CN106367381B - 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法 - Google Patents

人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106367381B
CN106367381B CN201610752671.2A CN201610752671A CN106367381B CN 106367381 B CN106367381 B CN 106367381B CN 201610752671 A CN201610752671 A CN 201610752671A CN 106367381 B CN106367381 B CN 106367381B
Authority
CN
China
Prior art keywords
differentiation
culture solution
stage
cell
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610752671.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106367381A (zh
Inventor
潘淳刚
池锦焕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by According To Guangdong Biological Technology Co Ltd filed Critical According To Guangdong Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201610752671.2A priority Critical patent/CN106367381B/zh
Publication of CN106367381A publication Critical patent/CN106367381A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106367381B publication Critical patent/CN106367381B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/067—Hepatocytes
    • C12N5/0672—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells; Oval cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/12—Light metals, i.e. alkali, alkaline earth, Be, Al, Mg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C12N2500/10—Metals; Metal chelators
    • C12N2500/20—Transition metals
    • C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
    • C12N2500/25—Insulin-transferrin; Insulin-transferrin-selenium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法，利用本发明试剂盒所提供的培养液以及按照本发明方法可以使iPS干细胞高效地、定向地分化为肝细胞。本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，多能干细胞向肝细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的试剂盒和培养基适用于大规模生产高品质的肝细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于肝脏发育科学研究，肝脏疾病的细胞治疗，肝脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求。

Description

人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及干细胞生物学与再生医学领域，具体地涉及一种人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法。
背景技术
众所周知，药物中毒，嗜酒，肝炎病毒感染，自身免疫性肝炎，都能导致慢性终末期肝脏疾病以及急性肝功能衰竭，对健康造成极大的威胁。以药物性肝损伤为例，肝脏是药物引起的毒性的重要靶标：据世界卫生组织统计，药物性肝损伤已上升为全球死亡原因的第5位。目前大约有1100多种药物可能会造成肝损伤，且大部分为不可预期性的肝损伤，发生率为1/100,000～10,000，有三分之一的急性肝功能衰竭与使用批准的处方药物有关。我国是病毒性肝炎以及各种原因导致的慢性终末期肝病的高发国家，到目前为止，除了肝移植，还没有根治的疗法。
然而，肝移植也面临很多局限性，如供体肝脏短缺，免疫排斥以及高额成本。因此，除了有机会获得合适的肝源的一小部分病人，其他大部分病人只能使用其他治疗手段，例如人工肝或者肝细胞移植，可作为肝移植的过渡措施，给以病人肝功能支持。由此可见，临床治疗肝疾病需要大量的肝细胞，但肝细胞的来源非常有限，且不能在体外长期培养，因此，有必要去发明一种新的替代疗法来有效的预防和治疗肝疾病。
在再生医学领域中，ES细胞(胚胎干细胞)是目前被应用的主要材料，且能定向分化成肝细胞，然而ES细胞供体卵母细胞的来源困难，且细胞建系效率低，甚至存在免疫排斥反应，而且，ES细胞和治疗性克隆研究还存在伦理学争论，以致ES细胞无法大面积地被采用。
iPS细胞在细胞形态、生长特性、表面标志物和形成畸胎瘤等方面与ES细胞非常相似，而且iPS细胞获得比较简单，从病人的皮肤细胞，血液细胞等都能诱导成iPS细胞，iPS细胞既具有和胚胎干细胞类似的功能，却绕开了胚胎干细胞研究一直面临的伦理和免疫排斥等诸多障碍，因此在医疗领域的应用尤其是精准医疗和再生医疗中前景非常广阔。
iPS细胞的出现，可以克服伦理以及免疫排斥的缺点，是肝细胞的理想来源，使得肝脏疾病的个体化医疗成为可能。然而，肃然目前有很多方法可以将iPS细胞定向分化为肝细胞，但是肝细胞的分化效率低，价格高昂，细胞系之间的差异很大，不利于规模化生产和应用。因此为了满足肝疾病个体化医疗产业的需求，开发出一种高效廉价诱导分化肝细胞方法极为重要。
发明内容
本发明的一个目的在于克服现有技术的局限，提供一种iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的培养基，本发明采用的技术方案为：
一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒，所述试剂盒包括种植培养液，所述种植培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述种植培养液还包括：
胰岛素 4～11/ml；
2-磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；
亚硒酸钠 40～80ug/ml；
人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；
人类转化生长因子 TGFβ1 90～140ug/ml；
转铁蛋白 30～60mg/ml；
NaHCO3 4～8wt％。
本发明人经过多次改进和尝试，终于发现本发明的种植培养液细胞可以抑制细胞分化过程中细胞的死亡，并且可以促进后续肝细胞的分化比例。DMEM/F12是已经商业化的培养基，在该培养基的基础上加入上述比例的各组分，可以明显提高分化效率，虽然详细的作用机制尚有待研究，但应该与这些组分各自调节的基因、蛋白以及信号通路的相互协同的综合作用相关。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述种植培养液还包括：8～12μM ROCK抑制剂。在优选实施例中，所述ROCK抑制剂为Y-27632，其是一种选择性的ROCK1(p160ROCK)抑制剂。种植培养液中含有的Y-27632用于保证待分化细胞的存活率，避免大量细胞死亡。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述试剂盒还包括铺板培养液，所述铺板培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述铺板培养液还包括RGF BME，其中所述基础培养基DMEM/F12与所述RGF BME的体积比为80:1～120:1。优选地，DMEM/F12与RGF BME的体积比为100:1。RGF BME的全称是指Geltrex LDEV Free RGF BME,其是一种干细胞细胞分化基质，满足干细胞和癌症研究、药物开发、毒理学研究、发育和形态发生研究以及组织和器官工程领域对三维细胞培养。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述试剂盒还包括分化第一阶段培养液，所述分化第一阶段培养液包括分化基础培养液一和分化混合剂，其中所述分化基础培养液一和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液一包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液一，其中所述干细胞分化补给液一为肝细胞分化Cocktail I(对应英文全称为Hepatocyte Differentiation Cocktail I，由R&D Systems,Inc.生产，商品名为)；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述试剂盒还包括分化第二阶段培养液，所述分化第二阶段培养液包括分化基础培养液二和分化混合剂，其中所述分化基础培养液二和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液二包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液二，其中所述干细胞分化补给液二为肝细胞分化Cocktail II(对应英文全称为Hepatocyte Differentiation Cocktail II，由R&DSystems,Inc.生产，商品名为)；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述试剂盒还包括分化第三阶段培养液，所述分化第三阶段培养液包括分化基础培养液三和分化混合剂，其中所述分化基础培养液三和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液三包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液三，其中所述干细胞分化补给液三为
肝细胞分化Cocktail Ⅲ(对应英文全称为Hepatocyte DifferentiationCocktail Ⅲ，由R&D Systems,Inc.生产，商品名为)；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述试剂盒还包括分化第四阶段培养液，所述分化第四阶段培养液包括分化基础培养液四和分化混合剂，其中所述分化基础培养液四和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液四包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液四，其中所述干细胞分化补给液四为肝细胞分化Cocktail Ⅳ(对应英文全称为Hepatocyte Differentiation Cocktail Ⅳ，由R&DSystems,Inc.生产，商品名为)；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液。
作为对上述技术方案的进一步改进，其中所述分化基础培养液一、二、三、四还包括1x细胞培养用青霉素。
本发明的另一个目的在于提供一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为肝细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
铺板阶段：用所述的试剂盒中的铺板培养液对细胞培养皿进行预处理；
细胞分离阶段：用胰酶消化待分化的诱导干细胞，并离心；
细胞种植阶段：用所述的种植培养液重悬离心后的细胞，种植到细胞培养皿中，每天换液，培养至细胞密度达到70％～90％；
肝细胞分化阶段一：用所述的试剂盒中的分化第一阶段培养液替换上一阶段的所述种植培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第一阶段培养液，在该阶段iPS细胞形成定行内胚层(definitive endoderm，DE)；
肝细胞分化阶段二：用所述的试剂盒中的分化第二阶段培养液替换上一阶段的所述分化第一阶段培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第二阶段培养液，在该阶段肝细胞特异分化阶段，开始形成肝母细胞(hepatoblasts)；
肝细胞分化阶段三：用所述的试剂盒中的分化第三阶段培养液替换上一阶段的所述分化第二阶段培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第三阶段培养液，此为肝细胞扩增阶段；
肝细胞分化阶段四：用所述的试剂盒中的分化第四阶段培养液替换上一阶段的所述分化第三阶段培养液，培养6～8天，每天更换一次所述分化第四阶段培养液，此为肝细胞成熟阶段。
在体外诱导iPS细胞分化为肝的过程中，如何定向分化肝细胞，提高分化效率，是一个复杂综合的问题，其涉及到多种基因、蛋白及信号通路的调节。本发明人在长期实验过程中，发现在上述种植培养液、铺板培养液以及分化第一、二、三、四阶段培养液的配合下，且采用本发明的方法可以极大地提高肝细胞的分化率。
采用本发明的方法进行定向分化时，肝的分化效率和稳定性均大幅提高。
本发明的另一目的在于提供一种由上述方法获得的肝前体细胞系或肝细胞系。
此外，本发明进一步提供了上述肝细胞系在细胞替代治疗、肝脏疾病治病机制研究以及药物筛选中的应用。
本发明的试剂盒和方法简单可靠，稳定高效，安全性高，利用本发明方法，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的肝细胞，且让干细胞向肝细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。同时，本发明的方法可以大规模生产高品质的肝细胞，无需后续的筛选和纯化步骤，可以直接用于肝脏发育科学研究，肝脏疾病的细胞治疗，肝脏损伤的移植以及药物筛选的应用需求。
附图说明
图1为根据本发明的一个实施例的试剂和方法体外定向分化人源i PS干细胞为肝细胞的显微镜图片。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
本文使用的术语“诱导多能干细胞”，通常缩写为iPS细胞(iPSC)，指的是通过被迫表达对保持胚胎干细胞的“干性(sternness)”重要的因子而重编程以进入胚胎干细胞样状态的成体细胞。通常，iPS细胞通过以下方式由非多能性细胞(如成人体细胞，或末端分化细胞)，例如纤维原细胞、造血细胞、肌细胞、神经元、表皮细胞等人工制备，即通过将所述非多能性细胞引入重编程因子，或使所述非多能性细胞与所述重编程因子接触。术语“诱导多能干细胞(iPSC)”不包括胚胎干细胞。
在本发明中，本文使用的术语“分化”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的iPSC获得特化细胞(例如肝细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。在某些实施方案中，多能干细胞可暴露于本发明的培养基组合物和方法，以便促进多能干细胞分化为胎儿样肝细胞。
本文使用的术语“肝细胞(hepatocyte)”通常指的是任何肝细胞谱系细胞，并且，除非另有说明，可适用于处于肝细胞个体发育的任何阶段的细胞。例如，肝细胞可同时包括肝细胞前体细胞(不成熟的肝细胞或胎儿肝细胞)和成熟的肝细胞(成体样肝细胞)。进一步的肝细胞可被细分成亚型包括，但不限于，肝实质细胞，胆管上皮细胞，卵原细胞，星形细胞，窦内皮细胞，库普佛细胞，陷窝细胞，树突状细胞。
本文使用的术语“约"，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.1％,0.05％或0.01％内。
本发明培养基的配置按照各组分的比例采用常规的方法配置即可。
本实施例的人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的方法包括以下阶段：
铺板阶段：
在2～8℃的温度条件下解冻铺板培养液；
用95％的酒精和酒精灯火对细胞爬片进行消毒后，放在6孔板中；若采用T25(细胞培养瓶)则不加细胞爬片；
在6孔板铺2mL稀释的铺板培养液，或在T25铺5mL稀释的铺板培养液。
iPS细胞分离阶段：
在37℃下预温种植培养液；
从细胞培养皿中弃除旧培养基，加入杜氏PBS缓冲液润洗2遍，加640uL TRYPLETMEXPRESS(一种胰酶)到6孔板培养皿中(或者1.5mL TRYPLE EXPRESS到T25的培养皿中)，保持温度在37℃孵育细胞，直至细胞开始从培养皿上脱落；
加入37℃预温的种植培养液，用移液管轻轻吹打培养皿，使细胞脱落；并轻轻上下吹打细胞使形成大的细胞团；
将所得到的细胞悬液转到含有5ml种植培养液的离心管中，离心4分钟。
iPS细胞种植阶段：
使用含有4ng/mL bFGF及10uM ROCK抑制剂的种植培养液重悬细胞沉淀后，使用台盼蓝和雪球计数器技术细胞数量，以5.28～6x 105/cm2的细胞浓度种植到铺板后的6孔板的孔中，或以1.375～1.56x 106/cm2的细胞浓度种植到铺板后的T25中；
将细胞放到37℃，5％CO2培养箱中培养，每天换液，直至细胞密度达到80％～90％(1～2天为宜)。
肝细胞分化阶段：
肝分化阶段一：弃掉旧培养基，加入分化第一阶段培养液(1.2mL 6孔板，3mLT25)，将细胞放到37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
继续培养4天，每天需更换分化第一阶段培养液。
分化阶段二：弃掉旧培养基，加入分化第二阶段培养液(1.5mL 6孔板，4mL T25)；将细胞放到37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
继续培养4天，每天需更换分化第二阶段培养液。
分化阶段三：弃掉旧培养基，加入分化第三阶段培养液(1.5mL 6孔板，4mL T25)；将细胞放到37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
继续培养4天，每天需更换分化第三阶段培养液。
分化阶段四：弃掉旧培养基，加入分化第四阶段培养液(1.5mL 6孔板，4mL T25)；将细胞放到37℃，5％CO2培养箱中培养24小时；
继续培养7天，每天需更换分化第四培养液。
细胞免疫化学染色:
使用血清白蛋白对分化的肝细胞进行免疫细胞化学染色评估，判断肝细胞的分化情况。
其他实施例：
本发明的其他实施例仅涉及到权利要求范围内的各组分的含量变化，其配置方法和用于多能干细胞的定向分化的方法与实施例1基本相同。
例如，在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约4mg/L到约11mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约10mg/L的胰岛素，优选约4mg/L到约9mg/L的胰岛素，优选约5mg/L到约8mg/L的胰岛素，优选约6mg/L到约7mg/L的胰岛素，更优选约6mg/L的胰岛素。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约40～70mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯；优选约50～60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯，更优选约60mg/ml的2-磷酸抗坏血酸酯。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约40～80ug/ml亚硒酸钠；优选约50～70ug/ml亚硒酸钠，更优选约60mg/L的亚硒酸钠。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约150～200ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子；优选约160～180ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子，更优选约160ug/ml的人类碱性成纤维细胞生长因子。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约90～140ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1；优选约100～120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1，更优选约120ug/ml的人类转化生长因子TGFβ1。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约30～60mg/ml的转铁蛋白；优选约40～60mg/ml的转铁蛋白，更优选约40mg/ml的转铁蛋白。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约4～8wt％的NaHCO3，优选约5～7wt％的NaHCO3，更优选约6wt％的NaHCO3。
在具体实施方案中，本发明的种植培养液可包含约8～12μM Y-27632，更有选为10μM Y-27632.
在具体实施方案中，本发明的铺板培养液中基础培养基DMEM/F12与RGF BME的体积比为80:1或120:1，优选为100:1。
虽然上述实施例中各组分的含量有一定程度的变化，但大体上均可以实现肝细胞的定向分化，只是肝细胞分化的比例和纯度有一些差异。
根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (4)

1.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为肝细胞的试剂盒，所述试剂盒包括种植培养液，所述种植培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述种植培养液还包括：
胰岛素 4～11mg/ml；
2-磷酸抗坏血酸酯 40～70mg/ml；
亚硒酸钠 40～80ug/ml；
人类碱性成纤维细胞生长因子 150～200ug/ml；
人类转化生长因子 TGFβ1 90～140ug/ml；
转铁蛋白 30～60mg/ml；
NaHCO3 4～8wt％；
其中所述试剂盒还包括铺板培养液，所述铺板培养液包括基础培养基DMEM/F12，进一步地，所述铺板培养液还包括RGF BME，其中所述基础培养基DMEM/F12与所述RGF BME的体积比为80:1～120:1；
其中所述试剂盒还包括分化第一阶段培养液，所述分化第一阶段培养液包括分化基础培养液一和分化混合剂，其中所述分化基础培养液一和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液一包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液一,其中所述干细胞分化补给液一为肝细胞分化Cocktail I；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液；
其中所述试剂盒还包括分化第二阶段培养液，所述分化第二阶段培养液包括分化基础培养液二和分化混合剂，其中所述分化基础培养液二和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液二包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液二,其中所述干细胞分化补给液二为肝细胞分化Cocktail II；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液；
其中所述试剂盒还包括分化第三阶段培养液，所述分化第三阶段培养液包括分化基础培养液三和分化混合剂，其中所述分化基础培养液三和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液三包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液三,其中所述干细胞分化补给液三为肝细胞分化Cocktail III；其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液；
其中所述试剂盒还包括分化第四阶段培养液，所述分化第四阶段培养液包括分化基础培养液四和分化混合剂，其中所述分化基础培养液四和所述分化混合剂的体积比为600:1；
其中，所述分化基础培养液四包括：
基础培养基RPMI-1640；
1×GlutaMAXTM；
干细胞分化补给液四，其中所述干细胞分化补给液四为肝细胞分化Cocktail IV；
其中，所述分化混合剂包括：
0.08～0.12vol％的BSA；
PBS缓冲液。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其中所述种植培养液还包括：8～12μM ROCK抑制剂；其中所述ROCK抑制剂为Y-27632。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述分化基础培养液一、二、三和四还包括1x细胞培养用青霉素。
4.一种用于体外定向诱导多能干细胞分化为肝细胞的方法，所述方法包括以下阶段：
铺板阶段：用如权利要求1所述的试剂盒中的铺板培养液对细胞培养皿进行预处理；
细胞分离阶段：用胰酶消化待分化的诱导干细胞，并离心；
细胞种植阶段：用如权利要求1或2所述的种植培养液重悬离心后的细胞，种植到细胞培养皿中，每天换液，培养至细胞密度达到70％～90％；
肝细胞分化阶段一：用如权利要求1所述的试剂盒中的分化第一阶段培养液替换上一阶段的所述种植培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第一阶段培养液；
肝细胞分化阶段二：用如权利要求1所述的试剂盒中的分化第二阶段培养液替换上一阶段的所述分化第一阶段培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第二阶段培养液；
肝细胞分化阶段三：用如权利要求1所述的试剂盒中的分化第三阶段培养液替换上一阶段的所述分化第二阶段培养液，培养3～5天，每天更换一次所述分化第三阶段培养液；
肝细胞分化阶段四：用如权利要求1所述的试剂盒中的分化第四阶段培养液替换上一阶段的所述分化第三阶段培养液，培养6～8天，每天更换一次所述分化第四阶段培养液。
CN201610752671.2A 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法 Active CN106367381B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610752671.2A CN106367381B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610752671.2A CN106367381B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106367381A CN106367381A (zh) 2017-02-01
CN106367381B true CN106367381B (zh) 2018-06-29

Family

ID=57903920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610752671.2A Active CN106367381B (zh) 2016-08-29 2016-08-29 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106367381B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952374A (zh) * 2014-05-07 2014-07-30 北京赛贝生物技术有限公司 人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法
CN104830753A (zh) * 2015-05-20 2015-08-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011140397A2 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 The Regents Of The University Of California Office Of The President Stem cell defined media for xeno-free and feeder free conditions and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103952374A (zh) * 2014-05-07 2014-07-30 北京赛贝生物技术有限公司 人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法
CN104830753A (zh) * 2015-05-20 2015-08-12 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种诱导多能干细胞培养基、应用及培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
体外诱导生成人诱导性多能干细胞及向肝细胞样细胞分化的研究;王建军;《中国博士学位论文全文数据库——医药卫生辑》;20151115(第11期);摘要，正文第9页 *
胚胎干细胞/诱导多能干细胞向肝细胞诱导分化的研究进展;邢哲谦，杜智;《医学综述》;20160531;第22卷(第9期);1682-1686页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106367381A (zh) 2017-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104805054B (zh) 干细胞无血清培养基
CN105087465B (zh) 肝细胞无血清培养基
CN108103021B (zh) 一种新型人源诱导型神经干细胞的制备方法及其应用
CN106609263B (zh) 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法
CN104164405A (zh) 一种高效的体外培养人脐带间质干细胞的无血清培养体系
CN110564682B (zh) 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN106754668A (zh) 一种干细胞培养液及注射液
CN107326003B (zh) 一种利用无血清培养液体外构建的3d模型及其构建方法
CN106244527B (zh) 人源iPS干细胞体外定向分化为心肌细胞的试剂盒及方法
CN109749997A (zh) 一种角膜缘干细胞无血清培养基及其培养方法
TW201636423A (zh) 血管平滑肌細胞的培養方法
CN106479977B (zh) 人源iPS干细胞体外定向分化为神经细胞的试剂盒及方法
CN103446382A (zh) 中药复方药物组合物的新用途
CN113943701A (zh) 一种可扩增间充质干细胞的无血清培养基及其制备方法
CN101225374B (zh) 红景天及红景天苷在干细胞定向分化为肝系细胞中的应用
Sanie-Jahromi et al. Effects of the secretome of human Wharton's jelly mesenchymal stem cells on the proliferation and apoptosis gene expression of the retinal pigmented epithelium
CN106754657A (zh) 一种猴胚胎干细胞的无血清培养基
CN103060265A (zh) 老年大鼠脑血管内皮细胞原代培养方法
CN103320385A (zh) 人源性高分化肝癌细胞株hl1017及其构建方法
CN106367381B (zh) 人源iPS干细胞体外定向分化为肝细胞的试剂盒及方法
CN105018418B (zh) 含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用
CN105754943B (zh) 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法
CN107129966A (zh) 一种含血清的角膜上皮细胞培养液
CN104726400B (zh) 人多能干细胞向生殖细胞分化的无动物源组分培养方法
WO2023011251A1 (zh) 快速高效的临床级色素上皮细胞诱导方法、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant