范围可以较为广泛,上述重量比优选为1/100~50/1,此外,在应用于生体以外的例如合成纤维、合成膜等的情况下,弹性蛋白重量/胶原重量的范围可更广泛,上述重量比优选为1/200~200/1。
本发明中,使水溶性弹性蛋白的N末端及赖氨酸、精氨酸等氨基酸残基侧链的氨基等进行酰化,接着,使C末端及天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸残基侧链的羧基等与氨基酸烷基酯的氨基进行偶联,从而得到化学修饰水溶性弹性蛋白。利用化学修饰使氨基等和羧基等受到保护,从而弹性蛋白的带电消失,其结果为,弹性蛋白分子间的疏水的相互作用增加,使得所得的化学修饰水溶性弹性蛋白具有比未修饰弹性蛋白更高的自组装性(self-assembling)。
此外,提出了各种各样的得到水溶性弹性蛋白的方法和手段。优选的是,本发明人提出的下述方法(参照专利文献4)。
第1方法为,从动物性生体组织进行胶原、其他无用蛋白质的除去处理,得到不溶性弹性蛋白,接着,将该不溶性弹性蛋白浸渍和溶解在草酸、氢氧化钠等可溶化液中,制造水溶性弹性蛋白。胶原、其他无用蛋白质的除去处理优选如下地进行,即,在90~105℃的碱性溶液中浸渍动物性生体组织5~60分钟,优选10~20分钟,其中,所述碱性溶液包含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡的至少一种,且该碱性溶液中添加的氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡的总量为相对于每1L溶液为0.05~0.5mol,优选0.05~0.3mol。此外,在胶原、其他无用蛋白质的除去处理时,优选在利用碱性溶液进行的处理之前进行使动物性生体组织浸渍于包含氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化钡的至少任一种的盐溶液的浸渍处理(前处理)。
作为动物性生体组织,没有特别的限制,在弹性蛋白的含量多这一点上,优选使用从猪、马、牛、羊等哺乳动物得到的项韧带、大动脉血管。此外,可以使用鸟类的大动脉血管、弹性蛋白含量多的鱼类的动脉球(心脏)等。动物性生体组织以首先使用均质器进行均质化为佳。均质化只要能够细切动物性生体组织即可,可以使用搅拌机、绞肉机等,优选使用能够细切至3毫米见方以下的器具,更优选能够细切成颗粒状的器具。细切的动物性生体组织的颗粒越小,则越能够提高胶原、其他不用蛋白质的除去效果,故优选。均质化的动物性生体组织,例如可以在热水或热稀碱水溶液中煮沸或者通过用有机溶剂处理来进行脱脂处理。
作为上述可溶化液,可以使用包含草酸、甲酸、醋酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、安息香酸、甜菜碱、二氟醋酸、三氟醋酸、磷酸、氨基磺酸、高氯酸、三氯醋酸的至少任一种的酸性溶液。而且,该酸性溶液的酸的总量为相对于每1L溶液为0.05~5mol,优选为0.1~2mol,并且优选液温为90~105℃的酸性溶液。
上述可溶化液还可以是包含氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡的至少任一种的碱性溶液。在该碱性溶液中添加的氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡的总量为相对于每1L溶液为0.05~5mol,优选为0.05~2mol,并且优选液温为90~105℃的碱性溶液。
第2方法为依次进行以下工序而制造水溶性弹性蛋白的方法:包括动物性生体组织的不要部分的除去处理、动物性生体组织的细切处理、动物性生体组织的脱脂处理和盐处理的至少任一者的前处理工序;将前处理后的动物性生体组织浸渍在碱性溶液并过滤胶原、其他无用蛋白质的碱提取工序;重复规定次数的将碱提取工序后的残渣用碱溶解的碱溶解工序,并通过过滤得到包含水溶性弹性蛋白的滤液的滤液回收工序;从滤液生成水溶性弹性蛋白的水溶性弹性蛋白生成工序。作为在上述碱溶解工序中使用的碱,优选氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化钡的任一种或混合物。
该操作与上述的、从组织除去胶原、其他无用蛋白质而得到不溶性弹性蛋白,接着使该不溶性弹性蛋白可溶化,从而得到水溶性弹性蛋白的第1方法不同,其是无需从组织得到不溶性弹性蛋白而直接得到水溶性弹性蛋白的方法。即,该方法如下:在以相对于每1L溶液为0.05~0.5mol、优选0.05~0.3mol且90~105℃的碱性溶液中,浸渍经细切、脱脂、盐处理的动物性生体组织5~60分钟、优选10~20分钟,得到除去了弹性蛋白以外的胶原、无用蛋白质的处理组织,接着,在相对于每1L溶液为0.05~5mol、优选0.05~2mol(碱液的浓度为更高浓度)且90~105℃的碱性溶液中浸渍该处理组织5~420分钟,优选10~240分钟(时间更长),溶解,得到水溶性弹性蛋白。
就像上述那样在第1方法或第2方法中得到的水溶性弹性蛋白而言,对包含水溶性弹性蛋白的水溶液进行中和,接着,例如通过对该中和溶液进行透析处理或使用纳滤(NF)膜等的膜处理,从而脱盐以及除去低分子量的物质,得到本发明中使用的高分子量水溶性弹性蛋白。
本发明中使用的胶原可以使用作为医疗用途已知的任意的胶原。通常,适于医疗用途的胶原一般使用以下方法得到:在酸、碱、中性等的条件下用酶等主要从作为原料的动物提取,使粘稠的胶原溶液或该溶液干燥,以固体的状态获得。此外,通过进一步实施胃蛋白酶处理,从而除去抗原性表达部位,使移植到体内或体表面时无抗原性,也可以得到更适合医疗基材的胶原(去端肽胶原)。作为在本发明中使用的代表性的胶原,可列举出酸可溶化胶原、碱可溶化胶原、酶可溶化胶原、中性可溶化胶原等可溶化胶原,特别优选与可溶化处理同时实施作为胶原的抗原决定基的端肽的除去处理的去端肽胶原。
在本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造中,首先,使高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部N-酰化、优选N-乙酰化,得到N-乙酰化水溶性弹性蛋白。在构成弹性蛋白的氨基酸残基中,作为反应性的伯胺或仲胺的氨基酸(碱性氨基酸),可列举出赖氨酸、精氨酸及组氨酸,作为高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺,也包括末端氨基。
本发明中,高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部优选通过醋酸酐等乙酰化试剂进行N-乙酰化,N-乙酰化的程度优选以下述式所示的修饰率计为95%以上。
修饰率(%)=(1-B/A)×100
A表示从水溶性弹性蛋白的吸光度(波长345nm)的平均值减去空白的吸光度的平均值而得到的值。B表示从N-乙酰化水溶性弹性蛋白的吸光度(波长345nm)的平均值减去空白的吸光度的平均值而得到的值。
接着,使本发明中得到的N-酰化、优选N-乙酰化水溶性弹性蛋白分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联,并进行化学修饰,得到化学修饰水溶性弹性蛋白。本发明中优选碳原子数为1~4的低级烷基酯,特别优选甲酯。此外,也可以使用苄基酯等那样的烷基酯。在构成弹性蛋白的氨基酸残基中,作为具有羧基的氨基酸(酸性氨基酸),有天冬氨酸和谷氨酸,作为高分子量水溶性弹性蛋白的分子中含有的羧基,也包括末端羧基。
本发明中优选的是N-酰化、优选N-乙酰化水溶性弹性蛋白分子中含有的羧基的大致全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联。在偶联反应时,方便的是使用碳化二亚胺等的偶联剂或缩合剂。
接着,本发明中,制作像上述那样得到的化学修饰水溶性弹性蛋白和上述的胶原的各水溶液,以含有大致相同重量的这两种物质的水溶液状态、或将化学修饰水溶性弹性蛋白相对于胶原增量或减量后的水溶液状态进行混合,制备混合凝胶。在上述方法中得到本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。而且,所得的混合凝胶可以直接用作人工血管等医疗用材料的基底,或者经过适当的加工后用作人工血管等医疗用材料的基底。
本发明的再一方案中,对像上述那样得到的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,在以溶液使其溶胀的状态或干燥状态下,照射电子射线、γ射线等放射线,得到放射线照射化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。作为放射线,优选γ射线,为了使混合凝胶的杨氏模量上升优选2倍以上,而照射所需的辐射剂量。
通过用γ射线等进行照射,混合凝胶被灭菌和交联,进一步实现材料的强度的增强。照射条件没有特别的限定,例如,在Co-60γ射线的情况下,在20~50℃、优选30~40℃下0.5~50kGy左右、优选5~40kGy左右的照射是适当的。
实施例
以下,通过实施例详细叙述本发明。各种测定法如以下所述。
[N-乙酰化的修饰率]
基于TNBS (2,4,6-三硝基苯磺酸)法按照以下方式进行测定,计算N-乙酰化的修饰率。在1mg/ml的N-乙酰化水溶性弹性蛋白(N-Ac-Ela)水溶液中加入4%的碳酸氢钠溶液、0.1%的TNBS水溶液各1ml。将只添加了4%的碳酸氢钠溶液、0.1%的TNBS水溶液各1ml的情况设为空白(n=3)。用铝箔对所制作的溶液进行遮光,使其在40℃反应2小时。反应结束后,在所制作的溶液0.17ml中添加10%SDS 1ml、1N·HCl 0.5ml,分别测定在345nm下的吸光度。此外,修饰率根据以下的式子求出。
将从弹性蛋白水溶液的吸光度的平均值减去空白的吸光度的平均值而得到的值设为A,将从N-Ac-Ela水溶液的吸光度的平均值减去空白的吸光度的平均值而得到的值设为B。修饰率用修饰率(%)=(1-B/A)×100来表示。
[浊度测定]
水溶性弹性蛋白(Ela)、3种化学修饰水溶性弹性蛋白(Cm-Ela)、I型胶原(Col)分别溶解在PBS(磷酸缓冲生理食盐水,pH7.4)或pH5.0、7.4、9.0的溶液中。使这些物质的各溶液在Ela单独、3种Cm-Ela单独、Col单独、Ela和Col共存状态、3种Cm-Ela与Col共存状态下在波长为400nm、温度范围为5℃~65℃,温度上升速度为0.5℃/min、氮气气流下的条件下进行了浊度测定。溶剂使用超纯水或考虑生理的条件下而使用PBS,测定仪器使用带帕尔贴(Peltier)式温度控制器的分光光度计(日本分光(株)制造:Ubest-50)。
[来自猪的水溶性弹性蛋白的制作]
1)来自猪的不溶性弹性蛋白的分离
按照以下的步骤从猪大动脉脱脂组织提取并除去NaCl可溶及NaOH可溶的弹性蛋白以外的无用蛋白质、胶原。
使用猪大动脉脱脂组织(生体组织),用刀具等剥离因前处理而附着的脂肪、肌肉等弹性蛋白含量的低的部分,从而进行不要部分的除去处理,接着,使用均化器对生体组织进行均质化,从而进行细切处理。用热水、热稀碱水溶液或丙酮等有机溶剂对均质化后的生体组织进行处理,在进行了脱脂处理后使其干燥。接着,加入脱脂干燥组织重量的约10倍容量的1M氯化钠,在室温下搅拌1小时,提取并除去NaCl可溶的无用蛋白质。将该操作重复5次,然后,用蒸馏水进行洗涤,通过离心分离(3,000rpm,5分钟)除去水分。
添加相对于像上述那样进行了脱脂及盐处理后的生体组织的重量为约10倍容量(每1g重量为10ml)的0.1N氢氧化钠水溶液,在100℃下搅拌15分钟,进行除去弹性蛋白以外的胶原、无用蛋白质的工序。然后,将生体组织和碱性溶液进行分离。用例如滴定法对分离后的碱性溶液进行总蛋白质的定量,重复该操作,直到碱性溶液中含有的总蛋白质量成为0.1mg/mL以下为止。然后,冷却,通过离心分离(5,000rpm,20分钟)进行洗涤,干燥残渣,从而得到不溶性弹性蛋白。
2)高分子量的来自猪的水溶性弹性蛋白的制备
在来自猪的不溶性弹性蛋白中添加其干燥重量的10倍容量的0.5N氢氧化钠,在100℃下搅拌30分钟。反应后,迅速用冰冷却溶液,用醋酸或盐酸进行了中和。然后,使用对分子量6,000~8,000以上进行分级的透析膜,进行了1周的透析。然后,冷冻干燥,得到高分子量的来自猪的水溶性弹性蛋白。
[化学修饰水溶性弹性蛋白的制作]
如下所述,对高分子量的来自猪的水溶性弹性蛋白进行N-乙酰化以及利用O-氨基酸甲酯的偶联的化学修饰。
1)N-乙酰基水溶性弹性蛋白的制作
在少量的三氟乙醇(TFE)中溶解由上述得到的来自猪的水溶性弹性蛋白,向其中添加吡啶(100eq)和醋酸酐(100eq),搅拌了一夜。在通过茚三酮试验确认了乙酰化定量地进行之后,利用蒸发器对反应液进行了减压浓缩。该N-乙酰化重复进行数次,直到基于TNBS法的氨基等的修饰率成为95%以上为止。然后,对该溶液进行1周的透析,除去溶剂、未反应试剂,冷冻干燥,得到N-乙酰基水溶性弹性蛋白。
另外,本发明中以从N-乙酰基水溶性弹性蛋白的平均分子量求出的所使用的原料的摩尔数(1摩尔当量)为基准来表示试剂的摩尔当量数(eq)。附图说明中也同样。
2)氨基酸甲酯的偶联反应
在少量的二甲基甲酰胺(DMF)中溶解上述得到的N-乙酰基水溶性弹性蛋白(N-Ac-Ela),向其中添加水溶性碳化二亚胺(WSCI)。搅拌15分钟后,添加溶解有3种氨基酸甲酯即甘氨酸(G)的甲酯(H-G-OMe)、缬氨酸(V)的甲酯(H-V-OMe)、苯丙氨酸(F)的甲酯(H-F-OMe)这三者和三乙胺的少量的DMF溶液。搅拌一昼夜后,对该溶液进行1周的透析,除去溶剂、未反应试剂等,冷冻干燥,从而得到3种化学修饰水溶性弹性蛋白,即,N-乙酰基-O-G-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(G)-Ela)、N-乙酰基-O-V-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(V)-Ela)、N-乙酰基-O-F-甲酯水溶性弹性蛋白(Cm(F)-Ela)。
未修饰Ela的结果如图1所示,使用WSCI使氨基酸甲酯与N-Ac-Ela偶联的结果如图2~4所示。图1是未修饰Ela在pH5.0、7.4及9.0下的温度与浊度的关系的曲线(浊度曲线),图2是使用WSCI(100eq)使N-Ac-Ela和甘氨酸(G)甲酯进行偶联而制作的Cm(G)-Ela在pH5.0、7.4及9.0下的浊度曲线。根据图1,Ela在生理条件37℃、pH7.4下不发生自组装。不发生自组装的理由在于Ela的等电点位于酸性侧(pH5.5附近)。为此,为了将等电点维持在pH7.4附近,本发明中使氨基进行N-乙酰化并通过羧基与氨基酸甲酯的偶联而进行化学修饰。
其结果可见:如图2所示,相对于Ela的自组装开始温度,所得的化学修饰水溶性弹性蛋白(Cm-Ela)的自组装开始温度向低温侧偏移,在生理条件(pH7.4附近)下显示出充分的浊度强度。此外,可见:由于浊度强度上升,进而即使在不同的pH下也能得到大致相同的浊度曲线,因此,利用氨基酸甲酯的偶联的羧基等的修饰率大体上是理想的。
图3和图4是表示N-Ac-Ela与氨基酸甲酯的偶联反应时的、偶联剂(WSCI)的添加量与浊度曲线的关联的图。图3是WSCI为10eq的情况,图4是WSCI为50eq的情况。可见所添加的WSCI的量对修饰率影响较大,在考虑图2的WSCI为100eq时,可见在100eq的使用下偶联反应大体上完全地进行。
图5中示出3种不同的化学修饰水溶性弹性蛋白即Cm(G)-Ela、Cm(V)-Ela、Cm(F)-Ela的浊度曲线。可见,随着所使用的氨基酸即甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、苯丙氨酸(F)的疏水度变高,自组装开始温度变早,浊度强度也增加。这暗示着分子的疏水性越高Ela的自组装越被促进。
[水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶及化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制作]
按照胶原和水溶性弹性蛋白、或者胶原和化学修饰水溶性弹性蛋白各为1.5mg/ml∶1.5mg/ml的方式,以及按照胶原和化学修饰水溶性弹性蛋白为1.5mg/ml∶4.5mg/ml的方式,制备总量2ml的溶液。溶剂使用PBS(pH7.4)。将其在37℃静置1小时,使其凝胶化。然后,使其干燥,进行玻璃化,接着,添加2ml PBS(pH7.4),静置48小时,使其溶胀,得到本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。
[化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的各种性能的测定]
[浊度曲线]
图6表示Col单独的溶液的浊度曲线。图7中示出Col和Ela混合溶液以及Col和3种Cm-Ela混合溶液的浊度曲线。Ela和Col混合溶液中浊度曲线与Col单独为同类型,浊度强度比Col单独时降低。由此可知,在未修饰Ela中,由于在自组装开始时侵吞周围的分子的Col的凝胶化的特性,Ela分子在不自组装的状态下被Col侵吞。浊度强度的降低是由于比以Col单独进行凝胶化更早地进行未发生自组装的Ela分子的侵吞而引起的。在3种Cm-Ela和Col混合溶液中,它们的自组装开始温度显示出与3种Cm-Ela各个单独的情况同样的自组装开始温度,但浊度强度上升。其原因认为是,由于Cm-Ela和Col混合溶液的自组装开始温度比Col单独时的自组装开始温度(凝胶化温度)早,因此在其自组装开始时Cm-Ela的自组装受到了较大的影响。
[拉伸试验]
按照Ela和Col的混合凝胶及Cm-Ela和Col的混合凝胶的各自的起始长度为5mm的方式,将两端固定在螺旋式材料试验机(AutographAG-S-J,(株)岛津制作所)后,测定各凝胶的厚度和宽度,分别求出横截面积。接着,对以位移速度0.05mm/s使各凝胶仅伸展3mm(应变60%)时的应力和应变的关系进行了测定。再以位移速度0.05mm/s拉伸各凝胶直至断裂,测定断裂应力,对拉伸至断裂时的应力和应变的关系进行了测定。
Col单独凝胶、Ela和Col混合凝胶、Cm (G)-Ela和Col混合凝胶的应力-应变曲线如图8所示。根据图8,Col单独凝胶的断裂应力为89kPa,最大应变为84%。Ela·Col混合凝胶的断裂应力为87kPa,最大应变为101%,这显示出与Col单独凝胶相同程度的断裂应力,在Col单独凝胶中最大应变增加。此外,Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的断裂应力为106kPa,最大应变为109%,这表示断裂应力、最大应变均比Ela·Col混合凝胶增加。这些结果认为是由于,通过对Col添加Ela,从而对凝胶附加弹性,通过进一步添加自组装能高的Cm(G)-Ela,从而附加刚性和更大的弹性。
Cm(G)-Ela相对于Col的混合比不同的Cm(G)-Ela和Col混合凝胶的应力-应变曲线如图9所示。根据图9,Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)的断裂应力为106kPa,最大应变为109%,与其相比,Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为4.5mg/ml∶1.5mg/ml)的断裂应力为114kPa,最大应变为130%,断裂应力、最大应变均增加。其原因认为是,通过增加Cm(G)-Ela的添加量,从而附加更大的弹性和刚性。此外,由于最大应变的增加率(20%)比断裂应力的增加率(8%)大,因此与Ela的刚性相比在提高弹性上的贡献更大。
Cm(G)-Ela和Col混合凝胶、Cm(V)-Ela和Col混合凝胶、Cm(F)-Ela和Col混合凝胶、以及猪大动脉的应力-应变曲线如图10所示。根据图10,与60%应变对应的应力,在Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)中为43kPa,在Cm(V)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)中为63kPa,在Cm(F)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)中为78kPa。即,用疏水性大的氨基酸甲酯进行了偶联的化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原的混合凝胶应力变大。由此认为,Ela的混合凝胶在提高应力上的贡献的大小依赖于Ela的自组装能力的大小。
表1是示出了将对本发明的3种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶即Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(V)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(F)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)及Cm(G)-Ela·Col混合凝胶照射了15kGy、30kGy的γ射线的15kGyγ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、30kGyγ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)的与50%应变对应的应力与猪大动脉、狗腹部大动脉进行了比较的值。
【表1】
根据表1,用疏水度大的氨基酸甲酯进行了偶联的、化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原的混合凝胶Cm(F)-Ela·Col混合凝胶的与50%应变对应的应力显示出与猪大动脉及狗腹部大动脉的应力相近的强度。进而照射了γ射线的Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的应力显示出比猪大动脉及狗腹部大动脉的应力大的强度。由此,本发明的混合凝胶及γ射线照射混合凝胶显示出与生体组织的血管同等或其以上的强度、弹性、伸展性,暗示着能够足以作为人的血管来使用的可能性。
而且,通过增加化学修饰水溶性弹性蛋白的添加量,从而还制作出使疏水度比氨基酸更大的肽(例如,F-F、F-F-F)的烷基酯进行偶联的化学修饰水溶性弹性蛋白,在制作与胶原的混合凝胶时,也暗示着得到更大的强度的人工血管用材料的可能。
[TEM观察]
在栅极(grid)制作中,经2%胶棉处理后的栅极使用Super High CleanVacuum Coater SVC-700Turbo (Sanyu电子(株)制造),以约的厚度蒸镀碳,在使试样吸附之前使用Quick Coater SC-701(Sanyu电子(株)制造),进行使苄基胺薄薄地散布成碳膜状的处理。有关试样,用剃刀薄薄地切割冷冻干燥后的凝胶,将该切片直接放置在所制作的栅极上,利用TEM以倍率×6400进行观察。
其结果为,Col的分子量为30万左右,进行凝胶化时形成具有三维网状结构的Col纤维。而且,在该Col纤维之间进入分子量为20万左右的Cm-Ela,并进行自组装,由此与胶原纤维相互缠绕,观察到形成有更坚固的结构的状态。
[人工血管的制作]
在直径为8mm的管内注入在低温下使用PBS(pH7.4)而制备的Cm(G)-Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml),接着,通过插入直径为5mm的中棒,在直径8mm和直径5mm之间使混合溶液形成为管状。然后,将混合溶液在37℃下静置约1小时,使其凝胶化,再在37℃下干燥后,加入PBS,静置48小时,使其溶胀,拔出中棒,制作人工血管(图11)。
[对化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的放射线的照射]
在37℃下使Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)、Cm(G)-Ela·Col混合溶液(混合比为1.5mg/ml∶1.5mg/ml)凝胶化1小时,冷冻干燥,添加PBS 2ml,溶胀48小时。然后,在照射量15kGy及30kGy、照射温度40~50℃下进行γ射线照射。而且,得到经放射线照射的本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶。
[经放射线照射的本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的拉伸试验]
将上述得到的放射线照射混合凝胶按照起始长度为5mm的方式固定在丝杆式材料试验机(Autograph AG-S-J,(株)岛津制作所制造)上。测定凝胶的厚度和宽度,求出截面积。对以0.05mm/s的位移速度伸展混合凝胶时的应力和应变的关系进行测定,此外,对只伸长2.5mm(应变50%)时的应力和应变的关系进行测定。再以位移速度0.05mm/s将各凝胶拉伸至断裂,测定断裂应力,对拉伸至断裂时的应力和应变的关系进行了测定。
为了进行未照射和γ射线照射时的比较,Ela·Col混合凝胶和γ射线照射Ela·Col混合凝胶的应力-应变曲线如图12所示。γ射线照射Ela·Col混合凝胶显示出比非照射Ela·Col混合凝胶大的断裂强度。Cm(G)-Ela·Col混合凝胶和γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的应力-应变曲线如图13所示。γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的断裂强度比非照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶大,此外,比γ射线照射Ela·Col混合凝胶(参照图12)大。
Ela·Col混合凝胶、γ射线照射Ela·Col混合凝胶、Cm(G)-Ela·Col混合凝胶、γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶、猪大动脉的应力-应变曲线如图14所示,到应变50%为止的应力-应变曲线如图15所示。
由图12可知,相对于Ela·Col混合凝胶,γ射线照射Ela·Col混合凝胶的最大应力为约1.5倍,最大应变为约0.5倍(图12)。此外,相对于Cm(G)-Ela·Col混合凝胶,γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的最大应力很高,超出了测定仪器的极限值(图13)。其原因认为是,通过γ射线照射使混合凝胶发生交联。此外,无论照射γ射线与否,Cm(G)-Ela·Col混合凝胶的最大应力均比Ela·Col混合凝胶高,因此认为Ela的自组装能力有助于混合凝胶的强度。在实际上对各混合凝胶和猪大动脉的应力-应变曲线进行比较时,γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶比猪大动脉强度大(图14及图15)。
在γ射线照射Ela·Col混合凝胶中,出现最大应变变小的结果,但强度变大,因此即使在γ射线照射Ela·Col凝胶的应变下也足以作为原材料。此外,在γ射线照射Cm(G)-Ela·Col混合凝胶中,由于达到了测定仪器的极限值,因此强度增加到无法测定最大应力和最大应变的程度。由此暗示着:γ射线照射是用于制作人工血管用原材料的有用的手段,γ射线照射混合凝胶能够用作人工血管用原材料。
产业上的可利用性
本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶可以作为人工血管来代替人血管来使用,能够用于动脉硬化、动脉瘤等循环器官疾病的治疗中。此外,也可以应用于人工韧带、人工肌腱、人工皮肤、人工肺胞、人工子宮等中。进而,也可以应用在为了防皱等而埋入皮肤的美容整形中。
此外,本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶作为在该混合凝胶播种上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、软骨细胞等并增殖的人工组织也是有用的。
进而,本发明的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶作为在该混合凝胶中添加了上皮生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮细胞增殖因子、转化生长因子、血小板源性生长因子等生长因子(增殖因子)、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、肝素、透明质酸等糖胺聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白、生腱蛋白、血小板反应素、巢蛋白、骨桥蛋白、血管性血友病因子、血纤蛋白原等细胞黏附性蛋白质的人工组织也是有用的。
Claims (14)
1.一种化学修饰水溶性弹性蛋白,其通过使分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联而得到。
2.一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,其通过将化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原混合而得到,所述化学修饰水溶性弹性蛋白通过使分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化并且使该分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的烷基酯的氨基进行偶联而得到。
3.根据权利要求2所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,其中,化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原的重量比、即化学修饰水溶性弹性蛋白/胶原为1/200~200/1。
4.根据权利要求2或3所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,其通过将化学修饰水溶性弹性蛋白与相对于该化学修饰水溶性弹性蛋白的重量比为95~105重量%以内的胶原混合而得到。
5.根据权利要求2~4中任一项所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶,其特征在于,对将化学修饰水溶性弹性蛋白和胶原混合而得到的混合凝胶照射放射线。
6.一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括如下工序,即,(1)使分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化的工序;(2)使该分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联的工序;以及,(3)将经由所述(1)和(2)的工序得到的化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序。
7.根据权利要求6所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其中,化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原的重量比、即化学修饰水溶性弹性蛋白/胶原为1/200~200/1。
8.根据权利要求6或7所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括将化学修饰水溶性弹性蛋白和相对于该化学修饰水溶性弹性蛋白的重量比为95~105重量%以内的胶原混合的工序。
9.一种化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括如下工序,即,(1)使分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的伯胺及仲胺的一部分或全部进行N-酰化的工序;(2)使该分子量1万以上的水溶性弹性蛋白的分子中含有的羧基的一部分或全部与氨基酸的低级烷基酯的氨基进行偶联的工序;以及,(3)将经由所述(1)和(2)的工序得到的化学修饰水溶性弹性蛋白与胶原以溶液状态混合而制备混合凝胶的工序;以及,(4)对所述(3)中得到的混合凝胶照射放射线的工序。
10.根据权利要求9所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括将化学修饰水溶性弹性蛋白与相对于该化学修饰水溶性弹性蛋白的重量比为95~105重量%以内的胶原混合并照射放射线的工序。
11.根据权利要求9所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的制造方法,其包括混合比胶原少量或多量的化学修饰水溶性弹性蛋白并照射放射线的工序。
12.权利要求1所述的化学修饰水溶性弹性蛋白的用于制造医疗用材料的用途。
13.权利要求2~5中任一项所述的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶或者通过权利要求6~11中任一项所述的制造方法制造的化学修饰水溶性弹性蛋白-胶原混合凝胶的用于制造医疗用材料的用途。
14.根据权利要求13所述的用途,其中,医疗用材料为人工血管材料。
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