CN103602635A

CN103602635A - 重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法

Info

Publication number: CN103602635A
Application number: CN201310585820.7A
Authority: CN
Inventors: 李扬; 兰峰
Original assignee: BEIJING CELLAPY BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING CELLAPY BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2033-11-19
Also published as: CN103602635B

Abstract

本发明公开了一种重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法。其中，该重编程培养基包括基础培养基，重编程添加剂1及重编程添加剂2；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；重编程添加剂1包括碳酸氢钠、硒酸钠、重组人胰岛素、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转铁蛋白、抗坏血酸以及氢化可的松；重编程添加剂2包括碳酸氢钠，硒酸钠，重组人胰岛素，重组人碱性成纤维细胞生长因子，重组人转铁蛋白，抗坏血酸，丙戊酸以及丁酸钠。本发明的重编程培养基成分明确，品质稳定且重编程效率高，细胞谱系广，可以重编程培养包括人皮肤成纤维，外周血单核细胞，羊膜上皮细胞等细胞。

Description

重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体而言，涉及一种重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法。

背景技术

日本学者中山申弥(Shinya Yamanaka)于2006年和2007年，首次通过导入四个转录因子(Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的方法，分别成功将小鼠(Takahashi and Yamanaka.,2006)和人(Takahashi et al.,2007)的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（Induced Pluripotent StemCells,iPSCs），并因此获得了2012年的诺贝尔医学和生理学奖。hiPS细胞（诱导多能干细胞）具备hES细胞（人胚胎干细胞）的所有分化能力，并且没有伦理问题，在不久的将来会完全取代hES细胞，成为再生医学的最主要细胞来源。

目前，世界范围内绝大部分科研人员使用人体细胞的重编程培养条件，都需要明胶包被和饲养层细胞（小鼠胚胎成纤维细胞，mouse embryonic fibroblasts,MEF）的支持。此外，还采用成分复杂的敲除血清替代品（Knockout Serum Replacement,KOSR）作为主要的培养基添加剂。这样产生的hiPS细胞，因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，不能作为合适的细胞来源。同时，由于血清替代品不同批次差异较大，所以很不稳定，容易影响实验进度和结果，造成损失。另外，还由于用于重编程的培养基还需要MEF做饲养层，不同批次MEF的质量差异较大，严重影响重编程效率。

发明内容

本发明旨在提供一种重编程培养基、其制备方法及重编程细胞的培养方法，以解决现有技术中hiPS细胞因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应及现有技术中的重编程培养基严重影响细胞重编程效率的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种重编程培养基。该重编程培养基包括基础培养基，重编程添加剂1及重编程添加剂2；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；重编程添加剂1包括碳酸氢钠400～600ug/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人转铁蛋白7～13ug/ml、抗坏血酸50～70ug/ml以及氢化可的松0.5～2uM；重编程添加剂2包括碳酸氢钠400～600ug/ml，硒酸钠8～20ng/ml，重组人胰岛素15～30ug/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml，重组人转铁蛋白7～13ug/ml，抗坏血酸50～70ug/ml，丙戊酸0.5～2mM以及丁酸钠80～200uM。

进一步地，重编程添加剂1包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及氢化可的松0.9～1.1uM；重编程添加剂2包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及丙戊酸0.9～1.2mM以及丁酸钠140～160uM。

进一步地，重编程添加剂1包括碳酸氢钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及氢化可的松1uM；重编程添加剂2包括碳酸钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及丙戊酸1mM以及丁酸钠150uM。

进一步地，基础培养基保存在4～8℃，重编程添加剂1及重编程添加剂2保存在-20～-80℃单独冰冻保存。

进一步地，重编程培养基在使用前配制成重编程培养基1和重编程培养基2，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻重编程添加剂1及重编程添加剂2；将重编程添加剂1与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基1；将重编程添加剂2与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基2。

进一步地，重编程培养基1和重编程培养基2在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明的另一个方面，提供一种重编程细胞的培养方法。该培养方法采用上述任一种重编程培养基培养。

进一步地，包括以下步骤：S1，将重编程细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；S2，向培养皿中加入重编程培养基1，每隔一天换一次重编程培养基1，在重编程培养基1中培养重编程细胞3～5天；S3，去除重编程培养基1，向培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次重编程培养基2，在重编程培养基2中培养重编程细胞10～30天。

本发明的重编程培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，重编程过程中不需要动物源细胞做饲养层，使培养的重编程在移植后不容易产生人体排斥反应，且重编程效率高，细胞谱系广，可以重编程培养包括人皮肤成纤维，外周血单核细胞，羊膜上皮细胞等细胞。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了实验一中实施例5的培养基培养人皮肤成纤维细胞在重编程过程不同生长阶段的图像；

图2示出了实验一中AP染色阳性的iPS克隆数目；

图3示出了实验二中AP染色阳性的iPS克隆数目；

图4示出了实验三中AP染色阳性的iPS克隆数目。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

现有技术中，hiPS细胞因为长期暴露在富含动物制品的培养环境中，在移植后容易产生人体排斥反应，且血清替代品不同批次差异较大，很不稳定，容易影响实验进度和结果。

针对上述技术问题，根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种重编程培养基。该重编程培养基包括基础培养基，重编程添加剂1及重编程添加剂2；其中，基础培养基为DMEM/F12培养基；重编程添加剂1包括碳酸氢钠400～600ug/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素（Insulin）15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）80～120ng/ml、重组人转铁蛋白（Holo-transferin）7～13ug/ml、抗坏血酸（L-Ascorbic acid）50～70ug/ml以及氢化可的松0.5～2uM；重编程添加剂2包括碳酸钠400～600ug/ml，硒酸钠（Sodium selenite）8～20ng/ml，重组人胰岛素15～30ug/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml，重组人转铁蛋白7～13ug/ml，抗坏血酸50～70ug/ml，丙戊酸0.5～2mM以及丁酸钠80～200uM。

本发明的重编程培养基成分明确，品质稳定；不含动物源成分，重编程过程中不需要动物源细胞做饲养层，使培养的重编程在移植后不容易产生人体排斥反应，且重编程效率，细胞谱系广，可以培养包括人皮肤成纤维，外周血单核细胞，羊膜上皮细胞等细胞。

优选的，重编程添加剂1包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及氢化可的松0.9-1.1uM；重编程添加剂2包括碳酸钠540～550ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及丙戊酸0.9～1.2mM以及丁酸钠140～160uM。

进一步优选的，重编程添加剂1包括碳酸氢钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及氢化可的松1uM；重编程添加剂2包括碳酸钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及丙戊酸1mM以及丁酸钠150uM。

根据本发明一种典型的实施方式，基础培养基保存在4～8℃，重编程添加剂1及重编程添加剂2保存在-20～-80-℃单独冰冻保存。重编程添加剂1及重编程添加剂2含有生长因子，在-20～-80-℃保存可以保持稳定在一年以上。

优选的，重编程培养基在使用前配制成重编程培养基1和重编程培养基2，其配置比例可以按照实际情况进行配比，根据本发明一种典型的实施方式，具体包括以下步骤：在2～8℃化冻重编程添加剂1及重编程添加剂2；将重编程添加剂1与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基1；将重编程添加剂2与基础培养基以7:500的体积配混合后形成重编程培养基2。优选的，重编程培养基1和重编程培养基2在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重编程细胞的培养方法。该培养方法是采用上述重编程培养基培养。

优选的，包括以下步骤：S1，将重编程细胞接种到铺有基质胶（Matrigel）或玻璃粘连蛋白（Vitronectin）的培养皿中；S2，向培养皿中加入重编程培养基1，每隔一天换一次重编程培养基1，在重编程培养基1中培养重编程细胞3～5天；S3，去除重编程培养基1，向培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次重编程培养基2，在重编程培养基2中培养重编程细胞10～25天。在此种条件下培养细胞，更有利于细胞的生长。

下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。

在下列实施例中，重编程添加剂1及重编程添加剂2通过以下步骤配置：

重编程添加剂1：

第一步：配制各种成分的储备液：①碳酸氢钠75mg/ml、②硒酸钠70ug/ml、③重组人胰岛素（Insulin）4mg/ml、④重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）200ng/ul、⑤重组人转铁蛋白（Holo-transferin）50mg/ml、⑥抗坏血酸（L-Ascorbic acid）64mg/ml以及⑦氢化可的松2mM。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为碳酸氢钠400～600ug/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素（Insulin）15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）80～120ng/ml、重组人转铁蛋白（Holo-transferin）7～13ug/ml、抗坏血酸（L-Ascorbic acid）50～70ug/ml以及氢化可的松0.5-2uM的工作液。

重编程添加剂2：

第一步：配制各种成分的储备液：①碳酸氢钠75mg/ml、②硒酸钠70ug/ml、③重组人胰岛素（Insulin）4mg/ml、④重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）200ng/ul、⑤重组人转铁蛋白（Holo-transferin）50mg/ml、⑥抗坏血酸（L-Ascorbic acid）64mg/ml以及⑦丙戊酸2M以及丁酸钠200mM。

第二步：在室温下将以上各种成分的储备液按照以上储备液编号顺序依次混合，成为终浓度为碳酸钠400～600ug/ml、硒酸氢钠8～20ng/ml、重组人胰岛素（Insulin）15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）80～120ng/ml、重组人转铁蛋白（Holo-transferin）7～13ug/ml、抗坏血酸（L-Ascorbic acid）50～70ug/ml、丙戊酸0.5～2mM以及丁酸钠80～200uM的工作液。

实施例1-5中的重编程培养基的组分如表1所示。

表1

对比例1中的培养基为Stemcell出品的TeSR-E7，对比例2为Life出品的E6。

实施例1-5中的重编程培养基中3种独立的组分在-20～-80-℃单独冰冻保存。

将上述实施例1-5中的重编程培养基按照如下步骤配制：

在2～8℃化冻重编程添加剂1和重编程添加剂2，随后将重编程添加剂1和重编程添加剂2分别加入基础培养基形成重编程培养基1和重编程培养基2，重编程培养基1和重编程培养基2可在2～8℃稳定储存达两周。

重编程培养基1：将3.5ml重编程添加剂1与250ml基础培养基混合后形成重编程培养基1。

重编程培养基2：将3.5ml重编程添加剂2与250ml基础培养基混合后形成重编程培养基2。

重编程细胞培养实施例

实验一：

1.实验材料：人皮肤成纤维细胞

2.培养基：实施例1-5中的重编程培养基

3.实验步骤：

S1，质粒电转：将携带重编程因子的episomal质粒与5×105成纤维细胞混合，利用电转系统（Amaxa）将重编程因子转导入细胞中，将电转后的细胞接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S2，向培养皿中加入重编程培养基1，每隔一天换一次重编程培养基1，在重编程培养基1中培养重编程细胞3～5天；

S3，去除重编程培养基1，向培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次重编程培养基2，在重编程培养基2中培养重编程细胞10～15天左右会观察到小的iPS克隆；在重编程培养基2中培养重编程细胞20-25可以得到典型的人iPS克隆，通过碱性磷酸酶（AP）染色对产生的iPS克隆进行计数，对不同培养基的重编程效果进行比较。

图1示出了实验一中实施例5的培养基培养人皮肤成纤维细胞在重编程过程中不同生长阶段的图像，其中，A图为转导前的人皮肤成纤维细胞；B图为经携带重编程因子的质粒电转第二天的电镜图，人皮肤成纤维细胞贴壁到基质胶铺底的培养皿上；C图示出了电转第7-9天的图像；D图示出了电转第15天的图像；E图示出了电转第20天的图像；F图示出了电转第25天的图像。

AP染色阳性的iPS克隆数目见图2。

实验二：

1.实验材料：人羊膜上皮细胞

2.培养基：实施例1-5中的重编程培养基

3.实验步骤：

S1，质粒电转：将携带重编程因子的episomal质粒与5×105人羊膜上皮细胞混合，利用电转系统（Amaxa）将重编程因子转导入细胞中，将电转后的细胞接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S3，去除重编程培养基1，向培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次重编程培养基2，在重编程培养基2中培养重编程细胞5～7天左右会观察到小的iPS克隆；在重编程培养基2中培养重编程细胞10-15可以得到典型的人iPS克隆，通过碱性磷酸酶（AP）染色对产生的iPS克隆进行计数，对不同培养基的重编程效果进行比较。

实验结果如图3所示。

实验三：

1.实验材料：人外周血单核细胞

2.培养基：实施例1-5中的重编程培养基

3.实验步骤：

S1，质粒电转：将携带重编程因子的episomal质粒与5×106人外周血单核细胞混合，利用电转系统（Amaxa）将重编程因子转导入细胞中，将电转后的细胞接种到铺有Matrigel的培养皿中；

S3，去除重编程培养基1，向培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次重编程培养基2，在重编程培养基2中培养重编程细胞15～20天左右会观察到小的iPS克隆；在重编程培养基2中培养重编程细胞25-30可以得到典型的人iPS克隆，通过碱性磷酸酶（AP）染色对产生的iPS克隆进行计数，对不同培养基的重编程效果进行比较。

实验结果如图4所示。

综上，从实验一、二、三的结果（图2-4）可以看出，本发明的重编程培养基重编程效高率，重编程细胞谱系广，可以重编程培养包括人皮肤成纤维，外周血单核细胞，羊膜上皮细胞等细胞。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种重编程培养基，其特征在于，包括基础培养基，重编程添加剂1及重编程添加剂2；

其中，所述基础培养基为DMEM/F12培养基；

所述重编程添加剂1包括碳酸氢钠400～600ug/ml、硒酸钠8～20ng/ml、重组人胰岛素15～30ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml、重组人转铁蛋白7～13ug/ml、抗坏血酸50～70ug/ml以及氢化可的松0.5～2uM；

所述重编程添加剂2包括碳酸氢钠400～600ug/ml，硒酸钠8～20ng/ml，重组人胰岛素15～30ug/ml，重组人碱性成纤维细胞生长因子80～120ng/ml，重组人转铁蛋白7～13ug/ml，抗坏血酸50～70ug/ml，丙戊酸0.5～2mM以及丁酸钠80～200uM。

2.根据权利要求1所述的重编程培养基，其特征在于，

所述重编程添加剂1包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及氢化可的松0.9～1.1uM；

所述重编程添加剂2包括碳酸氢钠520～580ug/ml、硒酸钠12～16ng/ml、重组人胰岛素18～22ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子90～110ng/ml、重组人转铁蛋白10～12ug/ml、抗坏血酸63～66ug/ml以及丙戊酸0.9～1.2mM以及丁酸钠140～160uM。

3.根据权利要求2所述的重编程培养基，其特征在于，

所述重编程添加剂1包括碳酸氢钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及氢化可的松1uM；

所述重编程添加剂2包括碳酸钠543ug/ml、硒酸钠14ng/ml、重组人胰岛素20ug/ml、重组人碱性成纤维细胞生长因子100ng/ml、重组人转铁蛋白11ug/ml、抗坏血酸65ug/ml以及丙戊酸1mM以及丁酸钠150uM。

4.根据权利要求1所述的重编程培养基，其特征在于，所述基础培养基保存在4～8℃，所述重编程添加剂1及重编程添加剂2保存在-20～-80℃单独冰冻保存。

5.根据权利要求4所述的重编程培养基，其特征在于，所述重编程培养基在使用前配制成重编程培养基1和重编程培养基2，具体包括以下步骤：

在2～8℃化冻所述重编程添加剂1及重编程添加剂2；

将所述重编程添加剂1与所述基础培养基以7:500的体积配混合后形成所述重编程培养基1；

将所述重编程添加剂2与所述基础培养基以7:500的体积配混合后形成所述重编程培养基2。

6.根据权利要求5所述的重编程培养基，其特征在于，所述重编程培养基1和所述重编程培养基2在使用前0～14天配制，并在2～8℃保存。

7.一种重编程细胞的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1至6中任一项所述的重编程培养基培养。

8.根据权利要求7所述的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，将重编程细胞接种到铺有基质胶或玻璃粘连蛋白的培养皿中；

S2，向所述培养皿中加入重编程培养基1，每隔一天换一次所述重编程培养基1，在所述重编程培养基1中培养所述重编程细胞3～5天；

S3，去除所述重编程培养基1，向所述培养皿中加入重编程培养基2，每隔一天换一次所述重编程培养基2，在所述重编程培养基2中培养所述重编程细胞10～30天。