CN106552283B - 一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，涉及一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂及其制备方法。本发明通过肝素修饰氰乙酸并进一步与甲醛反应制备出具有可负载和缓释生长因子的肝素化氰基丙烯酰胺单体，然后肝素化氰基丙烯酰胺单体在甲醇作用下预聚合并进行生长因子负载，最后将负载生长因子的预聚合产物和肝素化氰基丙烯酰胺单体混合，得到可缓释生长因子的骨修复粘合剂。本发明提供的可缓释生长因子的骨修复粘合剂具有负载和缓慢释放生长因子的功能，在骨和软骨粘合、骨组织修复等应用过程中可以快速粘合并促进骨组织修复；同时，其还具有粘结力强、化学性能稳定和生物相容性好等特点。

Description

一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂及其制备方法。
背景技术
临床上治疗骨折的方法有外固定和手术治疗两种，其中，外固定属于间接固定，存在把持力有限或固定物沉重等缺点，且固定较长时间后还容易引起肢体肌肉萎缩、骨质疏松等问题；手术治疗主要是通过螺钉、钢针、钢丝、丝线等对骨折块进行固定。对于粉碎性骨折，外固定很难在治疗过程中对骨骼进行正确固定，一般需要进行手术治疗，但是手术治疗过程中，对于小的碎骨片也很难用螺钉、钢针等进行固定，去除过多有可能导致骨缺损，尤其是近关节的粉碎骨折，如果仅保持骨折的力线位置让其自行愈合，有可能造成肢体功能障碍后遗症。
骨缺损是目前临床常见病症之一，导致骨缺损的原因主要有创伤、感染、肿瘤、骨髓炎手术清创以及各种先天性疾病等，临床上骨缺损的修复方法主要有骨移植和组织工程技术。
α-氰基丙烯酸类衍生物粘合剂是一类瞬间粘合剂，具有室温下快速固化、无需固化剂、粘结力强、化学性能稳定、不降解出有害物质和生物相容性好等特点，在外科手术中得到了广泛的应用，主要用于各种创伤伤口、外科整容、计划生育等外科各类手术，具有闭合伤口、皮肤移植、官腔器官连接以及肾、肝、脾等脏器损伤的止血等作用。α-氰基丙烯酸类衍生物粘合剂是常用的医用骨粘合剂之一，在骨科手术中可用于骨骼、关节的结合与定位。
中国专利申请CN 101961506A公开了一种具成骨诱导活性复合型纳米生物骨胶，其含有下列组分：α-氰基丙烯酸、纳米级的硫酸钙和具有骨诱导活性的生长因子，其中，纳米级的硫酸钙的加入极大地提高了纳米生物骨胶的粘合强度，而在具有骨诱导活性的生长因子的加入使该纳米生物骨胶具有较高的成骨诱导活性。
研究发现，许多生长因子对骨组织的发生、损伤及修复具有重要作用，骨断端局部多种骨生长因子缺乏或活性不足以及局部血循环不良时形成骨不连的重要原因，因此，局部应用外源性生长因子可促进骨愈合。但生长因子在有水存在及室温环境下很容易失去生物活性，因此在体内直接使用时会很快失活，达不到所期望的生物效应。如何在体内环境下保持并尽可能延长生长因子的生物活性是使生长因子能真正在临床发挥作用的关键。
目前，现有技术中仍缺少一种具有负载和缓释生长因子性能、可室温下快速固化、粘结力强、生物相容性好的骨修复粘合剂。
发明内容
为了克服现有技术中的不足，本发明提供一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂，该可缓释生长因子的骨修复粘合剂具有负载和缓慢释放生长因子的功能，在骨和软骨粘合、骨组织修复等应用过程中可以快速粘合并促进骨组织修复；同时，其还具有粘结力强、化学性能稳定和生物相容性好等特点。
相应地，本发明还提供上述可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，该制备方法重复性好，操作性强。
一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)肝素的己二酰肼化修饰
制备肝素水溶液，加入己二酰肼，搅拌至完全溶解后调节pH为6.0-6.5，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应3-6h，再调节pH为7.1-7.4，常温下进行酰胺化反应4-24h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析，冷冻干燥，得到己二酰肼化肝素；
(2)肝素化氰基乙酰胺单体的合成
将氰乙酸溶解于pH为6.8-7.4的磷酸盐缓冲液，制得氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液，往氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应，加入步骤(1)制得的己二酰肼化肝素，搅拌条件下进行酰胺化反应；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析，真空干燥，得到肝素化氰基乙酰胺单体；
(3)肝素化氰基丙烯酰胺单体的合成
将固体甲醛溶解于甲醇制备甲醛的甲醇溶液，加热搅拌至固体甲醛全部溶解后停止加热，加入哌啶和步骤(2)制得的肝素化氰基乙酰胺单体，加热回流，进行缩聚反应；反应结束后，在反应混合物中加入石油醚，搅拌，用分水器除去水层，然后蒸馏除去石油醚；加入五氧化二磷，加热搅拌使缩聚物发生裂解反应，反应2.5-3.5h后在通入二氧化硫气态阻聚剂的条件下进行蒸馏，收集肝素化氰基丙烯酰胺单体；
(4)负载生长因子的预聚合产物的制备：
将步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体和生长因子溶解于甲醇中，搅拌条件下进行预聚合反应和生长因子负载，反应1-2h后，真空干燥，得到负载生长因子的预聚合产物；
(5)可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备：
取步骤(4)制得的负载生长因子的预聚合产物与步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体搅拌混合，成为完全溶解的透明液体，通入二氧化硫气体，制得可缓释生长因子的骨修复粘合剂。
优选的，所述步骤(1)中，肝素的重均分子量为5000-20000g/mol，肝素水溶液的浓度为2.5×10-3-2.5×10-2mol/L。
优选的，所述步骤(1)中，肝素和己二酰肼的摩尔比为(1:128)-(1:320)；肝素和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(1:128)-(1:160)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(1:1)-(10:1)。
优选的，所述步骤(2)中，氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.1-0.5mol/L；氰乙酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(1:3)-(1:30)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(1:1)-(10:1)；羧基活化反应的时间为0.5-6h。
优选的，所述步骤(2)中，氰乙酸和己二酰肼化肝素的摩尔比为1:1；酰胺化反应的时间为4-24h。
优选的，所述步骤(3)中，甲醛的甲醇溶液的浓度为0.03-0.12mol/L；哌啶和甲醇的体积比为(0.001:1)-(0.005:1)；固体甲醛和肝素化氰基丙烯酰胺单体的摩尔比为1:1；石油醚和甲醇的体积比为1:1；五氧化二磷和肝素化氰基丙烯酰胺单体的质量比为(1:1)-(3:1)。
优选的，所述步骤(4)中，生长因子包括骨形态发生蛋白-2(BMP-2)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、转化生长因子-β(TGF-β)中的一种或多种。
优选的，所述步骤(4)中，生长因子在甲醇中的浓度为0.01-0.1μg/mL；肝素化氰基丙烯酰胺单体在甲醇中的浓度为0.1-0.5g/mL。
优选的，所述步骤(5)中，负载生长因子的预聚合产物和肝素化氰基丙烯酰胺单体的质量比为(1:2)-(1:9)；以负载生长因子的预聚合产物的重量计，二氧化硫气体的浓度为10-100ppm。
一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂，通过上述制备方法制备得到。
本发明通过在医用粘结剂分子中引入可与生长因子相结合的功能基团，使粘合剂具有负载和缓释生长因子的功能。
肝素是一种天然的高含硫粘多糖，分子链含有糖胺多糖(GAG)结构，可以与许多碱性生长因子如BMP-2、IGF-2、TGF-β等进行静电相互作用，这是一种可逆的次级联合作用，不会改变生长因子的构象而致使其变性，可用于对生长因子的控制释放。
本发明通过肝素修饰氰乙酸并进一步与甲醛反应制备出具有可负载和缓释生长因子的肝素化氰基丙烯酰胺单体，然后肝素化氰基丙烯酰胺单体在甲醇作用下预聚合并进行生长因子负载，最后将负载生长因子的预聚合产物和肝素化氰基丙烯酰胺单体混合，得到可缓释生长因子的骨修复粘合剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的可缓释生长因子的骨修复粘合剂具有负载和缓慢释放生长因子的功能，在体内环境下保持并尽可能延长生长因子的生物活性，增加生长因子的生物生物学效用，减少生长因子的给药剂量，降低成本；
(2)本发明提供的可缓释生长因子的骨修复粘合剂具有室温下快速固化、粘结力强、化学性能稳定和生物相容性好等特点，在骨和软骨粘合以及骨组织修复过程中可以快速粘合并促进骨组织修复。
(3)本发明提供的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法成本低，重复性好，操作性强，易于工业化生产。
附图说明
图1本发明可缓释生长因子的骨修复粘合剂的合成示意图。
图2本发明实施例1制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体的核磁共振氢谱图。
图3本发明实施例1制得的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的药物释放曲线图。
图4本发明实施例1制得的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的3T3细胞存活率图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备
(1)肝素的己二酰肼化修饰
取10g重均分子量为10000g/mol的肝素溶解在100mL去离子水中配成浓度为1×10-2mol/L的肝素水溶液，加入0.32mol己二酰肼，搅拌至完全溶解后用0.1mol/L的盐酸水溶液调节pH为6.3，然后加入0.16mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.032mol N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应3h，再用0.1mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH为7.2，常温下进行酰胺化反应12h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，冷冻干燥48h，得到己二酰肼化肝素；
(2)肝素化氰基乙酰胺单体的合成
将氰乙酸溶解于pH为7.0的磷酸盐缓冲液，配制成100mL浓度为0.25mol/L的氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液，往氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液中加入0.375mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.075mol N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应3h，加入0.025mol步骤(1)制得的己二酰肼化肝素，搅拌条件下进行酰胺化反应12h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，真空干燥48h，得到肝素化氰基乙酰胺单体；
(3)肝素化氰基丙烯酰胺单体的合成
将固体甲醛溶解于甲醇制备100mL浓度为0.06mol/L的甲醛的甲醇溶液，加热搅拌至固体甲醛全部溶解后停止加热，加入0.25mL哌啶和0.006mol步骤(2)制得的肝素化氰基乙酰胺单体，加热回流，进行缩聚反应；反应结束后，在反应混合物中加入100mL石油醚，搅拌，用分水器除去水层，然后蒸馏除去石油醚；加入15.6g五氧化二磷，加热搅拌使缩聚物发生裂解反应，反应3h后在通入二氧化硫气态阻聚剂的条件下进行蒸馏，收集肝素化氰基丙烯酰胺单体；
附图2的核磁氢谱结果显示，制备得到的产物即为肝素化氰基丙烯酰胺单体。
(4)负载生长因子的预聚合产物的制备：
将10g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体和5μg生长因子IGF-2溶解于100mL甲醇中，搅拌条件下进行预聚合反应和IGF-2负载，反应1h后，真空干燥48h，得到负载IGF-2的预聚合产物；
(5)可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备：
取10g步骤(4)制得的负载IGF-2的预聚合产物与40g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体搅拌混合，成为完全溶解的透明液体，以负载IGF-2的预聚合产物的重量计，通入50ppm的二氧化硫气体，制得可缓释IGF-2的骨修复粘合剂。
实施例1制得的可缓释IGF-2的骨修复粘合剂的粘度(25±1℃)为0.1Pa·S；水面固化时间为7s；粘接强度为30MPa；储存稳定性(70±2℃)≥120h；小鼠经口LD50为14.8g/kg；IGF-2持续释放时间≥72h，其药物释放曲线图如附图3所示；附图4 3T3细胞培养结果显示可缓释IGF-2的骨修复粘合剂组3T3细胞细胞存活率与空白对照组相比，无显著差异，说明实施例1制备的可缓释IGF-2的骨修复粘合剂安全、无毒性。
实施例2可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备
(1)肝素的己二酰肼化修饰
取10g重均分子量为20000g/mol的肝素溶解在100mL去离子水中配成浓度为5×10-3mol/L的肝素水溶液，加入0.064mol己二酰肼，搅拌至完全溶解后用0.1mol/L的盐酸水溶液调节pH为6.0，然后加入0.064mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.064mol N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应6h，再用0.1mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH为7.1，常温下进行酰胺化反应4h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，冷冻干燥48h，得到己二酰肼化肝素；
(2)肝素化氰基乙酰胺单体的合成
将氰乙酸溶解于pH为6.8的磷酸盐缓冲液，配制成100mL浓度为0.1mol/L的氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液，往氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液中加入0.03mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.03mol N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应6h，加入0.01mol步骤(1)制得的己二酰肼化肝素，搅拌条件下进行酰胺化反应4h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，真空干燥48h，得到肝素化氰基乙酰胺单体；
(3)肝素化氰基丙烯酰胺单体的合成
将固体甲醛溶解于甲醇制备100mL浓度为0.03mol/L的甲醛的甲醇溶液，加热搅拌至固体甲醛全部溶解后停止加热，加入0.1mL哌啶和0.003mol步骤(2)制得的肝素化氰基乙酰胺单体，加热回流，进行缩聚反应；反应结束后，在反应混合物中加入100mL石油醚，搅拌，用分水器除去水层，然后蒸馏除去石油醚；加入3.9g五氧化二磷，加热搅拌使缩聚物发生裂解反应，反应3h后在通入二氧化硫气态阻聚剂的条件下进行蒸馏，收集肝素化氰基丙烯酰胺单体；
(4)负载生长因子的预聚合产物的制备：
将10g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体和1μg生长因子BMP-2溶解于100mL甲醇中，搅拌条件下进行预聚合反应和BMP-2负载，反应1h后，真空干燥48h，得到负载BMP-2的预聚合产物；
(5)可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备：
取5g步骤(4)制得的负载BMP-2的预聚合产物与45g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体搅拌混合，成为完全溶解的透明液体，以负载BMP-2的预聚合产物的重量计，通入100ppm的二氧化硫气体，制得可缓释BMP-2的骨修复粘合剂。
实施例2制得的可缓释BMP-2的骨修复粘合剂的粘度(25±1℃)为0.05Pa·S；水面固化时间为10s；粘接强度为25MPa；储存稳定性(70±2℃)≥120h；小鼠经口LD50为15g/kg；BMP-2持续释放时间≥72h；3T3细胞培养结果显示可缓释BMP-2的骨修复粘合剂组3T3细胞细胞存活率与空白对照组相比，无显著差异，说明实施例2制备的可缓释BMP-2的骨修复粘合剂安全、无毒性。
实施例3可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备
(1)肝素的己二酰肼化修饰
取10g重均分子量为5000g/mol的肝素溶解在100mL去离子水中配成浓度为2×10- 2mol/L的肝素水溶液，加入0.64mol己二酰肼，搅拌至完全溶解后用0.1mol/L的盐酸水溶液调节pH为6.5，然后加入0.32mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.032molN-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应6h，再用0.1mol/L的氢氧化钠水溶液调节pH为7.4，常温下进行酰胺化反应24h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，冷冻干燥48h，得到己二酰肼化肝素；
(2)肝素化氰基乙酰胺单体的合成
将氰乙酸溶解于pH为7.4的磷酸盐缓冲液，配制成100mL浓度为0.5mol/L的氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液，往氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液中加入1.5mol 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.15mol N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应0.5h，加入0.05mol步骤(1)制得的己二酰肼化肝素，搅拌条件下进行酰胺化反应24h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析7d，真空干燥48h，得到肝素化氰基乙酰胺单体；
(3)肝素化氰基丙烯酰胺单体的合成
将固体甲醛溶解于甲醇制备100mL浓度为0.12mol/L的甲醛的甲醇溶液，加热搅拌至固体甲醛全部溶解后停止加热，加入0.5mL哌啶和0.012mol步骤(2)制得的肝素化氰基乙酰胺单体，加热回流，进行缩聚反应；反应结束后，在反应混合物中加入100mL石油醚，搅拌，用分水器除去水层，然后蒸馏除去石油醚；加入46.8g五氧化二磷，加热搅拌使缩聚物发生裂解反应，反应3h后在通入二氧化硫气态阻聚剂的条件下进行蒸馏，收集肝素化氰基丙烯酰胺单体；
(4)负载生长因子的预聚合产物的制备：
将10g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体和10μg生长因子TGF-β溶解于100mL甲醇中，搅拌条件下进行预聚合反应和TGF-β负载，反应1h后，真空干燥48h，得到负载TGF-β的预聚合产物；
(5)可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备：
取15g步骤(4)制得的负载TGF-β的预聚合产物与35g步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体搅拌混合，成为完全溶解的透明液体，以负载TGF-β的预聚合产物的重量计，通入100ppm的二氧化硫气体，制得可缓释TGF-β的骨修复粘合剂。
实施例3制得的可缓释TGF-β的骨修复粘合剂的粘度(25±1℃)为0.15Pa·S；水面固化时间为5s；粘接强度为35MPa；储存稳定性(70±2℃)≥120h；小鼠经口LD50为15.1g/kg；TGF-β持续释放时间≥72h；3T3细胞培养结果显示可缓释TGF-β的骨修复粘合剂组3T3细胞细胞存活率与空白对照组相比，无显著差异，说明实施例3制备的可缓释TGF-β的骨修复粘合剂安全、无毒性。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)肝素的己二酰肼化修饰
制备肝素水溶液，加入己二酰肼，搅拌至完全溶解后调节pH为6.0-6.5，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应3-6h，再调节pH为7.1-7.4，常温下进行酰胺化反应4-24h；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析，冷冻干燥，得到己二酰肼化肝素；
(2)肝素化氰基乙酰胺单体的合成
将氰乙酸溶解于pH为6.8-7.4的磷酸盐缓冲液，制得氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液，往氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行羧基活化反应，加入步骤(1)制得的己二酰肼化肝素，搅拌条件下进行酰胺化反应；反应结束将反应所得混合溶液用去离子水透析，真空干燥，得到肝素化氰基乙酰胺单体；
(3)肝素化氰基丙烯酰胺单体的合成
将固体甲醛溶解于甲醇制备甲醛的甲醇溶液，加热搅拌至固体甲醛全部溶解后停止加热，加入哌啶和步骤(2)制得的肝素化氰基乙酰胺单体，加热回流，进行缩聚反应；反应结束后，在反应混合物中加入石油醚，搅拌，用分水器除去水层，然后蒸馏除去石油醚；加入五氧化二磷，加热搅拌使缩聚物发生裂解反应，反应2.5-3.5h后在通入二氧化硫气态阻聚剂的条件下进行蒸馏，收集肝素化氰基丙烯酰胺单体；
(4)负载生长因子的预聚合产物的制备：
将步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体和生长因子溶解于甲醇中，搅拌条件下进行预聚合反应和生长因子负载，反应1-2h后，真空干燥，得到负载生长因子的预聚合产物；
(5)可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备：
取步骤(4)制得的负载生长因子的预聚合产物与步骤(3)制得的肝素化氰基丙烯酰胺单体搅拌混合，成为完全溶解的透明液体，通入二氧化硫气体，制得可缓释生长因子的骨修复粘合剂。
2.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，肝素的重均分子量为5000-20000g/mol，肝素水溶液的浓度为5×10-3-2×10-2mol/L。
3.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，肝素和己二酰肼的摩尔比为(1:128)-(1:320)；肝素和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(1:128)-(1:160)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(1:1)-(10:1)。
4.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，氰乙酸的磷酸盐缓冲液溶液的浓度为0.1-0.5mol/L；氰乙酸和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为(1:3)-(1:30)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为(1:1)-(10:1)；羧基活化反应的时间为0.5-6h。
5.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，氰乙酸和己二酰肼化肝素的摩尔比为1:1；酰胺化反应的时间为4-24h。
6.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，甲醛的甲醇溶液的浓度为0.03-0.12mol/L；哌啶和甲醇的体积比为(0.001:1)-(0.005:1)；固体甲醛和肝素化氰基丙烯酰胺单体的摩尔比为1:1；石油醚和甲醇的体积比为1:1；五氧化二磷和肝素化氰基丙烯酰胺单体的质量比为(1:1)-(3:1)。
7.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，生长因子包括骨形态发生蛋白-2、胰岛素样生长因子-2、转化生长因子-β中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，生长因子在甲醇中的浓度为0.01-0.1μg/mL；肝素化氰基丙烯酰胺单体在甲醇中的浓度为0.1-0.5g/mL。
9.根据权利要求1所述的可缓释生长因子的骨修复粘合剂的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中，负载生长因子的预聚合产物和肝素化氰基丙烯酰胺单体的质量比为(1:2)-(1:9)；以负载生长因子的预聚合产物的重量计，二氧化硫气体的浓度为50-100ppm。
10.根据权利要求1-9任一所述的制备方法制备得到的可缓释生长因子的骨修复粘合剂。
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