CN102961782A - 一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法，属于功能高分子材料领域，特别涉及智能型肝组织工程支架材料及其制备方法，该凝胶温度响应范围为25℃-37℃，可由下述方法制得：首先将甘草次酸(GA)活化为活性酯，将此活性酯与过量乙二胺反应，得到其胺类衍生物(GA-NH2)；然后将GA-NH2与丙烯酸(AAc)反应生成乙烯基单体(AAc-GA)。将肝素加入AAc-GA溶液，分别以N，N-二甲基双丙烯酰胺(MBAA)和聚乙二醇-二甲基丙烯酸甲酯(PEG-DMA)为交联剂，以偶氮二异丁腈(AIBN)为引发剂，与异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)共聚形成半互穿温敏凝胶。本发明所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，具有良好的可操作性，且所用试剂均为常规试剂，反应残余物容易去除，便于工业化实施。
Description
技术领域
本发明涉及一种功能高分子材料技术，特别涉及一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法。
背景技术
生长因子是组织工程研究的三要素(种子细胞、生物材料和生长因子)之一，它对于细胞的增殖、组织和器官的修复与再生具有重要的促进意义，但生长因子极易受外界环境影响而失去活性，半衰期较短，如果采用传统的将生长因子加入细胞培养液的方式，其诱导作用将很快失效，并且其暴释可能会引起细胞的癌变；有些研究将生长因子简单混入支架材料，或吸附于支架材料，这种方式往往无法控制生长因子的释放动力。因此，设计和制备更适宜的生长因子载体，能保护生长因子作用位点不受外界因素所破坏，并且能控制其缓慢释放，根据细胞分化增殖或组织修复的具体需要起到更好的促进作用，才是更有效的仿生手段。
肝素是一种天然生物活性多糖类化合物，其分子内含有与多种生长因子结合的位点，具有促进生长因子对细胞增殖、组织或器官修复和再生的作用【Jin K.L.，Mao X.O.，et al.Neurosci.Res.，2005，81：497】，当前肝素功能化生物材料受到极大关注，各种制备技术不断研发，如Liu等采用肝素涂层的方法，增强高分子材料抗凝血性能【Liu L.，Guo S.R.，Chang J.，et al.J.Biomed.Mater.Res.，2008，87B：244】；Aksoy等将聚氨酯材料表面氧化和羧基化后与肝素共价连接，研究了材料的细胞相容性【Aksoy A.E.，Hasirci V.，Hasirci N.Macromol.Symp.，2008，269：145】。但由于物理涂层方法的不稳定性和共价修饰方法容易破坏肝素活性等缺点，仿生控释载体设计应运而生。微球、水凝胶、微胶囊等都是良好的控释载体，它们能将生物活性物质装载在高分子结构中，在控释的同时也对生物活性分子起到保护作用，达到有效刺激细胞的增殖、分化和生长及引导组织再生的目的。由于肝素与多种生长因子存在相互作用，因此生长因子载体肝素化是提高其控释性能的有效方法【李娟，吴英锋，杨新林.有机化学，2010，30(3)：359】。Nilasaroya等通过甲基丙烯酸盐悬挂臂连接肝素制备了PVA-肝素水凝胶，研究表明该凝胶能增强FGF-2的生物活性【Nilasaroya A.，Poole-Warren L.A.，Whitelock J.M.，Martens P.J.Biomaterials，2008，29：4658】；Choi等采用巯基化肝素Hep-SH和PEG制备水凝胶，并装载人生长激素(hGH)，可以通过肝素的巯基化程度对hGH进行控制释放【Choi W.，Kim M.，Tae G.，Kim Y.H.Biomacromolecules，2008，9：1698】。研究表明，肝细胞生长因子(HGF)能诱导干细胞向肝细胞定向分化【Ong S.Y.，Dai H.，et al.Biomaterials，2006，27：4087】，参与肝脏的再生与修复【Huh C.G.，Factor V.M.，Thorgeirsson S.S.，et al.Proc Natl Acad Sci，2004，101(13)：4477】，肝素与HGF具有特异结合性，可以保护其避免因酸和热而失活，以及避免蛋白酶引起的降解，并可以控制其缓慢释放【Kim M.，Lee J.Y.，et al.Biomaterials，2010，31：3596】，使生长因子对细胞的诱导作用更持久。
甘草次酸(GA)存在于甘草的根、茎部，无毒，资源丰富，在传统中药处方中应用极其广泛，具有抗肝炎病毒，抑制肝癌细胞增殖并诱导其分化逆转为良性细胞，减轻肝细胞脂肪变及坏死，减轻肝细胞间质炎症反应，抑制肝细胞纤维增生，促进肝细胞再生，改善肝功能，提高机体免疫力等作用【Wasserman M.A.，Sundell C.L.，Kunsch C.，et al.Am J Cardiol，2003，91(3)：34】。研究表明，肝实质细胞膜表面还存在GA的受体，GA与肝细胞的结合位点具有高度特异性、饱和性和蛋白质性质，脂质体经GA修饰后具有良好的趋肝性和肝细胞靶向性，可在肝脏高度蓄积，广泛应用于肝脏疾病的治疗和肝脏保护中【Zhang J.，Zhang Q.，Chen X.，et al.Glycoconjugate Journal，2003，19：423】。鉴于GA对肝脏功能的各项优越性，本发明研发一种以GA为基材的适合肝细胞吸附与增殖的凝胶材料，由于在细胞培养过程中需要回收，如果采用传统酶解法，将损伤细胞功能，因此本发明将温敏物质聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)引入凝胶材料，以实现细胞脱附智能化。PNIPAAm分子内存在亲水基团(酰胺基)和疏水基团(异丙基)，其水溶液的较低临界溶解温度(LCST)为32℃，当温度低于32℃时，PNIPAAm分子链呈伸展状态，亲水基团暴露，表现亲水性，当温度高于32℃时，PNIPAAm分子链收缩，疏水基团暴露，表现疏水性。将PNIPAAm接枝到细胞培养板表面，可得到温敏性细胞培养板，在37℃细胞培养温度，细胞在其表面吸附、增殖，形成细胞片层后，将温敏细胞培养板移至低温环境(低于LCST)，利用PNIPAAm的亲疏水性变化，细胞从材料表面自动脱附。Okano研究小组利用电子束辐照法将温敏性聚异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)接枝到组织培养用聚苯乙烯表面，利用温度改变调控细胞吸附/脱附，进行了一系列的研究工作【Elloumi-Hannachi I.，Yamato M.，Okano T.J.Inter.Med.，2010，267：54-70】，取得了有意义的实验结果。
综上所述，本发明将肝素、甘草次酸、异丙基丙烯酰胺进行有机结合，通过原位自由基聚合，制备肝素化甘草次酸基半互穿温敏凝胶，通过这一复合材料发挥各材料的优越性，通过肝素化可以达到生长因子控释效果，通过甘草次酸的引入可以促进肝细胞的吸附与增殖，通过PNIPAAm的温度响应性可实现细胞的无损伤脱附，为开发新型肝组织工程支架材料提供新思路和技术支撑。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生长因子控释肝组织工程支架材料，该材料可以控释生长因子，促进肝细胞的吸附与增殖，实现细胞的无损伤脱附，其温度响应范围为25℃-37℃。本发明生长因子控释肝组织工程支架材料可由以下方法制得：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5∶1g，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g/mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1∶20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6∶1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将浓度为0.4～4mg/mL的肝素溶液加入NIPAAm和AAc-GA的DMF溶液，AAc-GA与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5∶1g，溶液浓度为0.1～0.4g/mL，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05～0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02～0.04g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50～100μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃～80℃下反应24～48h生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
本发明的目的也在于提供一种生长因子控释肝组织工程支架材料的制备方法，制备方法包括以下步骤：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5∶1g，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g/mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1∶20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6∶1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将浓度为0.4～4mg/mL的肝素溶液加入NIPAAm和AAc-GA的DMF溶液，AAc-GA与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5∶1g，溶液浓度为0.1～0.4g/mL，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05～0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02～0.04gAIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50～100μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃～80℃下反应24～48h生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
有益效果：本发明所设计的肝素化甘草次酸基半互穿温敏凝胶具有良好的综合性能，由于肝素与生长因子的特异结合性，此复合材料可通过肝素化达到对生长因子控释效果；由于甘草次酸具有与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)进行特异性结合的功能，它的引入增强了肝细胞在材料表面的吸附力，从而促进肝细胞在材料表面的增殖分化；通过PNIPAAm的温度响应性可实现细胞的无损伤脱附。由于所述的良好综合特性，本发明肝素化甘草次酸基半互穿温敏凝胶在肝组织工程支架材料、肝细胞培养基质材料等方面可以得到广泛应用。本发明所述制备方法工艺流程简单，实验条件温和，不需要特殊设备，投资成本低，具有良好的可操作性，且所用试剂均为常规试剂，反应残余物容易去除，便于工业化实施。
具体实施方式
以下给出本发明的具体实施例，但本发明不受实施例的限制。
实例1：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1g DCC，搅拌30min，加入0.579g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于10mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到3.5mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将8g GA-NH2溶于40mL DMF中，加入1.8mL AAc，用氮气保护，再加入0.03gsulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将1.8868g NIPAAm和1.8868g AAc-GA溶于10mLDMF，将浓度为3.2mg/mL的肝素溶液加入其中室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃下反应48h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例2：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入1.16g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到4.7mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将3g GA-NH2溶于10mL DMF中，加入0.75mL AAc，用氮气保护，再加入0.03gsulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将1.8868g NIPAAm和1.8868g AAc-GA溶于10mLDMF，将浓度为0.8mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.04g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入100μl 2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，80℃下反应24h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实验3：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.579g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到4.7mL乙二胺(EDA)中，混合液在50℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将8g GA-NH2溶于20mL DMF中，加入2mLAAc，用氮气保护，再加入0.03g sulfo-NHS活化剂和0.1g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将1.8868g NIPAAm和1.8868g AAc-GA溶于10mLDMF，将浓度为1.6mg/mL的肝素溶液加入其中室温下搅拌，通氮气10min后加入0.0925g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.0328g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入64μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，60℃下反应48h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例4：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入3g DCC，搅拌30min，加入0.71g SuOH，在-10℃下继续搅拌3h，然后在不高于20℃的室温下搅拌18h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到9.3g乙二胺(EDA)中，混合液在50℃下反应30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将5g GA-NH2溶于30mL DMF中，加入1mL AAc，用氮气保护，再加入0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05g EDC缩合剂，室温下反应30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将2.0848g NIPAAm和0.8935g AAc-GA溶于10mL DMF，将浓度为1.6mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.04g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃下反应36h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例5：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入1.42g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到7mL乙二胺(EDA)中，混合液在60℃下反应24h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将3g GA-NH2溶于10mL DMF中，加入0.6mL AAc，用氮气保护，再加入0.01gsulfo-NHS活化剂和0.05g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将2.0848g NIPAAm和0.8935g AAc-GA溶于10mL DMF，将浓度为0.4mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.04gAIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入100μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，80℃下反应24h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例6：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.965g SuOH，在-10℃下继续搅拌2h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于15mLDMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到2.3mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将3g GA-NH2溶于20mLDMF中，加入0.5mLAAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.05EDC缩合剂，室温下反应30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将2.2141g NIPAAm和0.2460g AAc-GA溶于10mL DMF，将浓度为0.8mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.0925g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.0328gAIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入64μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，60℃下反应48h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例7：
(1)甘草次酸氨基化改性
将5.79g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入3g DCC，搅拌30min，加入1.16g SuOH，在-10℃下继续搅拌4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将2.03g GSE溶于20mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到7mL乙二胺(EDA)中，混合液在80℃下反应20h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将5gGA-NH2溶于20mLDMF中，加入1mLAAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.07g EDC缩合剂，室温下反应20h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将2.0848g NIPAAm和0.8935g AAc-GA溶于10mLDMF，将浓度为3.2mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃下反应48h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
实例8：
(1)甘草次酸氨基化改性
将2.895g甘草次酸(GA)溶于30mL四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1.77g DCC，搅拌30min，加入0.71g SuOH，在-10℃下继续搅拌3h，然后在不高于20℃的室温下搅拌18h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)。将1.015g GSE溶于15mL DMF，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到3.5mL乙二胺(EDA)中，混合液在60℃下反应24h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)。
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将5g GA-NH2溶于20mL DMF中，加入1mLAAc，用氮气保护，再加入0.01g sulfo-NHS活化剂和0.07g EDC缩合剂，室温下反应24h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)。
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将2.0848g NIPAAm和0.8935g AAc-GA溶于10mL DMF，将浓度为0.4mg/mL的肝素溶液加入其中，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.0925g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.0328gAIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入64μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，60℃下反应48h，生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
Claims (10)
1.一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法，其特征在于所述生长因子控释温敏凝胶具有生长因子控释作用，可以促进肝细胞的吸附与增殖，温度响应范围为25℃-37℃，可实现细胞的无损伤脱附，所述生长因子控释温敏凝胶可由下述方法制得：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5∶1g，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)，将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g/mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1∶20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)；
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6∶1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)；
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将浓度为0.4～4mg/mL的肝素溶液加入NIPAAm和AAc-GA的DMF溶液，AAc-GA与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5∶1g，溶液浓度为0.1～0.4g/mL，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05～0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02～0.04g AIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50～100μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃～80℃下反应24～48h生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶，将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
2.根据权利要求1所述的生长因子控释温敏凝胶，其特征在于所述生长因子控释温敏凝胶具有生长因子控释作用，可以促进肝细胞的吸附与增殖，温度响应范围为25℃-37℃，可实现细胞的无损伤脱附。
3.一种生长因子控释温敏凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)甘草次酸氨基化改性
将甘草次酸(GA)溶于四氢呋喃(THF)，冷却至-10℃，加入1～3g DCC，搅拌30min，加入N-羟基丁二酰亚胺(SuOH)，GA与SuOH的质量比为3～5∶1g，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，在-10℃下继续搅拌2～4h，然后在不高于20℃的室温下搅拌15～20h，滤去二环己基脲(白色固体)，将所得溶液倾入体积为3倍的无水乙醚中，静置过夜，得到白色沉淀，过滤，用无水乙醚洗涤，真空干燥，得白色粉末状甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)，将GSE溶于DMF，溶液浓度为0.05～0.1g/mL，用恒压滴液漏斗缓慢滴加到乙二胺(EDA)中，GSE与EDA摩尔比为1∶20～40mol，混合液在50℃～80℃下反应20～30h后，减压蒸馏至无馏分流出，将浓缩液滴加到蒸馏水中，有白色沉淀产生，过滤，用蒸馏水洗涤多次，以除去DMF和EDA，冷冻干燥，得白色粉末状甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)；
(2)甘草次酸乙烯基单体(AAc-GA)的合成
将GA-NH2溶于DMF中，溶液浓度为0.1～0.5g/mL，加入AAc，GA-NH2与AAc质量比为4～6∶1g，用氮气保护，再加入0.01～0.03g sulfo-NHS活化剂和0.05～0.1g EDC缩合剂，室温下反应20～30h，过滤，将反应后的混合物中白色沉淀脲滤去，在搅拌下把滤液滴加到蒸馏水中，静置过夜，出现白色沉淀，过滤，干燥，得到白色粉末状乙烯基甘草次酸单体(AAc-GA)；
(3)肝素化甘草次酸半互穿温敏凝胶的合成
将浓度为0.4～4mg/mL的肝素溶液加入NIPAAm和AAc-GA的DMF溶液，AAc-GA与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5∶1g，溶液浓度为0.1～0.4g/mL，室温下搅拌，通氮气10min后加入0.05～0.1g MBAA交联剂，待完全溶解后，再加入0.02～0.04gAIBN引发剂，继续氮气保护10min，滴入50～100μl2％的TEMED，搅拌10min后撤掉氮气保护，并马上将溶液倒入模具中，密封，50℃～80℃下反应24～48h生成P(NIPAAm-co-AAc-GA)凝胶。将凝胶切成圆片，在DMF中浸泡2d，然后在蒸馏水中浸泡4d，每天换液，除去未反应的单体。
4.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(1)中甘草次酸琥珀酰亚胺活性酯(GSE)与乙二胺(EDA)摩尔比为1∶20～40mol，反应温度为50℃～80℃。
5.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(2)中甘草次酸胺类衍生物(GA-NH2)与丙烯酸(AAc)质量比为4～6∶1g。
6.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(3)肝素溶液浓度为0.4～4mg/mL。
7.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(3)中AAc-GA与(AAc-GA+NIPAAm)的质量比为0～0.5∶1g。
8.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(3)中交联剂MBAA用量为0.05～0.1g。
9.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(3)中引发剂AIBN用量为0.02～0.04gAIBN，反应温度为50℃～80℃。
10.根据权利要求1，3所述一种生长因子控释温敏凝胶制备方法，其特征在于所述步骤(3)中反应温度为50℃～80℃。
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| CN 201210532835 CN102961782A (zh) | 2012-12-11 | 2012-12-11 | 一种生长因子控释温敏凝胶及其制备方法 |
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| CN110213964A (zh) * | 2016-11-22 | 2019-09-06 | 纽泰克温图斯公司 | 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备 |
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2012
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| CN103948962B (zh) * | 2014-05-09 | 2015-07-22 | 天津工业大学 | 一种结合生长因子型温敏水凝胶生物载体的制备方法 |
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| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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