CN110213964A - 利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备 - Google Patents

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Abstract

公开了封闭的微型装置和使用该装置用于培养细胞的方法。具体地，提供一种装置，以及使用该装置用于制备、扩增、分化和/或重编程用于个体化医疗的细胞以便能够在医护现场即时实施医疗程序的方法。

Description

利用封闭微型细胞培养系统的个体化细胞生物制备
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年11月22日提交的美国临时专利申请号62/425,141的优先权，该专利申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
本公开大体涉及在封闭微型细胞培养系统中对细胞的个体化培养、重编程、扩增、分化和/或下游处理，细胞诸如原代人细胞、原代人肿瘤细胞、人多能干细胞(hPSC)(包括诱导的人多能干细胞(hESC)和人胚胎干细胞(iPSC))以及它们的衍生物(即，从hPSC分化的细胞)。尤其是，本公开涉及一种封闭装置，该封闭装置用于制备、扩增、分化和/或重编程用于个体化医疗的细胞，以便能够在医护现场即时(即，在患者护理的时间和地点)进行医疗程序。
自体细胞是指来自患者的细胞，因此对在细胞疗法中使用具有吸引力，这是因为移植到患者后，它们可诱导极小的免疫排斥或不诱导免疫排斥。自体细胞包括从患者分离的原代细胞，如T细胞、软骨细胞和间充质干细胞。这些细胞可以用来治疗许多不能治疗或者当前的治疗不能改变它们进展的人类疾病。
自体细胞还包括患者特异性的诱导的人多能干细胞(iPSC)。通过将一些重编程因子传递到细胞内，来自患者的成体细胞(例如，成纤维细胞)可以在大约一个月内重编程为iPSC。iPSC可以在完全限定的条件下长时间培养并大量扩增。它们可以进一步分化成人体几乎所有的细胞类型。
自体细胞也包括来自患者的原代肿瘤细胞，如胶质母细胞瘤细胞。这些细胞可以用于筛选能够特异并有效杀死患者肿瘤细胞的药物。
然而，在负担得起生物处理方法之前，基于自体细胞的个体化医疗无法使大量患者受益。利用现有技术和生物处理方法生物制备个体化细胞的费用极高。例如，为了用现有生物处理方法制备基于患者特异性iPSC的自体细胞，对患者细胞进行收集并培养若干天；然后，向这些细胞递送重编程因子以将它们重编程成iPSC(需要约一个月)。接下来，利用各种分析，对高质量的iPSC克隆进行选择、扩增并表征其多能性和基因组完整性(大约需要一到两个月)，然后，将iPSC扩增并分化成所需的细胞。最后，对所生产的细胞进行纯化，表征其同一性、纯度和效力，并对其进行配制用于移植。整个生物处理方法需要几个月的时间，主要是通过人工操作使用2D开放式培养系统(例如，2D细胞培养瓶)完成的，这种处理方法重复性低、污染风险高且需要高度熟练的技术人员。此外，2D培养体系产量低。例如，每平方厘米表面积只能生产～2x105个细胞，这意味着需要～85块六孔培养板来生产足以用于一名患者的细胞(～1x109个细胞)。维持这些培养板需要大的培养箱和cGMP设施空间、劳动力和试剂。
如果大量患者需要基于iPSC的个体化细胞疗法，细胞生产只能在大的细胞生物制备中心进行(即，集中式细胞生物制备)。患者的细胞被送到该中心，所生产的细胞被送回医护现场用于移植。这种集中式的生物制备还有其他缺点，包括：(i)交叉污染和(ii)与运输、物流、跟踪和记录相关的高成本和风险。综上所述，用现有技术生物制备个体化iPSC及其衍生物的成本对于大多数患者来说是无法承受的。
大大降低生物制备成本的一种方法是在个体化、封闭的计算机控制的微型细胞培养装置中自动进行生物处理，以在医护现场即时对细胞进行生物制备(即，箱中cGMP(cGMP-in a box)生产)。使用封闭培养装置避免了污染风险，且无需cGMP处理。所有关键操作的自动化避免了产出变化，减少了对高度熟练操作人员的需求。在医护现场即时进行生物制备降低了物流和运输相关的成本和风险。培养系统的小型化使得在医护现场同时为大量患者生物制备细胞(即，高通量生物制备)成为可能。
基于上述，本领域需要一种用于制备、扩增、分化和重新编程细胞的封闭微型装置，尤其是可用于医护现场个体化医疗的规模的封闭微型装置。如果该封闭装置制成一次性的，以限制交叉污染，这将更为有利。
发明内容
本公开大体涉及在封闭培养系统中对细胞进行培养、重编程、扩增、分化和下游处理。尤其是，本公开涉及包括封闭壳体的封闭培养系统和装置，该封闭壳体能被用于制备、扩增、分化细胞，然后进一步用于浓缩、纯化和运输所培养的细胞。
在一方面，本公开涉及用于培养用于个体化医疗的细胞的装置，该装置包括：包括三维(3D)水凝胶支架的封闭壳体；用于将细胞培养基引入到壳体的入口；以及用于将细胞培养基从壳体排出的出口。
在另一方面，本公开涉及使用该装置扩增细胞的方法，该方法包括：在封闭壳体的3D水凝胶支架中悬浮包括细胞的细胞溶液；从入口向封闭壳体引入细胞培养基；以及，对细胞进行培养。
在又一方面，本公开涉及使用该装置分化细胞的方法，该方法包括：在封闭壳体的3D水凝胶支架中悬浮包括细胞的细胞溶液；从入口向封闭壳体引入细胞分化培养基；以及对细胞进行培养。
在另一方面，本公开涉及使用该装置重编程细胞的方法，该方法包括：在封闭壳体的3D水凝胶支架中悬浮包括成体细胞的细胞溶液；从入口向封闭壳体引入细胞培养基；以及对细胞进行重编程。
根据本公开，已经发现各种方法出人意料地允许在封闭微型培养系统中对细胞进行培养、制备、扩增、分化和重编程。本公开的方法和装置将对个体化医疗产生重大影响，这是因为它们使得可在医护现场使用的充足、高质量且负担得起的细胞变为可能。此外，这些设备和方法通过以限制污染和交叉污染的方式提供更经济的方法来制备、扩增、分化和重编程细胞，从而对生物制药行业产生有利影响。
附图说明
当考虑本公开的以下具体实施方式时，本公开将更好理解，且上述以外的特征、方面和优势将变得显而易见。该具体实施方式参考了以下附图，其中：
图1A-1C示出了本公开中所述的用于个体化细胞生物制备的封闭微型细胞培养装置。图1A示出了该装置的示意图。图1B是标示了入口和出口的细胞培养装置的图片。图1C是细胞培养装置内水凝胶纤维中的细胞团的图片。
图2A-2C示出了在封闭微型细胞培养装置中的个体化iPSC扩增并分化成神经干细胞(NSC)。图2A图示了本公开中所述的生物处理方法。图2B示出了微型细胞培养装置210，其包括用于培养基灌注的泵212、用于储存培养基的透氧塑料袋214和封闭的15ml锥形管216。此外，示出了带有细胞的纤维状水凝胶纤维悬浮在管内。图2C示出了在第0天将单iPSC与10％的PNIPAAm-PEG溶液在4℃混合，并将其注入15ml锥形管中的室温细胞培养基中，以立即与细胞形成水凝胶纤维；将细胞在E8培养基中培养5天；将细胞在锥形管中的神经诱导培养基中另外再培养7天，以对细胞进行分化(连续灌注培养基)；将细胞培养管在冰上放置5分钟使水凝胶支架液化；在100g将试管离心3分钟使细胞球沉淀(去除培养基)；纯化细胞；向试管中加入包被有抗-SSEA4抗体的磁珠以将未分化的SSEA4+iPSC用磁性细胞分离器拉下来(pull down)；将上清液中的纯化细胞转移到新的封闭管中，并将封闭管运送到手术室；用立体定向注射器将NSC移植到大鼠脑中。具体来说，如纯化步骤所示，在37℃将细胞球在Accutase中孵育10分钟。从培养管中移除试剂，用无菌注射器穿过隔膜盖将新试剂加入培养管中。
图3A-3E示出了本公开的微型生物处理方法中的细胞。图3A是生物处理方法第0、5和12天水凝胶纤维和细胞的相位图。图3B示出了第12天细胞的活/死染色。图3C显示～97％的纯化细胞产物表达了NSC标记物，PAX6和巢蛋白。图3D显示被抗SSEA4磁珠拉下来的细胞呈Oct4和Nanog阳性。图3E显示移植7天后大鼠脑内HuNu+(人核抗原)NSC存活良好。
图4A-4E示出了如本公开中所述在藻酸盐中空纤维中对细胞进行培养。图4A是示意图，显示将含有单细胞的透明质酸(HA)溶液320和藻酸盐溶液322分别泵入到自制微型挤出机的中央324和侧通道326中，以形成被挤入到CaCl2缓冲液328(100mM)的同轴核壳流，CaCl2缓冲液328立即与藻酸盐交联形成水凝胶壳来制得中空纤维。随后，用细胞培养基替换CaCl2缓冲液，将细胞悬浮并生长于中空纤维的核心微小空间中。图4B显示在最初24小时内，单细胞相联形成小团簇(即，初始成簇阶段)。随后这些小团簇扩增成球(图4C)，球最终融合形成柱状细胞团块(图4D)(即，细胞生长阶段)。图4E示出了第9天在一个中空纤维中的柱状细胞团块。
图5A和图5B示出了如本公开中所述在封闭微型细胞培养装置中使用藻酸盐水凝胶中空纤维进行个体化iPSC扩增和分化成NSC。图5A示出了生物处理方法的示意图示。如图5B中所示，将iPSC和水凝胶纤维挤入到封闭的15ml管中，在自动培养基灌注的条件下将中空纤维中的iPSC于扩增培养基中扩增5天。然后在分化培养基中培养7天将iPSC分化成NSC。添加0.5mM的EDTA溶解纤维，通过重力收获细胞球。然后利用Accutase将细胞球分散成单细胞。用抗SSEA-4磁珠耗尽未分化的iPSC。将细胞产物转移到新的培养管中并通过离心浓缩。将细胞运送到手术室并进行移植。
图6A-6J示出了如本公开中所述在微型生物处理中使用藻酸盐水凝胶中空纤维进行iPSC扩增并分化成NSC。图6A是在水凝胶纤维中生长第0天(单iPSC)、第5天(iPSC球)以及第5+7天(NSC聚集体)的细胞的相位图。在第5+7天，细胞扩增400倍(图6B)，产量为4.1x108个细胞/ml(图6C)，细胞存活率>95％(图6D)。98％的细胞为SSEA阴性(图6E)，且检测到极少量的死亡细胞(通过活/死细胞染色)(图6F)。图6G和图6H显示包被了抗SSEA4抗体的磁珠拉下来的细胞中，>99％是Nanog+/Oct4+未分化的iPSC。图6I显示纯化的细胞产物中>99％是PAX6+/Nestin+的NSC。图6J显示移植7天后纯化的NSC在大鼠脑中存活良好。HuNu：人核抗原。
图7示出了重编程3周后在本公开的装置中使用的3D水凝胶中形成的iPSC克隆。
尽管本公开容许各种修改和替代形式，但其具体实施方案已在附图中以示例的形式示出，并在下文中详细描述。然而，应当理解的是，具体实施方案的描述并不意图对本公开进行限制，本公开涵盖由所附权利要求所限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物/等同方式和替代物/替代方式。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文所述方法和材料类似或等同的任何方法和材料可用于本公开的实践或测试中，但优选方法和材料如下所述。
根据本公开，已经发现装置和方法出人意料地能用于在封闭微型系统中对细胞进行培养、重编程、扩增、分化和下游处理，从而使得产生有限的污染、成本低、细胞产量和纯度高，以及易于提供个体化医疗。尤其是，本公开提供封闭微型装置和使用该装置用于在封闭微型系统中使用3D水凝胶支架制备、扩增、分化和重编程细胞的方法。
用于培养/制备/扩增/分化/重编程细胞的装置
有利的是，本公开的装置能够在医护现场生物制备充足且负担得起的个体化细胞。此外，该装置在限制污染的同时提供高的细胞产量和纯度。大体而言，该装置包括封闭微型壳体、带有过滤器的入口以及带有过滤器的出口，壳体包括带有细胞的水凝胶支架，入口用于使细胞培养基流入到壳体中，出口用于让排出的培养基流出壳体。如本文所使用的，“微型”是指该装置包括容量低于10L的壳体，包括约1ml至低于10L的容量，包括约1ml至约1000ml的容量。
更具体地，如图1A所示，装置100包括封闭壳体110、入口120和出口130。如本文所使用的，“封闭装置”、“封闭系统”和/或“封闭壳体”中提及的“封闭”是指该装置、系统和/或壳体是密封的，使得物质与其周围环境的交换只能通过带有过滤器121、123的入口和出口来进行。过滤器121、123能防止环境中的病毒和细菌进入细胞培养装置。更具体地，该封闭装置、系统和/或壳体适当地阻止至少70％的周围环境物质进入该装置、系统和/或壳体，更适当地为阻止至少75％，甚至更适当地为至少80％，甚至更适当地为至少90％，更适当地为至少95％(包括96％、97％、98％、99％甚至100％)的周围环境物质进入该设备、系统和/或壳体。
图1A中所示的封闭壳体110是封闭的50ml锥形管，然而，本领域技术人员应当理解的是，本领域已知的任何封闭的培养系统，例如更大的锥形管或小体积的塑料袋。通常，当使用锥心管时，管的尺寸为1ml至约10L的容量，包括约1ml至约1L的容量，以及包括约5ml到约50ml的容量。当使用塑料袋时，袋的容量为约1ml至约10L且包括约1ml至约1L。
封闭壳体110包括三维(3D)水凝胶支架112。3D水凝胶是通过将带有细胞的水凝胶前体溶液穿过细胞培养装置的隔膜盖122(图1B)挤入到细胞培养装置中含有交联试剂的缓冲液中来制备的，该缓冲液可快速将水凝胶前体溶液交联成水凝胶。
通常，使用水凝胶技术领域中已知的任何聚合物来制备3D水凝胶支架112用于培养、制备、扩增、分化和/或重编程细胞。例如，在合适的实施方案中，使用聚合物诸如聚(乙二醇)-(N-异丙基丙烯酰胺)等将3D水凝胶支架制备为热可逆水凝胶支架。在另外其他合适的实施方案中，3D水凝胶支架是由藻酸盐聚合物制备的。合适的藻酸盐聚合物包括任何市售或自行纯化的藻酸盐聚合物，诸如例如来自Sigma公司的藻酸或藻酸钠(+W201502)，以及改性的藻酸盐聚合物诸如甲基丙烯酸改性的藻酸盐。
大体上，用于在本公开的装置的封闭壳体中使用的3D水凝胶支架呈本领域已知的任何形式，包括例如片材、纤维、中空纤维、球体以及它们的组合。
大体上，细胞封装在水凝胶支架中。在一些合适的实施方案中，细胞悬浮于水凝胶中空纤维所产生的中空空间中。细胞包括从人类分离的原代细胞，诸如T细胞、软骨细胞、间充质干细胞。细胞还包括诱导的人多能干细胞、人胚胎干细胞以及它们的衍生物(即，从它们分化来的细胞)。细胞还包括原代人肿瘤细胞。虽然本文在人类细胞的背景中进行了描述，但本领域技术人员应当理解，本公开的装置可以用于任何其他动物细胞，而不会偏离本公开的范围。
此外，在一个实施方案中，细胞是自体细胞，因为它们是来自期望被治疗的同一患者的细胞。在另一实施方案中，细胞是同种异体细胞(即，在另一地点形成并被运输)。
本公开的装置进一步包括入口120和出口130。入口120允许细胞培养基进入封闭壳体110，出口130允许细胞培养基从封闭壳体110出去。在特定实施方案中，有利地包括与入口120流体连通的泵(未示出)，从而将细胞培养基从培养基储库124泵送至封闭壳体110。虽然描述了与泵连通，但本领域技术人员应当理解，在不偏离本公开范围的情况下，可以在本公开的装置100中使用将细胞培养基从培养基储库124流动到封闭壳体110的任何方法。
一旦用于细胞培养，将细胞培养基穿过封闭壳体110进行自动灌注，并通过出口130从封闭壳体110排出到排出培养基储库132。
细胞培养基可以是细胞培养技术领域中已知的适于支持细胞存活、生长、扩增和分化的任何培养基。通常，细胞培养基会包括但不限于碳源、氮源以及生长因子。用于在培养细胞中使用的具体细胞培养基将取决于待培养的细胞类型。细胞培养条件也会因细胞类型、细胞扩增的量以及所需细胞的数量而不同。
对细胞进行培养/制备/扩增/分化/重编程的方法
本公开的方法可用于在个体化规模上对细胞进行培养。如本文所使用的，“培养细胞”或“对细胞进行培养”等是指在本公开的装置内制备、扩增、分化和/或重编程细胞。“重编程”是指将成体细胞转换回iPSC，或者从一种成体细胞类型转换成另一种细胞类型。相比于传统细胞培养方法，本公开的方法提供至少以下优点：(1)能够高体积产量地生物制备细胞，每毫升水凝胶支架可以生产至少2x107个细胞。通常每毫升水凝胶支架可以生产5x108个细胞；(2)能够在医护现场利用微型装置进行个体化医疗；(3)由于封闭培养和医护现场程序消除了细胞培养运输过程中污染的风险，允许限制污染和/或交叉污染；以及(4)批次与批次间的变化小。此外，使用水凝胶支架用于扩增和分化细胞的方法提供额外的益处：(1)为细胞生长提供3D空间；以及(2)提供防止细胞集聚和分离剪切力的物理屏障，它们是导致传统3D悬浮细胞技术中细胞生长和细胞体积产量低下的主要因素。使用该装置用于重编程细胞的方法提供另外的益处，即仅允许成功重编程的细胞在3D水凝胶支架中生长，从而高纯度地生成细胞。
能使用本文所述的方法和装置进行培养、制备、扩增、分化和/或重编程的此类细胞的非限制性示例包括从人分离的原代细胞(即，人原代细胞)诸如T细胞、软骨细胞以及间充质干细胞。细胞还包括诱导的人多能干细胞、人胚胎干细胞以及它们的衍生物(即，从它们分化而来的细胞)。细胞还包括原代人肿瘤细胞。细胞还可以是动物细胞，例如诱导的猪多能干细胞或原代猪细胞。虽然使用iPSC进行了更充分地描述，但应认识到本文所述的方法和装置可以用于上述任何类型的细胞，而不会偏离本公开的范围。
大体而言，培养细胞的方法包括：将细胞封装在水凝胶支架中或将细胞悬浮于封闭壳体的水凝胶中空纤维所产生的中空空间中；向包括悬浮于水凝胶支架的细胞的封闭壳体引入细胞培养基，使得能够进行细胞的扩增、分化或重编程；以及，对细胞进行培养。
在每毫升1个到数十亿个细胞不等的浓度将细胞封装或悬浮于水凝胶支架中，每毫升可以扩增至高达6.0X 108个细胞。
在合适的实施方案中，将细胞封装在水凝胶支架中。在其他合适的实施方案中，将细胞悬浮于由水凝胶中空纤维所产生的中空空间中。
接下来将细胞培养基引入到封闭壳体中用于对细胞进行培养。细胞培养基可以是细胞培养技术领域已知的适于支持细胞存活、生长、扩增、分化和重编程的任何培养基。通常，细胞培养基会包括但不限于碳源、氮源以及生长因子。用于在培养细胞中使用的具体细胞培养基将取决于待培养的细胞类型。
细胞培养条件将会因细胞类型、细胞扩增/分化/重编程的量以及所需细胞的数量而不同。一旦达到充分的细胞扩增/分化/重编程和所需的细胞数量，则通过化学方式或物理方式溶解壳体内的3D水凝胶支架来将细胞从3D水凝胶支架释放。在一方面，使用化学溶解剂将支架进行溶解，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)或者藻酸盐裂解酶溶液(可从Sigma-Aldrich公司购得)。在另一方面，使用物理方法将水凝胶支架进行溶解，诸如将温度降至低于4℃。细胞在3D水凝胶支架内的持续时间通常从几天到几个月不等。
细胞在个体化医疗中是有用的，且可以在医护现场使用。举例来说，细胞可以用于患者床旁的程序。可以有效地且事实上按退行性疾病和损伤治疗、药物筛选、表达蛋白质等中使用的大小和数量来制备细胞。另外，细胞可以用于制备蛋白质和疫苗。在还有其他方面，细胞可以用于组织工程。
在考虑以下非限制性实施例后，将更充分地理解本公开。
实施例
除非另有说明，否则中空纤维是按如上所述制备的。
实施例1
在本实施例中，对来自诱导的多能干细胞(iPSC)的神经干细胞(NSC)的扩增和生长进行了分析。
方法
微型生物处理：使用注射器，将含有iPSC的4℃的PNIPAAm-PEG溶液注射入15ml锥形管中的室温E8培养基中。立即形成纤维状水凝胶。用变速蠕动管泵(美国的ControlCompany公司)穿过隔膜盖将培养基连续灌注到管内。培养基储存在密封的透氧塑料袋中。袋中的培养基每天更换。细胞培养管、泵和培养基袋放置在37℃的细胞培养箱中。在第1天至第5天、第6天至第12天分别使用E8培养基和神经诱导培养基。在第12天，将细胞培养管在冰上放置5分钟以液化水凝胶并释放细胞球。通过在100g离心培养管5分钟来收集细胞。将细胞团在37℃用Accutase处理10分钟，分散成单细胞。通过在300g离心5分钟来收集单细胞。用80μl的PBS缓冲液重悬细胞，加入20μl抗SSEA-4微珠(Miltenyi Biotec)并在4℃孵育15分钟。利用磁力将SSEA4+iPSC拉下来，将上清液中的NSC转移到新的培养管中。在300g离心5分钟将细胞沉淀并运送到手术室用于移植。
细胞移植：动物实验是按照内布拉斯加州立大学林肯分校动物管理和使用委员会批准的方案进行的。Sprague-Dawley雌性老鼠来源于Charles River。在移植前1天开始对动物腹膜内注射环孢菌素A(10mg/kg，LC Laboratories)。为了移植，用2-4％异氟醚对动物进行麻醉。使用10μl Hamilton注射器(Hamilton Company，USA)与立体定向架(RWD LifeScience Inc.)将悬浮于4μl DMEM培养基中的2×105个细胞以0.5μl/min的速度注射入纹状体(AP+0.5mm；ML±3.0mm；DV-6mm)。在第7天，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠，灌注PBS，之后灌注4％多聚甲醛。固定后，用Leica冷冻切片机对脑进行连续切片(厚度40μm)，并用抗体对游离漂浮切片进行染色。
为了对脑切片进行染色，接着将样品与PBS+0.25％Triton X-100+5％山羊血清+一抗在4℃孵育48小时。充分洗涤之后，加入在2％BSA中的二抗，并在4℃孵育4小时。
结果
利用PNIPAAm-PEG水凝胶中的高细胞产量，构建了本公开的原型装置，以便由hPSC制备用于个体化细胞疗法的NSC(图2A-2K和图3A-3E)。在第0天，在4℃将单iPSC与10％的PNIPAAm-PEG溶液混合。利用注射器，将混合物注射到在带隔膜盖的封闭无菌的15ml锥形管中的室温E8培养基中(图2C)。立即形成纤维状水凝胶(直径～1mm)，伴随着单iPSC均匀地分布于水凝胶中。在37℃和5％的CO2的细胞培养箱中对细胞进行培养。将储存于透气袋中的培养基连续灌注到细胞培养管中(图2B)。供应5天E8培养基(图2C)，之后另外供应7天神经诱导培养基(图2C)。在第7天，将细胞培养管在冰上放置5分钟使水凝胶支架液化(图2C)。在100g离心3分钟将细胞球沉淀(图2C)。移除培养基。在37℃将细胞球在Accutase中孵育10分钟(图2C)。将试剂从培养管中移除和向培养管中加入试剂是利用无菌注射器穿过隔膜来进行的。将包被有抗SSEA4抗体的磁珠加入到培养管中，以利用磁性细胞分离器将未分化的SSEA4+iPSC拉下来(图2C)。将上清中的纯化细胞转移到新的封闭管中(图2C)并运送到手术室。用立体定向注射器将NSC移植到SCID小鼠的脑中(图2C)。
水凝胶纤维中的单iPSC在第5天生长成iPSC球，接着在第12天变成NSC球(图3A)。在初始接种密度为1x106个细胞/ml的情况下，第7天达到25倍扩增和2.5x107个细胞/ml水凝胶。在15ml锥形管中的4ml水凝胶中生产了总计1.0x108个细胞。在第7天细胞存活率>95％。第7天的细胞中有2％是SSEA4+。细胞染色显示没有或未检测到死细胞(图3B)。磁性分离后，所生产的细胞表达PAX6和巢蛋白(图3C)，而Oct4+/Nanog+细胞未被检测到。被磁珠拉下来的细胞表达Oct4+和Nanog二者(图3D)。移植7天后，在小鼠脑中发现大量人核抗原阳性(HuNu+)的细胞(图3E)。
实施例2
在本实施例中，对来自诱导的多能干细胞(iPSC)的神经干细胞(NSC)的扩增和生长进行了分析。
方法
微型生物处理：使用自制微型挤出机来加工藻酸盐中空纤维。将含有单细胞的透明质酸(HA)溶液和藻酸盐溶液分别泵入到自制微型挤出机的中央和侧通道，并挤出至15ml锥形管中的CaCl2缓冲液(100mM)来制备中空纤维(图4A、5A和5B)。随后，用细胞培养基替换CaCl2缓冲液。用变速蠕动管泵(美国的Control Company公司)穿过隔膜盖将培养基连续灌注到管内。培养基储存在密封的透氧塑料袋中。袋中的培养基每天更换。细胞培养管、泵和培养基袋放置在37℃的细胞培养箱中。在第1天至第5天、第6～12天分别使用E8培养基和神经诱导培养基。在第12天，向培养管中泵入0.5mM EDTA。藻酸盐中空纤维在5分钟内溶解。通过在100g离心培养管5分钟来收集细胞。将细胞团在37℃用Accutase处理10分钟，分散成单细胞。通过在300g离心5分钟来收集单细胞。用80μl PBS缓冲液重悬细胞，加入20μl抗SSEA-4微珠(Miltenyi Biotec)并在4℃孵育15分钟。利用磁力将SSEA4+iPSC拉下来，将上清液中的NSC转移到新的培养管中。在300g离心5分钟将细胞沉淀并运送到手术室用于移植。
细胞移植：动物实验是按照内布拉斯加州立大学林肯分校动物管理和使用委员会批准的方案进行的。Sprague-Dawley雌性老鼠来源于Charles River。在移植前1天开始对动物腹膜内注射环孢菌素A(10mg/kg，LC Laboratories公司)。为了移植，用2-4％异氟醚对动物进行麻醉。使用10μl Hamilton注射器(Hamilton Company，USA)与立体定向架(RWDLife Science Inc.)将悬浮于4μl DMEM培养基中的2×105个细胞以0.5μl/min的速度注射入纹状体(AP+0.5mm；ML±3.0mm；DV-6mm)。在第7天，用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉大鼠，灌注PBS，之后灌注4％多聚甲醛。固定后，用Leica冷冻切片机对脑进行连续切片(厚度40μm)，并用抗体对游离漂浮切片进行染色。
为了对脑切片进行染色，接着将样品与PBS+0.25％Triton X-100+5％山羊血清+一抗在4℃孵育48小时。充分洗涤之后，加入在2％BSA中的二抗，并在4℃孵育4小时。
结果
利用藻酸盐中空纤维中的高细胞产量，构建了本公开的原型装置，以便由hPSC制备用于个体化细胞疗法的NSC(图4A-4E，图5A和图5B)。在第0天，将单iPSC与1％的HA溶液混合。利用微型挤出机，将含有单细胞的HA溶液320和藻酸盐溶液322分别泵入到微型挤出机的中央324和侧通道326，并挤出至到封闭的15ml锥形管中的CaCl2缓冲液328(100mM)来制备中空纤维(图5B)。在37℃和5％的CO2的细胞培养箱中对细胞进行培养。将储存于透气袋中的培养基连续灌注到细胞培养管中(图5B)。供应5天E8培养基(图5B)，之后另外供应7天神经诱导培养基(图5B)。在第7天，将细胞培养管在冰上放置5分钟使水凝胶支架液化(图5B)。在100g离心3分钟将细胞球沉淀(图5B)。移除培养基。在37℃将细胞球在Accutase中孵育10分钟(图5B)。将试剂从培养管中移除和向培养管中加入试剂是利用无菌注射器穿过隔膜来进行的。将包被有抗SSEA4抗体的磁珠加入到培养管中，以利用磁性细胞分离器将未分化的SSEA4+iPSC拉下来(图5B)。将上清中的纯化细胞转移到新的封闭管中(图5B)并运送到手术室。用立体定向注射器将NSC移植到SCID小鼠的脑中(图5B)。
水凝胶纤维中的单iPSC在第5天生长成iPSC球，接着在第12天变成NSC球(图6A)。在初始接种密度为1x106个细胞/ml的情况下，第7天达到400倍扩增和4.0x108个细胞/ml水凝胶。在15ml锥形管中的4ml水凝胶中生产了总计1.6x109个细胞。在第7天细胞存活率>95％。第7天的细胞中有2％是SSEA4+。细胞染色显示没有或未检测到死细胞(图6F)。磁性分离后，所生产的细胞表达PAX6和巢蛋白，而Oct4+/Nanog+细胞未被检测到。被磁珠拉下来的细胞表达Oct4+和Nanog二者(图6G)。移植7天后，在小鼠脑中发现大量人核抗原阳性(HuNu+)的细胞(图6J)。
实施例3
在本实施例中，使用本公开的方法和装置将人皮肤成纤维细胞重编程成了iPSC。
将转染有游离重编程载体(例如，Epi5TMEpisomal iPSC Reprogramming试剂盒，赛默飞世尔公司，货号A15960)的成纤维细胞于E8培养基中在按实施例1所述制备的3D热可逆PNIPAAm-PEG水凝胶中封装和培养。
如图7所示，在约3周内生产出了纯iPSC。
这些结果表明，本公开的方法和装置可用于培养和制备细胞。可以预想到的是，该方法可用于研究实验室、工业和在医护现场用于制备充足且高质量的细胞用于疾病和损伤治疗、筛选药物库以及制备蛋白质和疫苗。

Claims (41)

1.一种用于培养用于个体化医疗的细胞的装置，所述装置包括：
包括三维(3D)水凝胶支架的封闭壳体；
用于将细胞培养基引入到所述壳体的入口；以及
用于将细胞培养基从所述壳体排出的出口。
2.根据权利要求1所述的装置，其中所述封闭壳体是封闭细胞培养管。
3.根据权利要求1所述的装置，其中所述封闭壳体的容量低于10L。
4.根据权利要求1所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含聚(乙二醇)(PEG)-(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
5.根据权利要求1所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含藻酸盐聚合物。
6.根据权利要求1所述的装置，其中所述3D水凝胶支架的形式选自由片材、纤维、中空纤维、球体以及它们的组合组成的组。
7.根据权利要求1所述的装置，其中所述细胞选自由人原代细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其衍生物、原代肿瘤细胞以及它们的组合组成的组。
8.根据权利要求1所述的装置，其中用于培养的所述细胞是iPSC。
9.一种使用权利要求1所述的装置扩增细胞的方法，所述方法包括：
在所述封闭壳体的所述3D水凝胶支架中悬浮包括细胞的细胞溶液；
从所述入口向所述封闭壳体引入细胞培养基；以及
培养所述细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中悬浮包括细胞的所述细胞溶液包括将来自所述细胞溶液的细胞封装在所述3D水凝胶支架中。
11.根据权利要求9所述的方法，进一步包括将培养的细胞从所述3D水凝胶支架释放，其包括溶解所述3D水凝胶支架。
12.根据权利要求11所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用化学溶解剂化学溶解所述3D水凝胶支架，所述化学溶解剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和藻酸盐裂解酶溶液组成的组。
13.根据权利要求11所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用机械力物理溶解所述3D水凝胶支架。
14.根据权利要求9所述的方法，进一步包括通过在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来对所述培养的细胞进行纯化。
15.根据权利要求9所述的方法，进一步包括通过将培养的细胞离心或在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来浓缩所述培养的细胞。
16.根据权利要求9所述的方法，进一步包括将所述封闭壳体内所培养的细胞运送到医护现场。
17.根据权利要求9所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含聚(乙二醇)(PEG)-(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
18.根据权利要求9所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含藻酸盐聚合物。
19.根据权利要求9所述的装置，其中所述细胞选自由人原代细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其衍生物、原代肿瘤细胞以及它们的组合组成的组。
20.一种使用权利要求1所述的装置分化细胞的方法，所述方法包括：
在所述封闭壳体的所述3D水凝胶支架中悬浮包括细胞的细胞溶液；
从所述入口向所述封闭壳体引入细胞分化培养基；以及
培养所述细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中悬浮包括细胞的所述细胞溶液包括将来自所述细胞溶液的细胞封装在所述3D水凝胶支架中。
22.根据权利要求20所述的方法，进一步包括将培养的细胞从所述3D水凝胶支架释放，其包括溶解所述3D水凝胶支架。
23.根据权利要求22所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用化学溶解剂化学溶解所述3D水凝胶支架，所述化学溶解剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和藻酸盐裂解酶溶液组成的组。
24.根据权利要求22所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用机械力物理溶解所述3D水凝胶支架。
25.根据权利要求20所述的方法，进一步包括通过在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来纯化所述培养的细胞。
26.根据权利要求20所述的方法，进一步包括通过将培养的细胞离心或在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来浓缩所述培养的细胞。
27.根据权利要求20所述的方法，进一步包括将所述封闭壳体内所培养的细胞运送到医护现场。
28.根据权利要求20所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含聚(乙二醇)(PEG)-(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
29.根据权利要求20所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含藻酸盐聚合物。
30.根据权利要求20所述的装置，其中所述细胞选自由人原代细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其衍生物、原代肿瘤细胞以及它们的组合组成的组。
31.一种使用权利要求1所述的装置重编程细胞的方法，所述方法包括：
在所述封闭壳体的所述3D水凝胶支架中悬浮包括成体细胞的细胞溶液；
从所述入口向所述封闭壳体引入细胞培养基；以及
将所述细胞重编程。
32.根据权利要求31所述的方法，其中悬浮包括细胞的所述细胞溶液包括将来自所述细胞溶液的细胞封装在所述3D水凝胶支架中。
33.根据权利要求31所述的方法，进一步包括将培养的细胞从所述3D水凝胶支架释放，其包括溶解所述3D水凝胶支架。
34.根据权利要求33所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用化学溶解剂化学溶解所述3D水凝胶支架，所述化学溶解剂选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)和藻酸盐裂解酶溶液组成的组。
35.根据权利要求33所述的方法，其中溶解所述3D水凝胶支架包括使用机械力物理溶解所述3D水凝胶支架。
36.根据权利要求31所述的方法，进一步包括通过在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来纯化所述培养的细胞。
37.根据权利要求31所述的方法，进一步包括通过将培养的细胞离心或在所述封闭壳体内使培养的细胞与被抗体包被的磁珠接触来浓缩所述培养的细胞。
38.根据权利要求31所述的方法，进一步包括将所述封闭壳体内所培养的细胞运送到医护现场。
39.根据权利要求31所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含聚(乙二醇)(PEG)-(N-异丙基丙烯酰胺)聚合物。
40.根据权利要求31所述的装置，其中所述3D水凝胶支架包含藻酸盐聚合物。
41.根据权利要求31所述的装置，其中所述细胞选自由人原代细胞、诱导的多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞及其衍生物、原代肿瘤细胞以及它们的组合组成的组。
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