CN116350841A - 氧化石墨烯基液晶、二元液晶体系、3d海绵样支架材料、液晶凝胶、生物组织工程支架 - Google Patents

氧化石墨烯基液晶、二元液晶体系、3d海绵样支架材料、液晶凝胶、生物组织工程支架 Download PDF

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Abstract

本发明提供了氧化石墨烯基液晶、二元液晶体系、3D海绵样支架材料、液晶凝胶、生物组织工程支架，涉及修复医用材料技术领域。本发明将胆甾醇‑聚乙二醇‑氨基接枝到氧化石墨烯上，制备了新型液晶复合材料氧化石墨烯基液晶复合物，其水溶液具有双折射现象，液晶凝胶具有各向异性结构，具有良好的成骨活性、可打印性、生物相容性、可降解性、机械性能与骨组织高度相似性以及生物仿生性，是一种新型的多功能集成型纳米结构平台。该氧化石墨烯基液晶复合物能够与生物医用材料、光引发剂、生长因子以及干细胞趋化因子复合，通过3D打印‑光交联获得组织工程支架，在骨修复、软骨修复、血管修复、肌腱修复或心肌修复中具有良好的应用前景。

Description

氧化石墨烯基液晶、二元液晶体系、3D海绵样支架材料、液晶 凝胶、生物组织工程支架
技术领域
本发明涉及修复医用材料技术领域，具体涉及氧化石墨烯基液晶复合物及其制备方法和应用、二元液晶体系及其应用、3D海绵样支架材料及其应用、液晶凝胶及其应用、生物组织工程支架及其制备方法和应用。
背景技术
理想骨修复材料的研发是目前骨组织工程领域研究的热点之一，临床应用和科学研究对新型骨组织支架材料的需求均越来越迫切，因此，研制具有成骨诱导性的骨修复材料仍然是骨组织工程研究的重中之重。模拟天然骨组织的组成结构设计构建具有纳米本体或纳米表/界面结构的支架材料，同时对支架材料进行分子水平的设计，赋予支架材料自身骨诱导活性，是目前全面提升传统骨组织修复材料生物活性的一个重要发展方向，纳米尺度的表/界面调控以及支架材料结构的调控与功能组装是赋予组织工程支架材料特殊性能的有效手段。
液晶态是维持人体生命的基本形态。生命体中的蛋白质、核酸、多糖、脂类等能够通过自组装而呈现液晶态。以液晶态生物材料修饰或者直接作为组织工程支架可实现良好的血液相容性和细胞亲和性，降低炎性反应，促进组织的再生修复，液晶态生物材料的开发越来越受到关注。
氧化石墨烯因其特殊的纳米结构、优异的理化性能和生物相容性赋予其在骨、软骨、肌肉、肌腱、皮肤、神经、心脏、脑、血管等软硬组织工程领域均有广泛的研究。例如，现有技术“孙凯.仿生液晶态氧化石墨烯/多糖复合体系的构建及其对hBMSCs生物学行为的影响[D].暨南大学,2020.”公开了模拟细胞外基质(ECM)的类液晶态结构，以氧化石墨烯(GO)液晶(LCs)作为液晶态元，以透明质酸(HA)/海藻酸(SA)为基质，构建了备了GO/SA和GO/HA两个液晶体系，采用冷冻干燥和Ca2+、Mn2+、Sr2+的交联改性技术构建了二元液晶体系的3D支架，不仅保持了液晶态的长程取向和多孔互串互通结构，还显著增强了支架材料的力学强度(压缩强度提高了约5倍)；体内外实验结果表明：Ca2+或Sr2+交联的液晶态支架和自组装液晶态纤维膜均有利于人骨髓间充质干细(hBMSCs)粘附、铺展、增殖和成骨分化，具有明显的促颅骨缺损修复活性。然而，该现有技术中的液晶体系仅仅是作为干细胞生长的基质材料，不具有促骨缺损修复活性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供氧化石墨烯基液晶、二元液晶体系、3D海绵样支架材料、液晶凝胶、生物组织工程支架，本发明提供的氧化石墨烯基液晶复合物自身具有促骨缺损修复活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种氧化石墨烯基液晶复合物，包括氧化石墨液晶和接枝在所述氧化石墨液晶中的胆甾醇-聚乙二醇-氨基。
优选地，所述氧化石墨液晶与胆甾醇-聚乙二醇-氨基的质量比为1:0.05～5；
所述胆甾醇-聚乙二醇-氨基的重均分子量为200～2000。
本发明提供了上述技术方案所述氧化石墨烯基液晶复合物的制备方法，包括以下步骤：
将胆甾醇-聚乙二醇-氨基、氧化石墨液晶、MES缓冲溶液、脱水剂和缩合促进剂混合，进行酰胺化反应，得到氧化石墨烯基液晶复合物。
本发明提供了一种氧化石墨烯基二元液晶体系，包括液晶基元与生物医用材料分散液；所述液晶基元为上述技术方案所述的氧化石墨烯基液晶复合物或上述技术方案所述制备方法制得的氧化石墨烯基液晶复合物；所述生物医用材料分散液为生物医用材料的水溶液或生物医用材料的溶胶。
优选地，所述液晶基元与生物医用材料的质量比为0.005～1：1；
所述生物医用材料包括透明质酸、甲基丙烯酰化透明质酸、海藻酸、甲基丙烯酰化海藻酸、蚕丝蛋白和甲基丙烯酰化蚕丝蛋白中的一种或几种；
所述氧化石墨烯基二元液晶体系中生物医用材料的浓度为0.1～100mg/mL。
本发明提供了一种液晶凝胶，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。
本发明提供了一种3D海绵样支架材料，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系或上述技术方案所述的液晶凝胶进行冷冻干燥得到。
本发明提供了一种生物组织工程支架，化学组成包括上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子。
本发明提供上述技术方案所述生物组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
将氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子混合，进行冷冻干燥或3D打印-光交联，得到生物组织工程支架。
本发明提供了上述技术方案所述的氧化石墨烯基液晶复合物、上述技术方案所述制备方法制备得到的氧化石墨烯基液晶复合物、上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、上述技术方案所述的液晶凝胶、上述技术方案所述的3D海绵样支架材料、上述技术方案所述的生物组织工程支架或上述技术方案所述制备方法制备得到的生物组织工程支架作为生物修复材料的应用。
本发明提供了一种氧化石墨烯基液晶复合物(简写为CLS-PEGn-NH2-g-GO)，包括氧化石墨液晶和接枝在所述氧化石墨液晶中的胆甾醇-聚乙二醇-氨基。本发明提供的氧化石墨烯基液晶复合物中，液晶材料的各向异性结构对成骨分化具有正向调节作用，同时胆甾醇作为生物活性分子对骨髓基质干细胞的成骨分化具有调节作用，使得氧化石墨烯基液晶复合物自身具有促骨缺损修复活性，无需额外加入Ca2+、Sr2+等促骨活性组分。本发明以胆甾醇-聚乙二醇-氨基(CLS-PEGn-NH2)作为活性分子，以氧化石墨烯作为纳米尺度表/界面结构的调控元素，仿生模拟生物活性分子胆甾醇在生物体内的液晶态微环境尤其是镶嵌型液晶态质膜的微环境，将胆甾醇-聚乙二醇-氨基分子接枝到氧化石墨液晶中GO纳米片的边缘，有效模拟了胆甾醇分子在液晶态质膜中通过侧向移动发挥生物活性的特性，与纯的胆甾醇相比，氧化石墨烯基液晶复合物具有优异的促骨活性。本发明提供的氧化石墨烯基液晶复合物具有各向异性结构和良好的成骨活性，同时兼具可打印性、生物相容性、可降解性、机械性能与骨组织高度相似性以及生物仿生性，是一种新型的多功能集成型纳米结构平台，是3D打印的理想支架材料，以氧化石墨烯基液晶复合物作为骨组织的长程取向结构构建模型，利用氧化石墨烯基液晶复合物的有序流动和自组装性能，能够实现多功能组装型骨组织工程支架的有效仿生构建，全方位提升支架材料的骨组织修复活性，为目前骨组织工程支架不能有效仿生而导致体内实验效果不一致的问题，提供解决的新方案。而且，本发明通过体内外实验证实了氧化石墨烯基液晶复合物有利于人牙周膜干细胞的粘附、铺展、增殖和成骨分化，是一种具有优异的生物相容性和促骨活性的新型液晶复合材料，该氧化石墨烯基液晶复合物不仅可以用于仿生构建类细胞外基质的3D支架，而且支架材料自身具有促骨活性。
本发明提供了一种液晶凝胶，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。本发明以氧化石墨烯基液晶复合物为液晶基元，与天然医用材料复合，利用液晶有序流动的特性，制得各项异性的液晶凝胶。借助3D打印技术或冷冻干燥技术，可将该液晶凝胶制备具有长程有序层状结构的3D海绵样支架材料，还可以可制备高度取向的纤维材料和薄膜材料，与非液晶基3D材料和2D材料相比，不仅具有长程有序的结构而且显著提高其力学性能；而且，3D海绵样支架材料为自身具备生物活性、结构以及力学性能可有效仿生骨组织，有望成为骨组织工程中的理想支架材料。
本发明提供了一种液晶凝胶，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。本发明以氧化石墨烯基液晶复合物为液晶基元，与天然医用材料作为基质，通过添加光引发剂，获得液晶凝胶(多元复合液晶体系)，以细胞外基质类液晶态结构为模型，利用挤出型3D打印技术和光固化技术，制备力学性能可控的具有长程取向结构的3D打印液晶凝胶支架，实现细胞外基质的精准仿生制备，解决目前骨组织工程支架无法兼具自身成骨活性和类细胞外基质液晶凝胶态的结构特性，不能精准仿生的科学问题，为骨组织工程支架的研究建立新模型。
本发明提供了一种生物组织工程支架，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与生长因子和趋化因子混合后进行冷冻干燥或3D打印-光交联得到。本发明基于胆甾醇、氧化石墨烯独特的性能，以生物体内普遍存在的液晶态作为仿生模型，将其整合到一个纳米平台中，制备新型的氧化石墨基液晶材料，发挥协同作用，将为骨缺损修复开辟新的研究方向。本发明利用氧化石墨烯基液晶复合物的有序流动的特性和自组装性能，能够负载细胞趋化因子并提高细胞趋化因子的活性，与天然医用材料复合，并通过3D打印技术，通过3D打印技术，个性化精准构建骨缺损修复3D组织工程支架产品。
该复合材料可用于制定一系列材料，开发新型牙科和骨科骨移植以加速骨再生，具有广泛的应用前景和重要的科学意义。
附图说明
图1为浓度为5mg/mL的氧化石墨烯分散液溶致液晶的偏光显微镜图；
图2为浓度为1.5mg/mL的CLS-PEGn-NH2-g-GO分散液溶致液晶的偏光显微镜图；
图3为浓度为5mg/mL的CLS-PEGn-NH2-g-GO分散液溶致液晶的偏光显微镜图；
图4为GO、CLS-PEGn-NH2和CLS-PEGn-NH2-g-GO的红外吸收光谱图；
图5为GO、CLS-PEGn-NH2和CLS-PEGn-NH2-g-GO的拉曼谱图；
图6为实施例4制备得到的氧化石墨烯基二元液晶体系的偏光显微镜图；
图7为实施例6制备得到的1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mL FibMA/0.2w/v％LAP的偏光显微镜图；
图8为1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mLFibMA/0.2w/v％LAP经3D打印合并光照交联得到的1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mL FibMA/0.2w/v％LAP液晶凝胶支架的数码照片；
图9为3D打印CLS-PEG-NH2-g-GO/FibMA液晶凝胶支架经液氮脆断后的截面结构SEM图；
图10为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜的SEM图和AFM图；
图11为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs的死活情况图；
图12为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs的细胞活性情况图；
图13为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs培养24h后细胞骨架微丝染色情况图；
图14为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs培养7天后细胞骨架微丝染色情况图；
图15为早期成骨标志物碱性磷酸酶的定性检测结果图；
图16为晚期成骨标志物钙结节的定性检测结果图；
图17为CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶的动物实验小鼠颅骨修复结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种氧化石墨烯基液晶复合物，包括氧化石墨液晶和接枝在所述氧化石墨液晶中的胆甾醇-聚乙二醇-氨基。在本发明中，所述氧化石墨液晶与胆甾醇-聚乙二醇-氨基的质量比为1:0.05～5，更优选为1:0.5～3，具体优选为1:0.05、1:0.5、1:1、1:2、1:3、1:4或5:1。在本发明中，所述氧化石墨液晶优选具有向列相、层状相或手性液晶相结构。在本发明中，所述胆甾醇-聚乙二醇-氨基(CLS-PEGn-NH2)的重均分子量优选为200～2000，更优选为500～1500。在本发明中，所述氧化石墨烯基液晶复合物优选具有向列相、层状相或手性液晶相结构。
本发明提供了上述技术方案所述氧化石墨烯基液晶复合物的制备方法，包括以下步骤：将胆甾醇-聚乙二醇-氨基、氧化石墨液晶、MES缓冲溶液、脱水剂和缩合促进剂混合，进行酰胺化反应，得到氧化石墨烯基液晶复合物。
在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。
在本发明中，所述氧化石墨液晶的制备方法优选包括以下步骤：将鳞片石墨依次经酸化、膨化、预氧化和氧化，得到氧化石墨液晶，具体的，优选包括以下步骤：将鳞片石墨、浓硫酸和发烟硝酸混合，进行酸化，得到酸化插层石墨；将所述酸化插层石墨进行膨化，得到膨化石墨；将所述膨化石墨、过硫酸钾、五氧化二磷和浓硫酸混合，进行预氧化，得到预氧化石墨；将所述预氧化石墨、浓硫酸和高锰酸钾混合，进行氧化，得到氧化石墨液晶。
本发明将鳞片石墨、浓硫酸和发烟硝酸混合，进行酸化，得到酸化插层石墨。在本发明中，所述鳞片石墨的粒度优选为100～1000μm，更优选为200～800μm。在本发明中，所述鳞片石墨质量与浓硫酸体积之比优选为1～10g：50～300mL，更优选为3～8g：100～250mL，进一步优选为5～7g：150～200mL；所述浓硫酸的浓度优选为98wt％。在本发明中，所述鳞片石墨质量与发烟硝酸体积之比优选为1～10g：20～100mL，更优选为3～8g：30～80mL，进一步优选为5～7g：40～60mL；所述发烟硝酸的浓度优选＞86wt％，更优选为86～98wt％，进一步优选为90～98wt％。在本发明中，所述混合优选为将浓硫酸和发烟硝酸混合，得到混酸；将鳞片石墨与所述混酸混合；所述混合的方式优选为搅拌混合。在本发明中，所述酸化的温度优选为室温，所述酸化的时间优选为12～36h，更优选为24h；所述酸化优选在搅拌条件下进行。
所述酸化后，本发明优选还包括将所得酸化产物进行水洗后干燥，得到酸化插层石墨。在本发明中，所述水洗的次数优选为3～5次，更优选为4次；所述鳞片石墨的质量与单次水洗用水的体积之比优选为1～10g：500～4000mL，更优选为3～8g：1000～3000mL。在本发明中，所述干燥的温度优选为45～65℃，更优选为50～60℃；所述干燥的时间优选为24～72h，更优选为30～50h；所述干燥优选为真空干燥，更优选在真空干燥箱中干燥。
得到酸化插层石墨后，本发明将所述酸化插层石墨进行膨化，得到膨化石墨。在本发明中，所述膨化的温度优选为800～1200℃，更优选为900～1000℃；所述膨化的时间优选为5～15s，更优选为10～12s；所述膨化优选在马弗炉中进行。
得到膨化石墨后，本发明将所述膨化石墨、过硫酸钾、五氧化二磷和浓硫酸混合，进行预氧化，得到预氧化石墨。在本发明中，所述膨化石墨、过硫酸钾和五氧化二磷的质量比优选为1～10：0.84～8.4：1.2～12，更优选为3～8：2～6：3～10。在本发明中，所述浓硫酸的浓度优选为98wt％；所述膨化石墨的质量与浓硫酸的体积之比优选为1～10g：50～500mL，更优选为3～8g：100～300mL。在本发明中，所述混合优选为将过硫酸钾、五氧化二磷和浓硫酸混合，得到混合液；将膨化石墨与所述混合液混合；所述混合的方式优选为搅拌混合。在本发明中，所述预氧化的温度优选为65～85℃，更优选为70～80℃，所述预氧化的时间优选为3.5～7.5h，更优选为4～6h；所述预氧化优选在搅拌条件下进行。
所述预氧化后，本发明优选还包括将所得预氧化产物液依次进行冷却至室温、水洗和干燥，得到预氧化石墨。本发明对于所述冷却没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的冷却方式即可，具体如自然冷却。在本发明中，所述膨化石墨的质量与稀释用水体积之比优选为1～10g：500～5000mL，更优选为3～8g：1000～3000mL；所述水洗优选为过滤水洗，所述过滤水洗用过滤膜优选为0.22μm耐酸碱微孔滤膜；所述耐酸碱微孔滤膜的材质优选包括聚四氟乙烯或聚丙烯。在本发明中，所述干燥的温度优选为室温；所述干燥的时间优选为2～4天，更优选为3天。
得到预氧化石墨后，本发明将所述预氧化石墨、浓硫酸和高锰酸钾混合，进行氧化，得到氧化石墨液晶。在本发明中，所述浓硫酸的浓缩优选为98wt％。在本发明中，所述预氧化石墨质量与浓硫酸体积之比优选为1～10g：40～400mL，更优选为3～8g：50～300mL。在本发明中，所述预氧化石墨与高猛酸钾的质量比优选为1～10：5～50，更优选为3～8g：15～40。在本发明中，所述混合的温度优选≤8℃；所述混合优选为在冰浴、搅拌条件下将预氧化石墨加入到浓硫酸中，降温至5℃以下后加入高锰酸钾混合。在本发明中，所述氧化优选包括第一氧化，将得到的第一氧化液与水混合，进行第二氧化，得到氧化液；所述第一氧化的温度优选为35～55℃，更优选为40～50℃，所述第一氧化的时间优选为1～4h，更优选为2～3h；所述预氧化石墨质量与水体积之比优选为1～10g：50～500mL，更优选为3～8g：100～400mL；所述第二氧化的温度优选为65～95℃，更优选为70～80℃，所述第二氧化的时间优选为0.5～3.5h，更优选为1～3h；所述氧化优选在搅拌条件下进行。
所述氧化后，本发明优选还包括将所得氧化液与水混合后加入双氧水终止氧化，固液分离，将所得固体产物进行酸洗后水洗，得到氧化石墨液晶。在本发明中，所述预氧化石墨质量与水体积之比优选为1～10g：20～2000mL，更优选为3～8g：500～100mL。在本发明中，所述双氧水的浓度优选为20～60wt％，更优选为25～30wt％；所述预氧化石墨质量与双氧水体积之比优选为1～10g：10～100mL，更优选为3～8g：30～80mL。在本发明中，所述固液分离优选为静置后弃去上清液；所述静置的温度优选为室温，所述静置的时间优选为12～36h，更优选为24h。在本发明中，所述酸洗用酸优选包括盐酸溶液，所述盐酸溶液的浓度优选为1～5mol/L，更优选为1mol/L，所述酸洗优选为离心酸洗。在本发明中，所述水洗优选为离心水洗，本发明对于所述水洗没有特殊限定，以最后一次水洗液的pH值为5.5～6.5(更优选为6)即可。
得到氧化石墨液晶后，本发明将胆甾醇-聚乙二醇-氨基、氧化石墨液晶、MES缓冲溶液、脱水剂和缩合促进剂混合，进行酰胺化反应，得到氧化石墨烯基液复合物。
在本发明中，所述胆甾醇-聚乙二醇-氨基(CLS-PEGn-NH2)与氧化石墨液晶的质量比优选为0.05～5：1，更优选为0.5～3：1。
在本发明中，所述MES缓冲溶液的pH值优选为5，所述MES缓冲溶液的浓度优选为0.1mol/L；所述氧化石墨液晶质量与MES缓冲溶液体积之比优选为1g：200～1000mL，更优选为1g：500～800mL。
在本发明中，所述脱水剂优选为碳二亚胺类脱水剂，更优选包括N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)中的一种或几种；所述氧化石墨液晶与脱水剂的质量比优选为1：5～8，更优选为1：6～7，进一步优选为1:6.5。
在本发明中，所述缩合促进剂优选包括缩合N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐(Sulfo-NHS)、卡特缩合剂(BOP)、1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸盐(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)中的一种或几种；所述氧化石墨液晶与缩合促进剂的质量比优选为1：6～9，更优选为1：7～8，进一步优选为1:7.8。
在本发明中，所述混合优选为：将胆甾醇-聚乙二醇-氨基、氧化石墨液晶和MES缓冲溶液预混合，在保护气氛下，将得到的分散液与脱水剂和缩合促进剂混合；所述预混合的时间优选为1～2h，更优选为1.5h；所述混合的时间优选为4～10h，更优选为5～6h；所述预混合和混合的方式优选为超声混合；本发明对于所述超声混合的超声功率没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的超声功率即可。在本发明中，所述保护气氛优选包括氮气、氩气或氦气。
在本发明中，所述酰胺化反应的温度优选为20～40℃，更优选为25℃，所述酰胺化反应的时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
所述酰胺化反应后，本发明优选还包括：将所得酰胺化反应液进行固液分离，将所得固体产物水洗后分散于水中，将得到的水分散液进行透析后干燥，得到氧化石墨烯基液晶复合物。在本发明中，所述固液分离的方式优选为过滤。在本发明中，所述水分散液的浓度优选为2～6g/mL，更优选为3～4g/mL。在本发明中，所述透析的温度优选为4～25℃，更优选为4～10℃，所述透析的时间优选为3～5天，更优选为3.5～4天；所述透析采用的透析袋的截留分子量优选为6～8kDa。在本发明中，所述干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为-80～-45℃，更优选为-60～-80℃；所述冷冻干燥的时间优选为24～72h，更优选为40～48h。
本发明提供了一种氧化石墨烯基二元液晶体系，包括液晶基元与分散液；所述液晶基元为上述技术方案所述的氧化石墨烯液晶或上述技术方案所述制备方法制得的氧化石墨烯基液晶复合物；所述分散液为生物医用材料的水溶液或生物医用材料的溶胶。在本发明中，所述生物医用材料优选包括透明质酸(HA)、甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、海藻酸(SA)、甲基丙烯酰化海藻酸(AlgMA)、蚕丝蛋白(SF)和甲基丙烯酰化蚕丝蛋白(SilMA)中的一种或几种，更优选包括透明质酸、甲基丙烯酰化透明质酸、海藻酸、甲基丙烯酰化海藻酸、蚕丝蛋白或甲基丙烯酰化蚕丝蛋白。在本发明中，所述生物医用材料的分子量优选为20～3000kDa，更优选为500～2500kDa。在本发明中，所述述氧化石墨烯液晶凝胶中生物医用材料的浓度优选为0.1～100mg/mL，更优选为10～50mg/mL。在本发明中，所述生物医用材料的水溶液的浓度优选为1～20mg/mL，更优选为5～15mg/mL；所述生物医用材料的溶胶(溶剂为水)的浓度优选为20～100mg/mL，更优选为30～50mg/mL。
在本发明中，所述氧化石墨烯液晶凝胶中液晶基元的浓度优选为0.02～10mg/mL，更优选为0.1～5mg/mL。在本发明中，所述液晶基元与生物医用材料的质量比优选为0.005～1：1，更优选为0.01～0.5：1。
在本发明中，所述氧化石墨烯基二元液晶体系的制备方法优选包括以下步骤：将液晶基元、生物医用材料和水混合，得到氧化石墨烯基二元液晶体系。在本发明中，所述混合优选包括依次进行超声混合和搅拌混合，所述超声混合的时间优选为10～30min，更优选为20min；所述搅拌混合的时间优选为1～3h，更优选为2h；所述混合的温度优选为室温。
本发明提供了一种液晶凝胶，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。在本发明中，所述光引发剂优选包括苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)，所述光引发剂的质量与氧化石墨烯基二元液晶体系的体积之比优选为0.05～2.5g:500mL，更优选为0.5～2g:500mL，进一步优选为1g:500mL本发明对于所述混合没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述混合后还包括将所得混合体系进行3D打印，所述3D打印优选利用挤出型3D打印机进行。在本发明中，所述光交联优选在光照条件下进行，所述光照的波长优选为350～450nm，更优选为405nm，所述便携式点光源固化设备的功率优选为1～5W，更优选为3W，所述光交联的时间优选为10～30s。在本发明中，所述液晶凝胶为各项异性液晶凝胶。
本发明提供了一种液晶凝胶，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。在本发明中，所述光引发剂优选包括苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)，所述光引发剂的质量与氧化石墨烯基二元液晶体系的体积之比优选为0.05～2.5g:500mL，更优选为0.5～2g:500mL，进一步优选为1g:500mL本发明对于所述混合没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如超声混合。在本发明中，所述混合后还包括将所得混合体系进行3D打印，所述3D打印优选利用挤出型3D打印机进行。在本发明中，所述光交联优选在光照条件下进行，所述光照的波长优选为350～450nm，更优选为405nm，光强度优选为10～2000mw/cm2，更优选为100～1200mw/cm2；所述光交联的时间优选为10～30s。在本发明中，所述液晶凝胶为各项异性液晶凝胶，所述液晶凝胶经冷冻干燥后得到具有具有长程有序层状结构的3D海绵样支架材料。在本发明中，所述氧化石墨烯基二元液晶体系中的生物材料优选包括甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化海藻酸(AlgMA)和甲基丙烯酰化蚕丝蛋白(SilMA)中的一种或几种。
本发明提供了一种3D海绵样支架材料，由上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系或上述技术方案所述的液晶凝胶进行冷冻干燥得到。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-80～-45℃，更优选为-80～-60℃；所述冷冻干燥的时间优选为24～72h，更优选为48h。在本发明中，通过冷冻干燥得到的3D海绵样支架材料优选为具有长程有序层状结构(“洋葱状”)的3D海绵样支架材料。
本发明提供了一种生物组织工程支架，化学组成包括上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子。在本发明中，所述生长因子优选包括成骨、成血管或成软骨相关的生长因子，更优选包括BMP-2、VEGF、TGF-β1和bFGF中的一种或几种。在本发明中，所述趋化因子优选包括干细胞趋化因子，更优选包括细胞趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和KGN中的一种或几种；所述细胞趋化因子优选包括SDF1α和/或白介素-8(IL-8)。
本发明提供了上述技术方案所述生物组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：将氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子混合，进行冷冻干燥或3D打印-光交联，得到生物组织工程支架。具体地，所述生物组织工程支架的制备方法优选包括以下步骤：(1)将氧化石墨烯基液晶复合物与生长因子混合，得到负载生长因子的氧化石墨烯基液晶复合物；(2)将生物医用材料分散液与趋化因子混合，得到生物医用材料混合分散液；(3)将所述负载生长因子的氧化石墨烯基液晶复合物与所述生物医用材料混合分散液混合，进行冷冻干燥或3D-光交联，得到生物组织工程支架；步骤(1)和步骤(2)没有时间先后顺序。
本发明将氧化石墨烯基液晶复合物与生长因子混合，得到负载生长因子的氧化石墨烯基液晶复合物。在本发明中，所述混合优选为搅拌混合，所述混合过程中氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)通过π-π堆垛负载生长因子。本发明对于所述混合没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可，具体如搅拌混合；所述混合的温度优选为4～25℃，更优选为14～10℃；所述混合的时间优选为0.5～6h，更优选为3～4h。
本发明将生物医用材料分散液与趋化因子混合，得到生物医用材料混合分散液。在本发明中，所述混合优选为搅拌混合。
得到负载生长因子的氧化石墨烯基液晶复合物和生物医用材料混合分散液后，本发明将所述负载生长因子的氧化石墨烯基液晶复合物与所述生物医用材料混合分散液混合，进行冷冻干燥或3D打印-光交联，得到生物组织工程支架。在本发明中，所述混合优选为超声混合或搅拌混合。在本发明中，所述冷冻干燥的条件优选与前述3D海绵样支架材料的制备过程中的冷冻干燥条件相同，在此不再赘述；所述冷冻干燥能够获得支架形状。在本发明中，当采用3D打印-光交联时步骤(2)中优选还加入光引发剂进行混合。在本发明中，当采用3D打印-光交联时，所述生物材料优选包括甲基丙烯酰化透明质酸(HAMA)、甲基丙烯酰化海藻酸(AlgMA)和甲基丙烯酰化蚕丝蛋白(SilMA)中的一种或几种。在本发明中，所述3D打印-光交联优选包括依次进行3D打印和光交联，所述3D打印和光交联的条件优选与前述3D海绵样支架材料的制备过程中的3D打印和光交联条件相同，在此不再赘述。在本发明中，所述3D打印-光交联后优选还包括：将所述3D打印-光交联得到的3D打印液晶凝胶支架进行冷冻干燥，得到生物组织工程支架；所述冷冻干燥的条件优选与前述3D海绵样支架材料的制备过程中的冷冻干燥条件相同，在此不再赘述；本发明通过3D打印-光交联，使得趋化因子负载于3D打印液晶凝胶支架内部，实现趋化因子和生长因子的序贯缓释，充分发挥多因子的协同作用；本发明通过3D打印可以实现精准设计制备更加理想的生物组织工程支架。
在本发明中，所述生物组织工程支架优选为具有长程有序层状结构(“洋葱状”)的生物组织工程支架材料。在本发明中，所述生物组织工程支架材料的片状结构为CLS-PEG-NH2-g-GO纳米片，所述CLS-PEG-NH2-g-GO纳米片负载生长因子；所述CLS-PEG-NH2-g-GO纳米片之间填充有生物医用材料，所述生物医用材料上负载有趋化因子。
本发明提供的制备方法，操作简单、成本低廉、环境友好，不仅可以用于骨组织工程支架材料的构建，亦可用于其他具有高度取向结构的组织的仿生构建，具有重要的仿生价值。
本发明提供了上述技术方案所述的氧化石墨烯液晶、上述技术方案所述制备方法制备得到的氧化石墨烯基液晶复合物、上述技术方案所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、上述技术方案所述的液晶凝胶、上述技术方案所述的3D海绵样支架材料或上述技术方案所述的生物组织工程支架在骨修复、软骨修复、血管修复、肌腱修复或心肌修复中的应用。在本发明中，所述骨修复优选包括牙周骨原位再生修复。本发明基于胆甾醇、氧化石墨烯独特的性能，以生物体内普遍存在的液晶态作为仿生模型，将其整合到一个纳米平台中，制备新型氧化石墨烯仿生液晶体系，发挥协同作用，将为骨缺损修复开辟新的研究方向。通过分析牙周骨组织各向异性结构、成分和生物力学性能，创新性地提出利用CLS-PEGn-NH2接枝氧化石墨烯，制备NH2-PEGn-CLS-g-GO液晶态复合材料。利用NH2-PEGn-CLS-g-GO有序流动的特性和自组装性能，负载细胞趋化因子(如SDF1α、白介素-8(IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1))并提高趋化因子的活性。进一步与天然生物医用材料壳聚糖、海藻酸等复合，通过3D打印技术，个性化精准构建牙周骨缺损修复3D组织工程支架产品，富集内源性牙周膜干细胞，诱导牙周骨原位再生修复，为牙周骨缺损修复开发新的液晶态分子修复模型，具有广泛的应用前景和重要的科学意义。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的鳞片石墨购自青岛恒利得石墨公司，胆甾醇-聚乙醇-氨基(CLS-PEG-NH2)购自上海芃盛实业有限公司，浓硫酸、发烟硝酸、高锰酸钾、盐酸、双氧水和氮气均购自国药集团化学试剂。
实施例1
(1)氧化石墨烯液晶(GO)的制备
在三颈烧瓶中预先加入300mL98wt％的浓硫酸和100mL浓度为90wt％的发烟硝酸，在室温、搅拌的条件下加入10g粒度为100～1000μm的鳞片石墨，室温、搅拌条件下酸化24h，去离子水洗涤过滤3～5次，置于60℃真空干燥箱中干燥48h，得到酸化插层石墨；单次水洗用水量为4000mL；
将所述酸化插层石墨置于1000℃的马弗炉中膨化10s，得到膨化石墨；
先将8.4gK2S2O8和12gP2O5分散于500mL浓度为98wt％的浓硫酸中，然后在搅拌的条件下缓慢加入10g所述膨化石墨，在80℃、搅拌条件下预氧化6h；冷却至室温后，加入500～5000mL去离子水稀释并用耐酸碱的0.22μm微孔滤膜过滤洗涤，重复上述稀释-过滤洗涤5次，在室温条件下干燥2～4天，得到预氧化石墨；
将冰箱中预冷的98wt％浓硫酸400mL注入三颈烧瓶中，在冰水浴、搅拌条件下，缓慢加入所述得预氧化石墨5g，温度控制在5℃以下，随后缓慢加入50gKMnO4并将温度控制在8℃以下，升温至45℃，在搅拌条件下反应3h，加入500mL去离子水，升温至80℃，在搅拌条件下反应2h，加入1000mL去离子水，加入100mL30wt％H2O2终止反应；静置24h，弃去上清液，在底部沉淀中加入1MHCl溶液离心洗涤1次，去离子水多次离心洗涤至pH值＝6，得到氧化石墨液晶。
(2)制备氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEGn-NH2-g-GO)
将胆甾醇-聚乙二醇-氨基(CLS-PEGn-NH2)(MW＝200)与所述氧化石墨液晶按照质量比为0.05:1共混于MES缓冲溶液(0.1mol/L，pH＝5)中，水浴超声2h，得到均一的分散液；在氮气保护下，加入脱水剂EDC和缩合促进剂NHS，水浴超声6h，搅拌反应16h，水过滤洗涤5次，将所得固体产物分散于去离子水中，将所得水分散液在4℃条件下透析(MWCO＝6-8kDa)5天，在-70℃条件下冷冻干燥48h，得到氧化石墨烯基液晶(CLS-PEG-NH2-g-GO)，其中，GO与CLS-PEGn-NH2质量比为1:0.05，GO质量与MES缓冲溶液体积之比为1g：500mL，GO与EDC的质量比为1:6.5，GO与NHS的质量比为1:7.8。
实施例2
按照实施例1的方法制备氧化石墨烯基液晶复合物，与实施例1的区别仅在于，GO与CLS-PEGn-NH2的质量比1:0.1。
实施例3
按照实施例1的方法制备氧化石墨烯基液晶复合物，与实施例1的区别仅在于，GO与CLS-PEGn-NH2的质量比1:0.5。
分别将实施例1制备的GO和实施例1～3制备的CLS-PEGn-NH2-g-GO加入到去离子水中通过超声和搅拌分散，分别得到浓度均为10mg/mL的GO溶液和CLS-PEGn-NH2-g-GO溶液。用去离子水分别将GO分散液和CLS-PEGn-NH2-g-GO分散液依次稀释至8mg/mL、6mg/mL、5mg/mL、4mg/mL、3mg/mL、2mg/mL、1mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.5mg/mL、0.4mg/mL、0.3mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.08mg/mL、0.06mg/mL、0.05mg/mL、0.03mg/mL和0.02mg/mL，超声分散15min，持续磁力搅拌1.5h，静置12h，分别用移液枪吸取150μL上述分散液置于液晶池中或直接将液滴置于载玻片上，通过偏光显微镜观察不同浓度的GO溶液以及CLS-PEGn-NH2-g-GO成液晶态时典型的纹影结构。
图1为浓度为5mg/mL的氧化石墨烯分散液溶致液晶的偏光显微镜图，从图中可以看出分散液较强的各向异性，呈现多彩的纹影结构和丝状结构，具有向列相液晶的特征。
图2为浓度为1.5mg/mL的CLS-PEGn-NH2-g-GO分散液溶致液晶的偏光显微镜图，从图中可以看到胆甾醇接枝氧化石墨烯分散液放射状的有序流动性和较强光学各项异性，呈现出有序的条纹织构。
图3为浓度为5mg/mL的CLS-PEGn-NH2-g-GO分散液溶致液晶的偏光显微镜图，从图中可以看出浓度增大CLS-PEGn-NH2-g-GO溶液的流动性变差，黏度增大，其偏光显微镜下结构由放射状条纹织构变成同心圆带状织构，制得稳定的胆甾醇接枝氧化石墨液晶溶液。
图4为GO、CLS-PEGn-NH2和CLS-PEGn-NH2-g-GO的红外吸收光谱图，从图可见，GO与GO-g-NH2-PEGn-CLS的化学结构很相近，且有GO在3398cm-1、2933cm-1、1655cm-1、1254cm-1等处出现吸收峰，分别对应-OH、-CH3、C＝O、C-O-C等基团的特征峰，说明石墨成功的被氧化。GO与CLS-PEGn-NH2的质量比分别为1:0.05、1:0.1、1:0.5的GO-g-NH2-PEGn-CLS在1654cm-1C＝O和1530cm-1N-H有特征吸收峰出现，说明CLS-PEGn-NH2与GO结合形成了O＝C-NH酰胺键，表明了CLS-PEGn-NH2被成功的接枝于氧化石墨烯上。
图5为GO、CLS-PEGn-NH2和CLS-PEGn-NH2-g-GO的拉曼谱图，拉曼谱图中显示GO有两个特征峰：D带、G带，然而不同接枝率(即GO与CLS-PEGn-NH2的质量比分别为1:0.05、1:0.1、1:0.5)的GO-g-NH2-PEGn-CLS的D带和G带与GO的相同，均在1587.9cm-1和1339.38cm-1处，说明胆甾醇接枝到氧化石墨烯上并未对其结构造成影响，没有改变氧化石墨烯的理化性能。
实施例4
将浓度为0.2mg/m的CLS-PEG-NH2-g-GO水分散液与浓度为20mg/mL的透明质酸水溶液按照体积比为1:1超声混合30min，继续搅拌2h，得到稳定的氧化石墨烯基二元液晶体系。
图6为实施例4制备得到的氧化石墨烯基二元液晶体系的偏光显微镜图，从图中可以看出，胶体液晶具有稳定的致密的层状有序结构。这是由于透明质酸分子的排空效应(或称体积效应)，调控CLS-PEG-NH2-g-GO液晶基元的取向排列，实现“吸而不聚”，从而显著降低液晶基元的临界浓度。
实施例5
按照实施例4的方法制备氧化石墨烯基二元液晶体系，与实施例4的区别仅在于：CLS-PEG-NH2-g-GO水分散液的浓度分别为0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL和6.0mg/mL；透明质替换为海藻酸或蚕丝蛋白，生物医用材料水溶液的浓度分别为1.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL和20mg/mL，得到系列稳定的氧化石墨烯基二元液晶体系。
实施例6
将浓度为1.5mg/mL的CLS-PEG-NH2-g-GO水分散液、浓度为20mg/mL甲基丙烯酰化蚕丝蛋白(FibMA)水溶液和LAP超声混合30min，继续搅拌2h，得到液晶凝胶(记为1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mL FibMA/0.2％LAP(w/v))；将所述液晶凝胶作为3D打印墨水，利用挤出型3D打印机进行3D打印，然后紫外光照15s，冷冻干燥，得到3D海绵样支架材料(记为3D打印CLS-PEG-NH2-g-GO/FibMA液晶凝胶支架)。其中，CLS-PEG-NH2-g-GO水分散液和FibMA水溶液的体积比为1:1，液晶凝胶中LAP的浓度为0.2％(w/v，即2g/L)。
图7为实施例6制备得到的1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mL FibMA/0.2w/v％LAP的偏光显微镜图，从图中可以看出液晶凝胶具有有序的环层状结构。
图8为1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mLFibMA/0.2w/v％LAP经3D打印合并光照交联得到的1.5mg/mLCLS-PEG-NH2-g-GO/20mg/mL FibMA/0.2w/v％LAP液晶凝胶支架的数码照片。
图9为3D打印CLS-PEG-NH2-g-GO/FibMA液晶凝胶支架经液氮脆断后的截面结构SEM图，由图中可以看出生物组织工程支架内部具有层状有序的纤维网络结构。
实施例7
按照实施例6的方法制备3D海绵样支架材料，与实施例6的区别仅在于：CLS-PEG-NH2-g-GO水分散液的浓度分别为0.2mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL和6.0mg/mL；甲基丙烯酰化蚕丝蛋白替换为甲基丙烯酰化透明质酸或甲基丙烯酰化海藻酸，生物医用材料水溶液的浓度分别为1.0mg/mL、5.0mg/mL、10mg/mL和20mg/mL，得到系列3D海绵样支架材料。
测试例1
通过死活细胞染色实验、细胞增殖实验和细胞粘附铺展检测三方面评价CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶的细胞相容性。
首先将CLS-PEG-NH2水溶液(浓度为5mg/mL)、GO液晶或CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶浇注到6孔细胞培养板，空气中干燥成液晶基膜，钴60辐照灭菌。将人牙周膜干细胞(hPDLSCs)以2.0×104/cm2的密度接种于敷有液晶基膜的6孔板中，于1天、4天和10天收集细胞，利用死活染色试剂盒根据说明书对hPDLSCs进行染色，钙黄绿素(AM)能够穿透活细胞膜，对活细胞染色，呈现强绿色荧光；碘化吡啶(PI)仅对死细胞染色而产生红色荧光，通过荧光显微镜观察可以可视化观察hPDLSCs的死活情况。
图10为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜的SEM图和AFM图，从图中可以看出，CLS-PEG-NH2成条状结晶，局部平行有序排列，GO液晶基膜表面成交错的网络样结构，CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜成脊状褶皱结构，有序性较GO液晶基膜强。
图11为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs的死活情况图，从图中可以看出，CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜上有个别死细胞出现(红色)而CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上未见死细胞，同时复合物液晶基膜上细胞密度更大，细胞增殖更快，胆甾醇接枝氧化石墨烯复合物液晶基膜具有更好的细胞相容性。
将CLS-PEG-NH2溶液、GO液晶或CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶浇注到96孔板细胞培养板中，空气中干燥成液晶基膜，钴60辐照灭菌。将人牙周膜干细胞(hPDLSCs)以2.0×104/cm2的密度接种于敷有液晶基膜的96孔板中，于1天、3天、5天、7天和10天收集细胞，每孔加入10μLMTT溶液(5.0mg/mL)，于培养箱中孵育4h后，弃去混合溶液，加入150μLDMSO置摇床上低速振荡10min，充分溶解活细胞中的蓝紫色结晶甲瓒，用酶标仪测定在490nm处的吸光度，通过OD值的大小间接反映hPDLSCs的增殖活性。
图12为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs的细胞活性情况，可以看出GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs细胞增殖活性无明显差异，但是两者均优于CLS-PEG-NH2结晶表面细胞增殖活性。
将CLS-PEG-NH2溶液、GO液晶或CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶浇注到激光共聚焦专用培养皿中(外径35mm，10mm内孔用载玻片封底)，空气中干燥成液晶基膜，钴60辐照灭菌。将人牙周膜干细胞(hPDLSCs)以2.0×104/cm2的密度接种于敷有液晶基膜的激光共聚焦专用的小培养皿中，于24h利用罗丹明标记的鬼笔环肽对牙周膜干细胞的细胞骨架中微丝染色。具体步骤：首先PBS洗三次，用4％的多聚甲醛固定15min，吸掉固定液，添加0.1％TritonX-100，静置3min，PBS洗涤3次，加入100nM的罗丹明鬼笔环肽工作液(含1％的BSA封闭液)没过细胞即可，避光孵育60min，PBS洗涤细胞3次，加入200ng/mL的DAPI染色液避光孵育20min，PBS洗三次，加入封片液封片，最后通过激光共聚焦显微镜观察细胞骨架中微丝，评价胆甾醇接枝氧化石墨烯对牙周膜干细胞粘附铺展的影响。
图13为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs培养24h后细胞骨架微丝染色情况图，图14为CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs培养7天后细胞骨架微丝染色情况图，从图13～14可以看出，三种材料均有利于细胞的粘附和铺展，细胞呈多边形，其中CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上荧光强度较大大，间接表明其有利于肌动蛋白的表达。培养至第7天时，细胞呈向列相样取向排列汇聚，细胞成长梭形。
测试例2
首先将CLS-PEG-NH2溶液、GO液晶或CLS-PEG-NH2-g-GO复合液晶浇注到24孔细胞培养板，空气中干燥成液晶基膜，钴60辐照灭菌。将人牙周膜干细胞(hPDLSCs)以2.0×104/cm2的密度，接种于敷有液晶基膜的24孔板中，于7天和14天收集细胞，根据说明书(凯基生物KGA353，成骨鉴定试剂盒-碱性磷酸酶钙钴染色法)利用钙钴法对碱性磷酸酶染色，通过显微镜观察胞质中灰黑色沉淀的形成即碱性磷酸酶(ALP)的形成，鉴定hPDLSCs早期成骨分化情况。于14天和21天收集细胞，根据说明书(凯基生物KGA363-1，茜素红染色液)对细胞的钙结节染色，通过显微镜观察经茜素红染色的鲜红色钙结节的形成，鉴定hPDLSCs晚期成骨分化情况。
图15为早期成骨标志物碱性磷酸酶的定性检测结果图，CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上hPDLSCs胞质中灰黑色沉淀越多表明碱性磷酸酶分泌越多，可以看出CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜更有利于hPDLSCs碱性磷酸酶的分泌，提示有利于牙周膜干细胞成骨分化。
图16为晚期成骨标志物钙结节的定性检测结果图，CLS-PEG-NH2结晶、GO液晶基膜和CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜上鲜红色沉淀越多表明钙结节越多，细胞成骨效果越好。对比发现，无论是否添加成骨诱导液CLS-PEG-NH2-g-GO复合物液晶基膜均有利于钙结节的形成，CLS-PEG-NH2-g-GO液晶基膜自身具有一定的成骨诱导活性，提示有利于牙周膜干细胞成骨分化。
测试例3
将高浓度(5mg/mL)的氧化石墨烯(GO)液晶或氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)注入48孔板中，冷冻干燥成型后切割成直径为5.8mm，高度为2.5mm的圆柱体支架，分别是氧化石墨烯(GO)液晶支架和氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)支架，钴60辐照灭菌后用于小鼠颅骨损伤模型中颅骨愈合的支架材料。所有小鼠颅骨损伤模型中，构建直径为6.0mm，深度为2.7mm的颅骨缺损伤口。将灭菌的氧化石墨烯(GO)液晶支架和氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)支架无菌植入到小鼠颅骨损伤的伤口中，设置无材料植入组作为对照组，小鼠在相同的条件下饲养4～12周。因为材料植入伤口后吸收周围的组织液和血液会有一定的溶胀作用，所以植入材料大小略小于伤口的大小。于4周和12周分别对小鼠进行安乐死，取实验组和阴性对照组小鼠颅骨标本，在肉眼及显微镜下进行颅骨缺损修复大体形态评分、在micro-CT下观察新骨生成情况。
图17为氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)支架的动物实验小鼠颅骨修复结果图，验证氧化石墨烯基液晶复合物的促骨修复效果，通过Micro CT图可以看出，与氧化石墨烯(GO)液晶支架和胆甾醇-聚乙醇-氨基(CLS-PEG-NH2)支架相比，氧化石墨烯基液晶复合物(CLS-PEG-NH2-g-GO)支架组的骨缺损愈合的较快，新生骨量较多，具有更好的促骨修复效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种氧化石墨烯基液晶复合物，其特征在于，包括氧化石墨烯液晶和接枝在所述氧化石墨液晶上的胆甾醇-聚乙二醇-氨基。
2.根据权利要求1所述的氧化石墨烯基液晶复合物，其特征在于，所述氧化石墨液晶与胆甾醇-聚乙二醇-氨基的质量比为1:0.05～5；
所述胆甾醇-聚乙二醇-氨基的重均分子量为200～2000。
3.权利要求1或2所述氧化石墨烯基液晶复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将胆甾醇-聚乙二醇-氨基、氧化石墨液晶、MES缓冲溶液、脱水剂和缩合促进剂混合，进行酰胺化反应，得到氧化石墨烯基液晶复合物。
4.一种氧化石墨烯基二元液晶体系，其特征在于，包括液晶基元与生物医用材料分散液；所述液晶基元为权利要求1～2任一项所述的氧化石墨烯基液晶复合物或权利要求3所述制备方法制得的氧化石墨烯基液晶复合物；所述生物医用材料分散液为生物医用材料的水溶液或生物医用材料的溶胶。
5.根据权利要求4所述的氧化石墨烯基二元液晶体系，其特征在于，所述液晶基元与生物医用材料的质量比为0.005～1：1；
所述生物医用材料包括透明质酸、甲基丙烯酰化透明质酸、海藻酸、甲基丙烯酰化海藻酸、蚕丝蛋白和甲基丙烯酰化蚕丝蛋白中的一种或几种；
所述氧化石墨烯基二元液晶体系中生物医用材料的浓度为0.1～100mg/mL。
6.一种液晶凝胶，其特征在于，由权利要求4或5所述的氧化石墨烯基二元液晶体系与光引发剂混合后光交联得到。
7.一种3D海绵样支架材料，其特征在于，由权利要求4或5所述的氧化石墨烯基二元液晶体系或权利要求6所述的液晶凝胶进行冷冻干燥得到。
8.一种生物组织工程支架，其特征在于，化学组成包括权利要求4或5所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子。
9.权利要求8所述的生物组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将氧化石墨烯基二元液晶体系、生长因子和趋化因子混合，进行冷冻干燥或3D打印-光交联，得到生物组织工程支架。
10.权利要求1或2所述的氧化石墨烯基液晶复合物、权利要求3所述制备方法制备得到的氧化石墨烯基液晶复合物、权利要求4或5所述的氧化石墨烯基二元液晶体系、权利要求6所述的液晶凝胶、权利要求7所述的3D海绵样支架材料、权利要求8所述的生物组织工程支架或权利要求9所述制备方法制备得到的生物组织工程支架作为生物修复材料的应用。
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