JPH0435185B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、コラーゲンチユーブ、特に小さい直
径のコラーゲンチユーブの製造方法およびこの方
法によつて得られたコラーゲンチユーブの血管補
綴材および神経縫合材としての使用に関する。 生体中の蛋白質の約40％を構成しているコラー
ゲンは結合組織の支持物質であり、この組織がそ
の機能を果すのに必要なものである。 コラーゲンは、顕著な機械的性質と良好な止血
性とを有しかつ細胞の生長に影響を与えるもので
ある。 これらの性質の外に、２種の興味あるコラーゲ
ンの特性、すなわち生物学的適合性
（biocompati−vility）と生物学的分解性とを有
する。 約3000Åの長さと約15Åの巾を有するコラーゲ
ンの巨大分子は、３種のペプチド分子鎖により構
成されている。各々の分子鎖は100000ダルトン
（dalton）の質量を有しかつラセン形である。ラ
センの軸は、巨大分子の内側を通つて共通軸の周
囲をラセン状に延びている。ある種のペプチド分
子鎖間には、網状結合すなわち架橋結合が存在し
ている。これらのペプチド分子鎖間における巨大
分子の規則的配列によつて繊維が形成されてい
る。 コラーゲンの優れた機械的性質は、大部分、ラ
セン構造と網状結合とによつて付与されている。 コラーゲンの抗原特性も非常に低い。従つて、
動物から得たコラーゲンは、人間の生体内に用い
ても拒絶反応を生じない。このことは、タケダ、
Ｕ、等による研究やジヤーナル・オブ・トキシコ
ロジー・サイエンセス（Journal of Toxicology
Sciences）、Vol.7、Suppl ．pp63〜91（1982）
に記載されている。 コラーゲンは、これを血管補綴材として使用す
ることを容易にしている２種の重要な利点、すな
わち、一方では生物学的適合性を有するという利
点と、他方では細胞生長に対してある種の作用を
する能力を有するという利点とを有する。逆に、
このような用途においては、２種の欠点、すなわ
ち、生物学的分解性と止血性とを有する。この後
者の性質（止血性）は血栓症を生じる恐れがある
ので特に問題であり、また蛋白質のラセン構造の
破壊により補綴性が消滅しその結果機械的性質が
劣化するという問題もある。最後に、コラーゲン
の生物学的分解性は、それが酵素によつて消化さ
れる前に、細胞によつて再生できる程度に十分に
低いものなければならない。 合成血管補綴材はその直径が４mmより大である
場合には、実際には満足し得るものではないこと
が知られている。この寸法以上では、代用血管が
重大な欠点を有し、特にその有効性の水準が低
い。このことが、血管補綴材の分野においてある
種の補助的役割を行い得るコラーゲンをベースと
する生物学的材料を用いることによつて上記の要
求を満足させる方法を見い出すことが明らかに重
要であることの理由である。 従来、ヘテログラフト樹脂（resinous hetero
−grafts）を使用することが有利であるとされ、
幾つかの興味ある結果が得られている。 残念ながら、この方法は非常に高価であり従つ
て血管へ利用する数は非常に限られている。この
ような理由から、コラーゲンをベースとする直径
の小さいチユーブを製造することが必要とされて
いる。 ルーマニア特許第76922号明細書には、コラー
ゲンゲルからチユーブ状部材を得る方法と装置と
が記載されている；この方法では、コラーゲンを
溶液にし、EDTAを加えた蒸留水を用いて透析
処理しついで電着技術によりコラーゲンを含有す
るチユーブ状部材を形成している、このような方
法は実施が困難であるということの外に、上記特
許明細書には、上記の方法で得られるチユーブの
最小直径がどのような大きさであるかについて何
ら示していないことに注目すべきである。 Chigner，E.，Huc，A.およびEloy，R.が、
1982年５月開催の欧州外科およびストレス研究協
会（European Society of Surgical and Stress
Research）第18回大会で行つた講演においては、
コラーゲンの生物学的適合性が特に問題とされ、
そしてこの材料を血管補綴材の製造に使用できる
可能性が次の試験方法によつて検討された。 以下に記述するチユーブを形成しているコラー
ゲンに非常に近似するコラーゲンにより構成した
試料を予め孔があけられているラツトの大動脈に
縫合した。この試験の結果から、上記材料は良好
な生物学的適合性を示し、コラーゲンと接触した
際に血液の凝固がなく、かつ最終的に、血圧に十
分に耐える機械的性質を示すことが認められた。 本発明の目的は、コラーゲンから血管補綴材の
分野で使用し得る４mm未満の直径を有する、かつ
十分に低い生物学的分解性並びに満足できる安定
性を有するコラーゲンチユーブを製造する方法を
提供することである。 上記本発明の目的は、以下の工程、すなわち、
凝固浴の１部を受容するための、中央に同心円管
を有する円筒状の押出ノズル（spinneret）を用
いて、約1.5％の天然コラーゲンを含有する水性
酸性ゲルを押出し；次いで、約70％のアセトンと
30％のアンモニアから構成された凝固浴中で、押
出ノズルから押出されたチユーブの内壁および外
壁を凝固させ；次いでコラーゲンチユーブを乾燥
させ；そして最後に、場合により網状化する工程
からなる本発明の方法によつて達成される。 押出ノズルから押出されるチユーブは凝固浴中
に約２時間保持することが有利である。 本発明の一実施態様においてはチユーブの乾燥
を大気中で行い、また別の実施態様においてはチ
ユーブの乾燥を凍結乾燥によつて行う。 コラーゲンの網状化は、真空下（約0.1mmHgの
圧力）、約80℃で約24時間炉中での脱水により行
うのが有利である。 好ましい実施態様においては、一旦網状化した
コラーゲンチユーブについて、外部分子
（externalmolecule）とコラーゲンとのカツプリ
ング（結合）を生ぜしめることなしにコラーゲン
分子中にアジド基を導入し得る処理を行う。 コラーゲン分子中へのアジド基の導入は、 (a) コラーゲンの遊離の酸性基をメチル化して対
応するメチルエステル基を形成する工程； (b) 上記メチルエステル基のメチル基をヒドラジ
ンとの反応によつてヒドラジド基に転化する工
程；および (c) ヒドラジド基を亜硝酸の作用によつてアジド
基に転化する工程を行うことにより行い得る。 上記工程(a)におけるコラーゲンとメチルアルコ
ールとの接触時間は、コラーゲンに与えるべき生
物学的分解性に応じて調節する。 実際に、昇温示差熱量分析（programmed
diffe−rential calorimetry）の結果から、コラ
ーゲンの変性（denaturation）が開始する温度は
34℃程度であると云い得るが、このことはコラー
ゲンの変性は生体の温度よりも低い温度で生じる
ことを意味している。このような変性により移植
したコラーゲンの損失と何らかの機械的性質の損
失とを生ずる（Huc，Ａ Labo pharm.，275，
307〜312（1978）参照）。 前述したごときコラーゲン分子中へのアジド基
の導入によつて、一般に、生物学的に有害な物
質、特に細胞の生長に有害な物質を含んでいるこ
との多い外部分子をコラーゲンに結合させること
なしに、コラーゲンの変性温度を高めることがで
きる。前記の方法により変性が開始する温度を約
10℃まで高めることができる。このような温度は
人の体温である37℃よりはるかに高いものであ
る。 しかしながら、移植されたコラーゲンチユーブ
が著しい機械的拘束を受けなければならない場
合、あるいは、この生物学的材料（すなわちコラ
ーゲンチユーブ）に低い生物学的分解性しか要求
されない場合にはこの蛋白質の化学的な意味での
安定性は必要でないことに留意すべきである。 一般的には、コラーゲン分子中にアジド基を導
入する方法はヘテログラフトにも同様に適用する
ことができ、この場合にはアジド基はコラーゲン
チユーブ中で果す役割と同じ役割を果し、そし
て、特に噴門弁の場合にしばしば石灰化の原因と
なるグルタルアルデヒドの使用を回避することを
可能にする。 次に添附図面を参照して、本発明および本発明
の利点を更に詳細に説明する。 第１〜４図において、部材２は内部同心導管３
により（ポンプによつて循環されている）凝固液
の一部が供給されている押出ノズルの本体を示し
ている。コラーゲンゲルは４で示されており、ま
た、凝固浴は５で示されている。部材６は、凝固
浴を含有しているタンクであり、部材７は雌型円
筒状支持体であり、８は得られたチユーブであ
る。 本発明のコラーゲンチユーブの製造方法は、本
質的に以下の三つの工程、すなわち、コラーゲン
ゲルの調製；チユーブの押出と凝固；およびその
生体中での挙動を改良するためのチユーブの処理
からなる。以下においてこれらの工程を詳細に説
明する。 コラーゲンゲルの調製 屠殺した直後の子牛から得た皮膚を水で洗浄す
る。毛および皮下組織をスプリツト装置を用いて
機械的に除去し、皮膚のみを残留させる。次にこ
の皮膚を切断および粉砕する。次に粉砕物をリン
酸塩を含有する、PH7.8の緩衝液で洗浄し、次い
で脱イオン水ですすぐ。次にこの粉砕物をPH3.5
の酢酸溶液中に装入する。コラーゲンの濃度が通
常約1.5％になるように希釈することが好ましい。
次にこの混合物を超音波で均質化し、真空下で撹
拌して脱気する。 コラーゲンチユーブの形成 上記方法で得られたコラーゲンゲル４を円筒状
押出ノズル２を用いて押出す。この押出ノズルの
独創性はコラーゲンゲルが流入する導管と同心的
な内部導管３を有していることである。導管３は
液状凝固剤５をコラーゲンゲルの内側に導入する
作用をし、その結果、導管の直径よりも小さい直
径を有するチユーブ状のコラーゲンが得られる。
スクリユー色エンドレスの進装置によつて一定速
度で押出ノズルを移動させる；ノズルの移動速度
は、上記の凝固浴に対して調節することができ
る。凝固したチユーブ８は、凝固タンク６中に配
置されたかつチユーブと同一直径の雌型円筒状支
持体７上で析出する。この支持体によりチユーブ
が凝固浴中破砕することが防止される。 第２図に示す通り、押出ノズルのヘツドの直径
は、２mmあるいは１mmの直径でチユーブを押出す
ことを希望する場合には減少させる。 かく形成されたチユーブは凝固浴中に約２時間
静かに保持される。この時間の最後に、チユーブ
を再び水で満し且つ同一直径のポリテトラフルオ
ロエチレン（P.T.F.E.）のロツド（図示なし）上
に置き、空気中で乾燥する。乾燥後、チユーブは
支持体から容易に取出すことができる。 凝固したチユーブは、凍結乾燥によつても乾燥
することができる。この場合には、得られる乾燥
チユーブはスポンジ構造を有し、その壁は、空気
中での乾燥によつて得られるチユーブの壁よりも
一層厚くなる。 得られたチユーブ材料は三つの方法、すなわち
化学分析、分子質量分析および構造分析で分析し
た。第１の分析はコラーゲンがどの程度純粋であ
るかを調べるために行なつた。第２の分析はペプ
チド分子鎖の強度を測定するために行いそして第
３の分析は蛋白質のラセン構造が破壊されていな
いことを確認するために行つた。これらの分析は
いずれも蛋白質がコラーゲンのすべての性質を保
有していることを確認するために必要である
（Huc A.およびBartholin F.レビユー・オブ・
ザ・パスツール・インスチチユート・オブ・リオ
ン（Review of the pasteur Institute of
Lyon）．Vol.11，No.２、pp179〜190、1978参照）。 チユーブの処理 (a) コラーゲンの網状化（架橋） 蛋白質の耐久性を強化するために、コラーゲ
ンチユーブを加熱炉中で真空下（0.1mmHg）、
80℃で24時間脱水する。このような処理によつ
てコラーゲンのペプチド分子鎖間に新しい網状
結合が生じ、それによつてその不溶性が高まり
かつその生物学的分解性が減少する。 (b) コラーゲン分子中にアジドを導入することに
よるコラーゲンの安定性の改良 本発明者はフランス特許第2235133号明細書
に記載の方法に従つて、コラーゲン分子に外部
物質を結合させることなしに分子中にアジド基
を導入することが可能な処理によつてコラーゲ
ンチユーブの安定性を改良することが実際上不
可能であるか否かを検討した。 チユーブ材料を８日間酸性メタノール溶液
（純粋なメタノールと0.3NHC）中に浸漬す
る。その結果、コラーゲンの酸性の遊離カルボ
キシル基を下記式に従つてメチル化する。 コラーゲン−COOH＋CH₃OH0.3NHCl ――――――→ コラーゲン−COOCH₃＋H₂O 酸性基はアスパラギン酸またはグルタミン酸
の酸性基である。 次にチユーブ材料を十分に水で洗浄し次ぎに
ヒドラジンの１％水溶液中に浸漬する。かくし
てメチル基を下記の式に従つてヒドラジド基に
転化する： コラーゲン−CO−OCH₃＋H₂N−NH₂→コラーゲン−CO−
NH−NH₂ 転化された基の数を最大にするためには、４
〜５時間の処理時間が必要である。次にチユー
ブ材料を水と十分に混合し、0.3NHCl中の亜
硝酸ナトリウム溶液で処理する。このようにし
て、下記反応に従つてアジド置換コラーゲンが
得られる。 コラーゲン−CO−NH−NH₂＋NaNO₂＋HCl→コラーゲン
−CO−N₃ この反応に要する総時間は約５分である。次
にチユーブ材料をPH９のホウ酸塩緩衝液（ホウ
酸、テトラホウ酸ナトリウム0.2M）中に約２
時間浸漬し次いで水と充分に混合する。 上記方法のすべての工程は周囲温度（20℃）
で行う。 最終的に得られた材料について試験を行つた
ところ、コラーゲンチユーブはヒドラジンも亜
硝酸ソーダもあるいは他の外部からの物質も含
有していないことが判つた。 昇温示差熱量分析の結果からコラーゲンの変
性温度は、上記＝の処理を行つたコラーゲンに
おいては未処理コラーゲンおよび単なる網状化
処理を行つたコラーゲンの変性温度よりも約10
℃高いことが認められた。従つてかかる活性コ
ラーゲン（actiue collagen）は再構性
（reconstituted）コラーゲンより安定である。
上記のごとくして調製したコラーゲンの変性温
度は37℃、すなわち正常な体温を超えている。
かくして、本発明に従つて処理したコラーゲン
はその性質特に機械的な性質に関して必要であ
る本来の構造の全てを保持している。更に、本
発明により処理したコラーゲンは、蛋白質分解
酵素の攻撃に対し、より一層耐久性がある。 このようにして処理したコラーゲンからなる
フイルムを、ラツトの腹腔内および皮下部の両
方に移植した。生体内でのその挙動と、本発明
の方法で処理していない原料コラーゲンからな
るフイルムを同一の場所に移植した場合の挙動
とを比較した。 検査の結果は次の通りであつた。すなわち、
21日後に原料コラーゲンからのフイルムは消滅
したのに対し、本発明のフイルムは90日後でも
常に確認することができた。 上記の２種の移植フイルム上には上皮細胞
（mesotherial cells）は存在しているが、その
出現は本発明の活性コラーゲンフイルム上では
遅延しそして細胞はそこでは十分には生長しな
い。最後に、生物学的分解性（これは多かれ少
なかれ重要な性質であるが）はアジド置換基を
導入するための処理の最初の工程におけるメチ
ルアルコールとコラーゲンとの接触時間を修正
することによつて調製することができる。接触
時間が短かいときはブロツクされた酸基の数が
減少し、その結果コラーゲンの保護の程度が減
少する。しかして、後者の場合には、コラーゲ
ン材料の生物学的分解性は、完全にアジドを形
成する処理を行う場合よりも一層顕著になる。 (c) 殺菌 コラーゲンチユーブを２，5Mradの放射線
で処理する。各々の放射線照射によつての微生
物が除去され、コラーゲンが網状化しそしてそ
の止血性が減少する。 以上の如き本発明によれば、血管補綴材の形
成に適した、かつ１〜10mmの内径を有する単純
なチユーブを得ることができる。 このようにして得られたチユーブの物理的、化
学的および機械的な分析結果は次の通りである。 化学分析 105℃における乾燥残分 86.3 灰 分 0.61 酸度（酢酸に基づく） 0.33 窒 素 14.6 総蛋白質 79.7 ヒドロキシプロリン 9.88 コラーゲン 73.7 上記の量は原料製品のグラム数あたりのグラム
である。 物理的分析 Ｘ線回析 ラセン構造を示すことが証明された。 昇温示差熱量分析変性前の温度 34.3℃ 変性終点の温度 49.7℃ ラセン構造の割合が87％である コラーゲンのmgあたりのΔH（ジユール）
4.2×10^-2 機械的テスト 破断歪（Kgｆ／cm²）＝ 0.608（変動係数20％） 破断伸度（％）＝ 13（変動係数55％） 弾性モジユラス（Kgｆ／cm²）＝
11.422（変動係数12％） 破断歪（Kgｆ／cm²）の高い値は価値があるもので
はない。 本発明の方法、すなわち上述の新規な安定化方
法で処理したコラーゲンチユーブの昇温示差熱量
分析の結果は次の通りである。 変性の開始温度 47℃ 変性の終了温度 67℃ 本発明の方法で処理しなかつたコラーゲンチユ
ーブに関しては、最初の数字（変性の開始温度）
において13℃の温度差があり、且つ第２の数字
（変性の終了温度）において８℃の温度差がある。 補綴材が大きな機械的拘束（mechanical
constraints）を受ける場合には、単一の管壁を
有するチユーブでは十分な機械的性質を得ること
ができない場合がある。このような場合には、本
発明のコラーゲン補綴材を２枚の同中心的コラー
ゲンチユーブを互にTissucolタイプの生物学的接
着剤により結合させるか、あるいは、例えばポリ
エステルのような合成糸を２個のコラーゲンチユ
ーブ間に配置することによつて構成することがで
きる。 人間の伏在静脈、合成補綴材（ゴアーテツク
ス）、コラーゲンチユーブおよび２枚のコラーゲ
ンチユーブをポリエステル糸で強化したコラーゲ
ンチユーブについての各々のコンプライアンス値
を下記の表に示した。 これらの結果は、パリ大学におけるラボラトリ
ー・オブ・バイオレオロジー・アンド・ハイドロ
グイナミツク・フイジオロジー（Laboratory of
Biorheology and Hydrodynamic Physiology）
（H.Flaud）から得たものである。

【表】

【表】 上記の結果は、単一のコラーゲンチユーブは、
人間の伏在静脈よりも高いコンプライアンスを有
し、また合成糸で補強したコラーゲン補綴材のコ
ンプライアンスはゴアーテツクス補綴材よりも一
層高められていることを示している。 小さな直径のチユーブは、神経縫合材の形成に
も部分的に使用することができる。この分野で行
つた実験では、この生物学的材料は良好な結果を
もつて神経を接合することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２mmより大な直径を有するコラーゲ
ンチユーブを調製するために、本発明に従つて押
出用に設計した押出ノズルの図解的断面図であ
り、第２図は、本発明を実施するための別の装置
であつて、その押出ノズルが、２mmより小さい内
径を有するコラーゲンチユーブの押出に特に適し
た装置の図解的断面図であり、第３図は、コラー
ゲンチユーブを凝固させるために使用する装置の
図解的断面図であり、第４図は、第３図の線〜
に沿つて採つた断面図である。 ２……押出ノズル本体、３……内側の同中心的
導管、４……コラーゲンゲル、５……凝固浴、６
……タンク、７……雌型の円筒状支持体、８……
チユーブ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ (a) 天然コラーゲンを含有している水性酸性
   ゲルを押出してコラーゲンチユーブを形成する
   工程； (b) 上記工程(a)で形成したコラーゲンチユーブの
   内壁および外壁を、アセトンとアンモニアから
   構成した凝固浴中で凝固させる工程；および (c) 上記コラーゲンチユーブを乾燥する工程； からなることを特徴とする、血管補綴材または神
   経縫合材として使用するためのコラーゲンチユー
   ブの製造方法。 ２ コラーゲンチユーブの直径が、２mm未満であ
   る、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３ 工程(a)における押出操作を、工程(b)における
   凝固浴の１部を受容するように設計された中央同
   心導管を備えた円筒状押出ノズル中で行う、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ４ 押出ノズルから押出したコラーゲンチユーブ
   を、コラーゲンチユーブの直径と同一直径の雌型
   円筒状支持体上に析出させ、ついで凝固浴中に約
   ２時間保持する、特許請求の範囲第３項に記載の
   方法。 ５ 工程(c)の乾燥操作を、大気中で行う、特許請
   求の範囲第１項に記載の方法。 ６ 工程(c)の乾燥を凍結乾燥によつて行う、特許
   請求の範囲第１項に記載の方法。 ７ 放出端部を有する円筒形チユーブ状押出ノズ
   ル； 上記押出ノズル内に設けられたかつその端部が
   上記押出ノズルの放出端部の上流側まで達してお
   りしかもその全周囲にクリアランスを有する凝固
   管であつて、水性酸性コラーゲンゲルからなるチ
   ユーブを上記管の周囲のクリアランスを通して押
   出し、かつ上記酸性コラーゲンのチユーブが上記
   押出ノズルの放出端部に達する前に、その内壁を
   上記の凝固管から放出される凝固溶液と接触せし
   めるための凝固管； 前記の放出端部が到達している凝固溶液浴；お
   よび 前記放出端部から上記凝固浴中に押出されるチ
   ユーブと同一の直径を有するかつこのチユーブを
   受容するための円筒状床； からなるコラーゲンチユーブの製造装置。