CN106479977A - 人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法，利用本发明试剂盒所提供的培养液以及按照本发明方法可以使iPS干细胞高效地、定向地分化为神经细胞。本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，多能干细胞向神经细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的试剂盒和培养基适用于大规模生产高品质的神经细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于神经发育科学研究，神经疾病的细胞治疗，神经损伤的修复以及药物筛选的应用需求。

Description

人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法。
背景技术
诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是由日本Yamanaka研究小组于2006年通过重编程技术成功创建。随后中外多家实验室利用转基因方法将多种类型的成体细胞重编程为iPSCs。iPSCs是通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞直接重编程成为胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)细胞样的多潜能细胞。iPS细胞不仅在细胞形态、生长特性、干细胞标志物表达等方面与ES细胞非常相似，而且在DNA甲基化方式、基因表达谱、染色质状态、形成嵌合体动物等方面也与ES细胞几乎完全相同。与ES细胞一样，iPSCs能形成密集的集落，并且具有多功能表达基因，表面具有与胚胎干细胞一样的抗原。不仅如此，iPSCs像胚胎干细胞一样具有多向分化潜能，在体内可以分化为3个胚层来源的所有细胞，进而参与形成机体所有组织和器官。基于iPSCs具有多潜能分化的特性，其在生物基础研究领域和生物医学领域都有着巨大的作用。在基础研究方面，利用iPSCs为发育生物学、基因与蛋白质功能分析等领域提供了重要的模型。获得的方法相对简单和稳定，在技术上更具有优势。在生物医学领域方面，如利用患者自身细胞所形成的iPSCs，将其进行特定细胞诱导分化后可以成为细胞的研究材料，解决以往人类组织细胞的提取难题。另外由于细胞来源于患者本身，其具有的“个别性”、“专一性”特性可以成为药剂或是药物毒理评估的最佳平台，也可成为转译医学的最佳测试材料。所以，iPSCs的制作与发现也同样成为了医学、药学以及食品的重要安全实验平台。
随着我国人口老龄化日趋严重，脑梗塞、阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)等中枢神经系统疾病发病率逐年增高，由于神经细胞受损后再生困难，从而影响了此类疾病的疗效，使得众多老年人晚年生活质量极差，同时也增加了家庭和国家的负担。最近使用细胞重编程技术将iPSCs诱导分化成特异性神经细胞为神经修复和治疗带来了希望。一方面将分化的神经细胞移植到大脑受损区域，可在一定程度上改善该区域神经损伤造成的功能障碍。另一方面使用病人的神经细胞进行相关疾病的机制研究和进行大规模的药物筛选以及为病人提供个性化的精准治疗。未来不管是临床治疗领域还是精准医疗领域都存在对iPSCs诱导神经细胞的大量需求，目前有许多通过干细胞生成神经细胞的方法大多是只在实验室里完成的，且神经细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用，不能满足安全、均质、精准医疗服务和药物检测行业的大量需要。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的培养基，本发明采用的技术方案为：
一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：
本发明人经过多次改进和尝试，终于发现本发明的前期培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续神经细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述前期培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μM Y-27632。其中，Y-27632是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，TZV是四唑紫(tetrazolium violet)，前期培养液中含有的TZV或Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述试剂盒还包括完全神经诱导培养液，所述完全神经诱导培养液包括神经培养基底液和神经诱导补给液，其中所述神经培养基底液和神经诱导补给液的体积比为40:1～60:1；其中所述神经培养基底液为PSC神经培养基底液(英文全称为PSC Neural Induction Basal medium，由Thermo FisherScientific Inc.生产)；其中所述神经诱导补给液为PSC神经诱导补给液(英文全称为PSC Neural Induction Medium Supplement，由Thermo Fisher ScientificInc.生产)。该完全神经诱导培养液与上述的前期培养液相互配合，可以极大地提高神经细胞的分化率。
本发明的另一个目的在于提供一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
第一阶段：用所述的试剂盒中的前期培养液传代培养即将用于定向分化的多能干细胞；
第二阶段：用预热的所述的试剂盒中的完全神经诱导培养液替换第一阶段所用的前期培养液，之后每24～48小时更换一次所述完全神经诱导培养液，直至可以采收。
作为对上述技术方案的进一步改进，所述方法还包括在第一阶段中，所述多能干细胞以小团块方式传代。当iPSC传代时，细胞需要以小团块方式传代，而不是单个细胞悬浮液，以单个细胞方式传代iPSCs会使细胞死亡率升高。
作为对上述技术方案的进一步改进，在第一阶段中，还包括对用于传代培养所述多能干细胞的培养皿进行Geltrex预处理。
作为对上述技术方案的进一步改进，在第二阶段中，还包括用无菌的移液管或移液器移除未神经分化的细胞群落。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法获得的神经前体细胞系或神经细胞系。
此外，本发明进一步提供了上述神经细胞系在细胞替代治疗、神经疾病治病机制研究以及药物筛选中的应用。
本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，利用本发明方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的神经细胞，且让干细胞向神经细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的方法可以大规模生产高品质的神经细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于神经发育科学研究，神经疾病的细胞治疗，神经损伤的移植以及药物筛选的应用需求。
可诱导多能干细胞的诱导分化研究反映了多能干细胞对外源性因子和微环境的反应的多样性。由于定向分化涉及错综复杂的因子网络,细胞活动收到多种信号间相互作用的调控,这些外源性因子和微环境的相互作用仍需进一步研究。
附图说明
图1是采用本发明一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞的免疫染色图。
图2为采用本发明一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞第三天的细胞图。
图3为采用本发明一个实施例的方法体外定向分化人源iPS干细胞为神经细胞第七天的细胞图。
图4为采用本发明一个实施例的方法体外定向分化的第一代神经细胞传代第1天的细胞图。
图5为采用本发明一个实施例的方法体外定向分化的第一代神经细胞传代第四天的细胞图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
本文使用的术语“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPS细胞，指的是通过被迫表达对保持胚胎干细胞的“干性(sternness)”重要的因子而重编程以进入胚胎干细胞样状态的成体细胞。通常，iPS细胞通过以下方式由非多能性细胞(如成人体细胞，或末端分化细胞)，例如纤维原细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等人工制备，即通过将所述非多能性细胞引入重编程因子，或使所述非多能性细胞与所述重编程因子接触。术语“诱导多能干细胞(iPSC)”不包括胚胎干细胞。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的iPSC获得特化细胞(例如神经细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。在某些实施方案中，多能干细胞可暴露于本发明的培养基组合物和方法，以便促进多能干细胞分化为胎儿样神经细胞。
本文使用的术语“约”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。
本发明培养基的配置按照各组分的比例采用常规的方法配置即可。
本实施例的人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的方法包括以下阶段：
准备用于神经诱导的人iPSCs
取皮肤成纤维细胞诱导的iPSCs传代细胞，采用0.5m MEDTA进行洗脱。在EDTA洗脱后，加入含10μM Y-27632(或2μM TZV)的前期培养液，并利用试管的吸吐搅动使大多数细胞洗脱，收集细胞估计细胞密度，具体为：
转移部分细胞悬浮液到15mL锥形管(6孔板每个孔1mL，转移其中1mL到一个锥形管)；200xg离心15mL锥形管3mins，并吸除上清液；向15mL锥形管中加入1mL预热的细胞分离试剂，37℃孵育5mins；用1mL移液管大力上下吸打5次来分离成为单细胞；用适当的方法来统计细胞总数。
与此同时，对即将使用的培养皿(例如，六孔板)进行Geltrex(一种商业化的基底膜基质)预处理。
吸除预处理过的培养皿中的Geltrex，并在六孔板的每个孔加入2.5mL前期培养液。
温和摇晃有iPSC悬浮液的锥形管，并在每个孔加入2.5×105～3×105个iPSC。例如，如果iPSC悬浮液浓度为1×106每mL，则每个孔加入0.25～0.3mL的iPSC悬浮液。
前后左右摇动6孔板，使细胞均匀分布，5％CO2的湿润环境下37℃培养。
神经诱导
室温预热iPSC完全神经诱导培养液。
第一天(iPSC传代后的24小时)，iPSCs大约有15～25％细胞密度。吸除旧的前期培养液，并向6孔板的每个孔加入2.5mL预热的iPSC完全神经诱导培养液。放回37℃，5％CO2的湿润环境中培养。
第二天，细胞群落的细胞形态应一致。标记没有神经分化的细胞群落，并用无菌的玻璃移液管或移液器移除。吸除旧的完全神经诱导培养液，并向6孔板的每个孔加入2.5mL预热的iPSC完全神经诱导培养液。放回培养箱中培养。
第四天，细胞密度提高。未神经分化的细胞群落需要标记并移除。吸出就旧的完全神经诱导培养液，并向6孔板的每个孔加入5mL预热的iPSC完全神经诱导培养液。放回培养箱中培养。
第六天，细胞密度接近饱和。吸出旧的完全神经诱导培养液，并向6孔板的每个孔加入5mL预热的iPSC完全神经诱导培养液。放回培养箱中培养。
如果在第四天到第七天，细胞的颜色变成棕色并出现很多浮起的细胞，证明iPSCs起始密度过高。这种情况下，每个孔每天更换5mL iPSC神经诱导培养液。
第七天，神经细胞可以采收并扩大培养。关于神经细胞的扩大培养，低温储藏，低温储藏的恢复采用常规方法即可。
使用Nestin(一种中间丝类型的蛋白，特异性表达在神经细胞上一种分子标记物)和SOX2神经干细胞免疫染色细胞盒(Cat.no.A24354)进行染色，通过荧光显影能看到神经细胞如图1所示。
在体外诱导iPS细胞分化为神经细胞的过程中，如何定向分化神经细胞，提高分化效率，是一个复杂综合的问题，其涉及到多种基因、蛋白及信号通路的调节。本发明人在长期实验过程中，发现采用本发明的培养液和方法进行定向分化时，神经细胞的分化效率和稳定性均大幅提高。具体可见图2～5，分化后的神经细胞传代后生长稳定。
其他实施例：
本发明的其他实施例仅涉及到权利要求范围内的各组分的含量变化，其配置方法和用于多能干细胞的定向分化的方法与实施例1基本相同。
例如，在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约4mg/L到约11mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约10mg/L的胰岛素，优选约4mg/L到约9mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约8mg/L的胰岛素，优选约6mg/L到约7mg/L的胰岛素，更优选约6mg/L的胰岛素。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约40～70mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯；优选约50～60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯，更优选约60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约40～80ug/ml亚硒酸钠；优选约50～70ug/ml亚硒酸钠，更优选约60mg/L的亚硒酸钠。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约150～200ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子；优选约160～180ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子，更优选约160ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约90～140ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1；优选约100～120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1，更优选约120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约30～60mg/ml的转铁蛋白；优选约40～60mg/ml的转铁蛋白，更优选约40mg/ml的转铁蛋白。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约4～8wt％的NaHCO3，优选约5～7wt％的NaHCO3，更优选约6wt％的NaHCO3。
在具体实施方案中，本发明的前期培养液可包含约1～3μM TZV，更优选为2μMTZV；可选地，本发明的前期培养液可包含约8～12μM Y-27632，更有选为10μM Y-27632.
在具体实施方案中，本发明的完全神经诱导培养液中神经培养基底液和神经诱导补给液的体积比为50:1.
虽然上述实施例中各组分的含量有一定程度的变化，但大体上均可以实现神经细胞的定向分化，神经细胞分化的比例和纯度有一些差异。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (8)

1.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的试剂盒，所述试剂盒包括前期培养液，所述前期培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述前期培养液还包括：
胰岛素 4～11/ml；
2-磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；
亚硒酸钠 40～80ug/ml；
人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；
人类转化生长因子TGFβ1 90～140ug/ml；
转铁蛋白 30～60mg/ml；
NaHCO3 4～8wt％。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述前期培养液还包括：1～3μM TZV或8～12μMY27632。
3.如权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒还包括完全神经诱导培养液，所述完全神经诱导培养液包括神经培养基底液和神经诱导补给液，其中所述神经培养基底液和神经诱导补给液的体积比为40:1～60:1；
其中所述神经培养基底液为PSC神经培养基底液；
其中所述神经诱导补给液为PSC神经诱导补给液。
4.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为神经细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
第一阶段：用预热的如权利要求1或2所述的试剂盒中的前期培养液传代培养即将用于定向分化的多能干细胞；
第二阶段：用预热的如权利要求3所述的试剂盒中的完全神经诱导培养液替换第一阶段所用的前期培养液，之后每24～48小时更换一次所述完全神经诱导培养液，直至可以采收。
5.如权利要求4所述的方法，在第一阶段中，所述多能干细胞以小团块方式传代。
6.如权利要求4所述的方法，在第一阶段中，还包括对用于传代培养所述多能干细胞的培养皿进行Geltrex预处理。
7.如权利要求4所述的方法，在第二阶段中，还包括用无菌的移液管或移液器移除未神经分化的细胞群落。
8.一种由权利要求4～7任一项所述的方法获得的神经前体细胞系或神经细胞系。
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