CN103952374A - 人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法。该人多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂；基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1ng/ml～3ng/ml。本发明的培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，培养过程中不需要动物源细胞做饲养层，使培养的hES细胞和hiPS细胞在移植后不容易产生人体排斥反应，且生长效率高。

Description

人多能干细胞培养基及人多能干细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种人多能干细胞(hES/iPS)培养基及人多能干细胞的培养方法。

背景技术

1998年，美国Wisconsin大学Thomson(Thomson et al.,1998)等采用来自人工体外受精(in vitro ferlilization，IVF)的囊胚内细胞团，首先成功分离人胚胎干细胞(human embryonicstem cell，hES细胞)并培养建系。细胞具有高度自我更新能力，并能在体外培养条件下无限扩增。同时，hES细胞还能在一定条件下，分化成三个胚层来源的各种细胞。因此，hES细胞广泛应用于再生医学、药物筛选及胚胎发育生物学的研究，从建立以来一直是当今研究热点。

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc)的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Induced PluripotentStem Cells,iPSCs)，并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞具备hES细胞的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。

hES细胞和hiPS细胞的最初采用的培养条件，都需要明胶包被和饲养层细胞(小鼠胚胎成纤维细胞，mouse embryonic fibroblasts,MEF)的支持。此外，传统培养基还采用成分复杂的敲除血清替代品(Knockout Serum Replacement,KOSR)作为主要的培养基添加剂。由传统培养条件产生的hES细胞和hiPS细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，传统培养条件还很不稳定，容易影响实验进度和结果，造成损失。这主要是由于不同批次MEF的质量差异较大，而购买商品化MEF则极其昂贵，大多数培养者采用自制的MEF所致。

发明内容

本发明旨在提供一种人多能干细胞(hES/iPS)培养基及人多能干细胞的培养方法，以解决现有技术中人多能干细胞(hES/iPS)因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应及现有技术中的培养体系严重影响人多能干细胞(hES/iPS)体外扩增效能的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供一种人多能干细胞培养基。该人多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1ng/ml～3ng/ml。

进一步地，添加剂包括碳酸氢钠520～580μg/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素生长因子15～25ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人乳铁蛋白10～12μg/ml、抗坏血酸63～66μg/ml以及重组人转化生长因子1.5ng/ml～2.5ng/ml。

进一步地，添加剂包括碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/m。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80℃冰冻保存。

进一步地，人多能干细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以7:500的体积配混合后形成人多能干细胞培养基。

进一步地，人多能干细胞培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明的另一个方面，提供一种人多能干细胞的培养方法。该方法包括采用上述人多能干细胞培养基培养。

包括以下步骤：S1，将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入人多能干细胞培养基，每隔一天换一次人多能干细胞培养基。

进一步地，培养方法包括：S3，当人多能干细胞汇合度达到70％～80％进行传代培养，使用0.5mM EDTA消化人多能干细胞为小团块，将小团块接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，用人多能干细胞培养基进行培养。

进一步地，步骤S2是在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的。

本发明的人多能干细胞(hES/iPS)培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，培养过程中不需要动物源细胞做饲养层，使培养的hES细胞和hiPS细胞在移植后不容易产生人体排斥反应，且生长效率高。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1A至图1D示出了实验一中实施例5的培养基培养人的ES细胞系H9的细胞形态图、多能性标记物染色图和增殖曲线图；

图2A至图2D示出了实验二中实施例5的培养基培养人的IPS细胞系HIPS的细胞形态图、多能性标记物染色图和增殖曲线图；

图3A至图3D示出了实验三中实施例5、对比例1和对比例2的培养基培养人的ES细胞系H9的细胞形态图和增殖曲线图；

图4A至图4D示出了实验三中实施例5、对比例1和对比例2的培养基培养人的IPS细胞系HIPS的细胞形态图和增殖曲线图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

现有技术中，hES细胞和hiPS细胞因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，且血清替代品不同批次差异较大，很不稳定，容易影响实验进度和结果。

针对上述技术问题，根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种人多能干细胞培养基。该人多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；添加剂包括碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1ng/ml～3ng/ml。

本发明的人多能干细胞(hES/iPS)培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，培养过程中不需要动物源细胞做饲养层，使培养的hES细胞和hiPS细胞在移植后不容易产生人体排斥反应，且生长效率高。

优选的，添加剂包括碳酸氢钠520～580μg/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素生长因子15～25ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人乳铁蛋白10～12μg/ml、抗坏血酸63～66μg/ml以及重组人转化生长因子1.5ng/ml～2.5ng/ml。

进一步优选的，添加剂包括碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/ml。

根据本发明一种典型的实施方式，基础培养基保存在4～8℃，添加剂保存在-20～-80-℃单独冰冻保存。添加剂含有生长因子，在-20～-80-℃保存可以保持稳定在一年以上。

优选的，人多能干细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻添加剂；将添加剂与基础培养基以7:500的体积配混合后形成人多能干细胞培养基。优选的，人多能干细胞培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种人多能干细胞的培养方法。该培养方法是采用上述人多能干细胞培养基培养。

优选的，包括以下步骤：S1，将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入人多能干细胞培养基，每隔一天换一次人多能干细胞培养基。在此种条件下培养细胞，更有利于细胞的生长。

进一步地，培养方法包括：S3，当人多能干细胞汇合度达到70％～80％可以进行传代培养，使用0.5mM EDTA消化人多能干细胞为小团块，将小团块接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，用人多能干细胞培养基进行培养。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

在下列实施例中，通过以下步骤配置(下文中没有具体描述的实验条件，是采用本领域常规的实验条件进行的)：

添加剂：

第一步：配制各种成分的储备液：①碳酸氢钠75mg/ml、②硒酸钠70μg/ml、③重组人胰岛素生长因子100ng/μL、④重组人碱性成纤维细胞生长因子200ng/μl、⑤重组人乳铁蛋白50mg/ml、⑥抗坏血酸64mg/ml以及⑦重组人转化生长因子100ng/μL。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子()10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸(L-Ascorbic acid)50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1-3ng/ml的工作液。

实施例1-5中的干细胞培养基的组分如表1所示。

表1

对比例1中的培养基为Stemcell出品的TeSR-E8，对比例2为Life出品的E8。

实施例1-5中的干细胞培养基中3种独立的组分在-20～-80-℃单独冰冻保存。

将上述实施例1-5中的干细胞培养基按照如下步骤配制：

在2～8℃化冻添加剂，随后将添加剂加入基础培养基形成干细胞培养基，干细胞培养基可在2～8℃稳定储存达两周。

干细胞培养基：将7ml添加剂与500ml基础培养基混合后形成干细胞培养基。

干细胞培养实施例

实验一：

1.实验材料：人ES细胞H9

2.培养基：实施例1-5中的干细胞培养基

3.实验步骤：

S1，H9的复苏：准备干细胞培养液，复苏人的ES细胞系H9，将其按合适的密度接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S2，每隔一天换一次干细胞培养基，培养细胞3～5天待细胞汇合度达到70～80％时，即可进行传代(在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的)；

S3，连续培养5～10代，观察细胞形态及增殖情况，选出最佳培养基配比即实施例5。通过对实施例5中培养的细胞进行多能性标记物染色来检测其对干细胞多能性维持的效果，并对连续培养40代以后的细胞绘制增值曲线，检测细胞的增殖情况。

图1A至图1D示出了实验一中实施例5的培养基培养人的ES细胞系H9的细胞形态图、多能性标记物染色图和增殖曲线图，其中，图1A图示出了实施例5培养之前的细胞形态图；图1B图示出了实施例5稳定培养P45的细胞形态图；图1C图示出了实施例5稳定培养P45的细胞进行多能性标记物染色图；图1D图示出了实施例5稳定培养P45的细胞的增值曲线图。

实验二：

1.实验材料：人的IPS细胞系HIPS

2.培养基：实施例1-5中的干细胞培养基

3.实验步骤：

S1，HIPS的复苏：准备干细胞培养液，复苏人的IPS细胞系HIPS，将其按合适的密度接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S2，每隔一天换一次干细胞培养基，培养细胞3～5天待细胞汇合度达到70～80％时，即可进行传代(在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的)；

S3，连续培养5～10代，观察细胞形态及增殖情况，选出最佳培养基配比即实施例5。通过对实施例5中培养的细胞进行多能性标记物染色来检测其对干细胞多能性维持的效果，并对连续培养40代以后的细胞绘制增值曲线，检测细胞的增殖情况。

图2A至图2D示出了实验二中实施例5的培养基培养人的IPS细胞系HIPS的细胞形态图、多能性标记物染色图和增殖曲线图，其中，图2A图示出了实施例5培养之前的细胞形态图；图2B图示出了实施例5稳定培养P45的细胞形态图；图2C图示出了实施例5稳定培养P45的细胞进行多能性标记物染色图；图2D图示出了实施例5稳定培养P45的细胞的增值曲线图。

实验三：

1.实验材料：人ES细胞H9

2.培养基：实施例5的干细胞培养基、对比例1和对比例2的干细胞培养基

3.实验步骤：

S1，H9的复苏：准备干细胞培养液，复苏人的ES细胞系H9，将其按合适的密度接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S2，每隔一天换一次干细胞培养基，培养细胞3～5天待细胞汇合度达到70～80％时，即可进行传代(在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的)；

S3，连续培养25代，观察细胞形态及增殖情况，并分别对实施例5、对比例1和对比例2的干细胞培养基培养的H9分别绘制增值曲线，对培养效果进行比较。

图3A至图3D示出了实验三中实施例5、对比例1和对比例2的培养基培养人的ES细胞系H9的细胞形态图和增殖曲线图，其中，图3A图示出了实施例5培养H9至第25代的细胞形态图；图3B图示出了对比例1培养H9至第25代的细胞形态图；图3C图示出了对比例2培养H9至第25代的细胞形态图；图3D图示出了实施例5、对比例1和对比例2的干细胞培养H9至第27代的细胞增值曲线对比图。

实验四：

1.实验材料：人IPS细胞系HIPS

2.培养基：实施例5的干细胞培养基、对比例1和对比例2的干细胞培养基

3.实验步骤：

S1，HIPS的复苏：准备干细胞培养液，复苏人的IPS细胞系HIPS，将其按合适的密度接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S2，每隔一天换一次干细胞培养基，培养细胞3～5天待细胞汇合度达到70～80％时，即可进行传代(在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的)；

S3，连续培养25代，观察细胞形态及增殖情况，并分别对实施例5、对比例1和对比例2的干细胞培养基培养的HIPS分别绘制增值曲线，对培养效果进行比较。

图4A至图4D示出了实验三中实施例5、对比例1和对比例2的培养基培养人的IPS细胞系HIPS的细胞形态图和增殖曲线图，其中，图4A图示出了实施例5培养HIPS至第25代的细胞形态图；图4B图示出了对比例1培养HIPS至第25代的细胞形态图；图4C图示出了对比例2培养HIPS至第25代的细胞形态图；图4D图示出了实施例5、对比例1和对比例2的干细胞培养HIPS至第27代的细胞增值曲线对比图。

综上，从实验一、二、三、四的结果(图1A-4D)可以看出，本发明的干细胞培养基性能稳定，多能性维持效果好，在细胞形态、增殖性等方面均可跟同类产品相媲美。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人多能干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂；

其中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；

所述添加剂包括碳酸氢钠400～600μg/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素生长因子10～30ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人乳铁蛋白7～13μg/ml、抗坏血酸50～70μg/ml以及重组人转化生长因子1ng/ml～3ng/ml。

2.根据权利要求1所述的人多能干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂包括碳酸氢钠520～580μg/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素生长因子15～25ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人乳铁蛋白10～12μg/ml、抗坏血酸63～66μg/ml以及重组人转化生长因子1.5ng/ml～2.5ng/ml。

3.根据权利要求2所述的人多能干细胞培养基，其特征在于，所述添加剂包括碳酸氢钠543μg/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素生长因子20ng/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人乳铁蛋白11μg/ml、抗坏血酸65μg/ml以及重组人转化生长因子2ng/m。

4.根据权利要求1所述的人多能干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基在4～8℃下保存，所述添加剂在-20～-80℃下冰冻保存。

5.根据权利要求4所述的人多能干细胞培养基，其特征在于，所述人多能干细胞培养基在使用前配制，具体包括以下步骤：

在2～8℃下化冻所述添加剂；

将所述添加剂与所述基础培养基以7:500的体积配混合后形成所述人多能干细胞培养基。

6.根据权利要求1所述的人多能干细胞培养基，其特征在于，所述人多能干细胞培养基在使用前0～14天配制，并在2～8℃下保存。

7.一种人多能干细胞的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至6中任一项所述的人多能干细胞培养基培养。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将人多能干细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；

S2，向所述培养皿中加入人多能干细胞培养基，每隔一天换一次所述人多能干细胞培养基。

9.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述培养方法进一步包括：

S3，当所述人多能干细胞汇合度达到70％～80％时进行传代培养，使用0.5m MEDTA消化所述人多能干细胞为小团块，将所述小团块接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中，用所述人多能干细胞培养基进行培养。

10.根据权利要求8所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2是在温度为37℃，5％CO₂的培养箱中进行的。