CN112961829B - 一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用 - Google Patents

一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用。本申请中通过对培养基的各种成分进行筛选、调整、组合且对数值范围进行研究，同时协同配合从大量生物亲和性滤膜中进行选择，以及相应的培养操作过程，最终实现了胚胎脊髓在体外的不同时间长度下(1周和3周以上)存活生长。

Description

一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的 建立方法及应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用。
背景技术
儿童脑室周围白质软化症(Periventricular Leuko-malacia，PVL)是缺血缺氧性脑病的一种后期改变，并且是造成早产儿脑瘫(主要是痉挛性下肢瘫或四肢瘫)的主要原因，PVL是一种继发性脑白质病，见于早产儿及产后窒息的存活儿童，由于缺血缺氧性脑实质损伤，引起脑室周围白质软化，导致双侧痉挛性偏瘫、四肢瘫、智能低下。由于脑白质软化患儿的缺氧是在出生后发生的，一般胚鼠的脊髓需要培养到胚胎期E19.5-E21.5(小鼠孕期19-21天)左右进行缺氧处理，且缺氧损伤之后再生一般需要14天以上，所以在模拟脑白质软化的缺氧损伤和再生过程时就需要长时间(20天以上)对胚鼠的脊髓进行培养。
但是，目前的现有技术中在小鼠胚胎脊髓体外培养中仅能够实现3-6天的短期培养。因此，建立小鼠胚胎脊髓体外长期培养技术具有重大意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种胚胎脊髓体外长期培养体系，包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为5％explant culture medium：DMEM/F12+5％FBS+P/S+Glucose，培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50ug/ml及链霉素(S)25ug/ml；
所述生物亲和性滤膜为White FHLC Membrane。
一种胚胎脊髓体外短期培养体系，包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为1％explant culture medium：DMEM/F12+1％FBS+1％N2+2％B27+15nM T3+P/S+Glucose；培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50ug/ml及链霉素(S)25ug/ml；
所述生物亲和性滤膜为Mixed Cellulose Esters Membrane。
如上述的一种胚胎脊髓体外长期培养体系或体外短期培养体系在胚胎脊髓体外培养中的应用，所述胚胎脊髓体外培养的方法包括将食品级不锈钢环放置孔板内，并加入体外培养的培养基，将胚胎脊髓从背侧分开，平摊在生物亲和性滤膜上，室管膜部分朝上，将生物亲和性滤膜放置于孔板的钢环上，37℃，5％二氧化碳、氧气供应充分状态漂浮培养，隔天半换培养基。
一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法，包括：将胚胎期E13.5时期的小鼠脊髓按照上述的胚胎脊髓体外培养的方法培养，体外培养2天后进行缺氧处理，2天后恢复正常氧浓度，继续长期培养即可，可继续培养至少17天。
如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在建立脊髓缺氧损伤模型中的应用。
如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在髓鞘发育再生研究中的应用。
如上述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在脊髓缺氧损伤再生药物筛选中的应用。
进一步地，所述应用的应用方法中，药物筛选过程中药物的使用时间为恢复正常氧浓度后一天进行药物干预，继续培养16天后，进行相关参数的检测。如可以检测培养组织内髓鞘化程度，从而了解药物对髓鞘再生的影响。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
胎鼠脊髓体外培养的技术为研究髓鞘发育再生和未来的药物筛选提供了一个优良的实验平台。该平台具有体外培养的优势，时间比动物饲养短，费用低，易于进行药物干预，方便建立大规模药物筛选的实验。同时，它保存了脊髓的组织架构，包括了所有脊髓神经元和胶质细胞，比细胞培养更加接近在动物体内药物作用的效果。从整体动物水平上的新生鼠缺氧引起的髓鞘损伤修复模型，可以最大限度上利用模式动物来模拟新生儿脑白质损伤，可以更好的了解药物在动物体内的代谢和应用于临床的可能性。
本申请中将脊髓体外培养，和对照组进行对比，可以复现体内的髓鞘发育不良的情况，从而为髓鞘发育不良及修复或再生研究提供基础。
本申请中通过对培养基的各种物质成分种类、用量进行筛选、调整，进行不同物质及用量的组合配合，同时协同配合使用各种生物亲和性滤膜，以及不同的培养操作过程进行实验探究。发现，不同的培养基结合同一种滤膜、或同一种培养基结合不同的滤膜在实验效果方面差异非常大，说明其相互之间具有较大的协同作用。最终在本申请要求保护的技术方案条件下实现了低成本的胚胎脊髓长期存活生长。
附图说明
图1是实施例1体外脊髓短期培养效果图；
图2是实施例1髓鞘分子MBP的原位杂交染色显示体外脊髓短期培养效果图；
图3是本申请技术路线图；
图4是实施例4的实验效果图；
图5是不同转基因小鼠脊髓在特定培养条件下组织培养后MBP表达对比结果(原位杂交)；
图6是特定组织培养条件下，脊髓组织培养效果图，原位杂交技术标记MBP的表达；
图7是实施例2中不同生物膜实验结果；
图8是实施例2中不同培养基实验结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一种胚胎脊髓体外培养体系、胚胎脊髓体外缺氧损伤模型的建立方法及应用，具体如下各实施例所示。
本申请中涉及的物品材料包括：体式显微镜、高压的器械及载膜的食品级钢环、高压消毒后的玻璃巴氏吸管、细菌培养皿、75％酒精、冰、培养基、生物活性滤膜、12孔板、24孔板。
材料试剂：
DMEM/F12(Hyclone 30023.01B)糖浓度3.15mg/ml；
FBS(NTC-HK011)；
Mixed Cellulose Esters Membrane(Merck Millipore Ltd.AABP02500)；
White FHLC Membrane(Merck Millipore Ltd.FHLC04700)；
Penicillin-Streptomycin，Liquid(Gibco 15140122)每毫升包含10000单位青霉素(碱)和10000μg链霉素(碱)；
100xN2 supplement(Invitrogen 17502048)；
50x B27(Invitrogen 17504044)；
T3(Triiodothyronine，Sigma，T-2752)。
原液浓度：
Glucose用ddH2O配成500mg/ml(每50ml D/F加350ul，使其在培养基浓度达到6.5mg/ml)。
T3 15uM用高压灭菌后ddH2O稀释成15mM(1000倍浓缩液)。
P/S每毫升包含10000单位青霉素和10000μg链霉素(100倍浓缩液)。
操作过程：
1.将胚胎期小鼠(E13.5)由母鼠体内取出，放置于预冷到4度的DMEM/F12培养基中；将体式显微镜周围用酒精喷洒消毒。
2.体式显微镜下在预冷的DMEM/F12中将脊髓取出，用超精细镊小心剥去脊髓表面脊膜，(注意不要损伤脊髓！！)用手术刀片从颈弯开始，沿纵轴切成约2mm小段，一般每4段合在一起作为同一部分(一般一个脊髓可以分成A、B、C三部分，每部分的发育情况不完全一样)。每一小段脊髓都需要用钛合金镊子在背侧打开，用巴氏吸管放入相应24孔板中备用(冰上操作)。
3.在超净台内将高压消毒好的不锈钢环放置12孔板内，并加上培养基。
4.在超净台中，在简易式体式显微镜下，用巴氏吸管将脊髓转移到具生物亲和性滤膜上(冰上操作，长期培养用薄的白膜(如White FHLC Membrane)，短期培养可以用厚的黑膜(如Mixed Cellulose Esters Membrane))。让脊髓从背侧分开，像翻开的书本一样平摊在生物膜上，室管膜部分朝上。吸去多余液体，将生物膜放置到12孔板内的钢环上进行漂浮培养，以保障氧气养分的供应，具体条件为恒温培养箱里，37℃，5％二氧化碳+空气。
5.培养过程中隔天半换液，也即两天换一半的培养液。
实施例1体外脊髓的短期培养技术
本申请本实施例中建立了胚胎期(怀孕后11.5-13.5天，E11.5-13.5)小鼠脊髓体外短期培养(3-6天)的技术。
短期培养(一周)所用培养基及生物膜如下，百分比为体积百分比：
1％explant culture medium：DMEM/F12+1％FBS+1％N2+2％B27+15nM T3+P/S(p50ug/ml；s 25ug/ml)+Glucose(每50ml培养基加350ul，使其在培养基浓度达到6.5mg/ml)。
Mixed Cellulose Esters Membrane(Merck Millipore Ltd.AABP02500)。
按照上述的操作过程进行培养。
本实施例中通过验证实验来证明本申请的短期培养技术能够重现体内的过程。P110alpha基因敲除小鼠有髓鞘发育的缺陷，而本申请的体外培养系统能够重现这个发育缺陷，从而证明体外短期培养体系的成功。
体内培养正常出生：本申请本实施例中选用P110alpha基因敲除小鼠来验证本申请的短期培养体系。该基因敲除小鼠髓鞘发育有缺陷，出生后第七天，通过原位杂交方法检测髓鞘分子MBP和PLP的mRNA表达与对照小鼠(正常小鼠出生7天)相比，表达量相对较低。
体外培养：利用本申请的短期培养体系进行体外培养。其中，KO组是胚鼠基因敲除，受精发育13.5天+5天体外培养。对照组是正常胚鼠，受精发育13.5天+5天体外培养。之后，进行原位杂交检测到，发现，KO组MBP和PLP mRNA表达都比对照组的要低，与体内发育情况一致。
效果图见图1所示，其中该图第一排显示出生后第七天，P110alpha基因敲除小鼠(KO)脊髓的MBP mRNA表达比对照组(Wt)要低。第二排图显示KO组胚鼠体外培养5天后(胚胎13.5天取材)，MBP mRNA表达也比对照组(wt)要低。下面两排是显示PLP髓鞘分子的表达情况，与MBP mRNA表达情况相同。该实验证明本实施例的体外短期培养系统能够复现体内发育的情况，效果非常好。
胚鼠脊髓体外组织培养后3天、4天和6天进行髓鞘分子MBP的原位杂交染色。在体内正常发育，MBP的染色表现出由腹侧向背侧迁移的表达模式。在体外培养条件下，MBP的染色表现出同样的模式，由腹侧(在培养条件下是中央)向背侧(外侧)迁移。效果图如图2所示。
本实验中，发明人测试了几种不同的条件。原来的文献中主要用5％的FBS，具体配方是DMEM/F12+5％FBS+P/S+Glucose。我们发现在这种条件下，脊髓体外培养成活，但是髓鞘发育缺陷小鼠(P110alpha基因敲除小鼠)和正常小鼠的体外培养后，髓鞘发育情况一样，显示不出P110alpha基因敲除小鼠髓鞘发育缺陷的表型(如图5所示)。我们去掉FBS，采用成髓鞘细胞——少突胶质细胞培养液来培养(DMEM/F12+1％N2+2％B27+15nM T3+P/S+Glucose)，结果髓鞘组织两天内死亡(见图6)。多次试验后发现在1％FBS条件下既可以保证髓鞘体外培养的成活，又可以真实地反映髓鞘发育缺陷小鼠(P110alpha基因敲除小鼠)的髓鞘发育缺陷表型，较好的复现体内髓鞘发育的过程。本申请发明人认为这种培养条件比较适合用于模拟体内髓鞘发育过程。
实施例2体外脊髓的长期培养技术
发明人利用实施例1中的短期培养技术尝试进行长期培养时发现，存活均低于10天，无法满足长期培养(>20天)的要求。迄今，现有技术中报道的培养体系一般很难实现长期培养，且存在培养体系价格非常高昂的现象，特别是滤膜部分，部分培养体系培养一个组织块就需要价值50元人民币的滤膜，而且滤膜不能重复使用，这导致实验及应用成本非常高。
发明人做了长期的实验，试验了几十种培养基和近十种不同的滤膜，并进行不同的组合。由于培养周期较长(20天以上)，发明人花了几年时间来进行这一工作，在2019年终于取得成功，确定了培养基的组分和滤膜的选择。
长期培养(3-4周)：培养基及生物膜如下，注意每次换液时，在组织表面滴加极少量(10ul)培养液，以免组织表面干燥。下述百分比为体积百分比。
5％explant culture medium：DMEM/F12+5％FBS+P/S(p 50ug/ml；s 25ug/ml)+Glucose(每50ml培养基加350ul，使其在培养基浓度达到6.5mg/ml)。
White FHLC Membrane(Merck Millipore Ltd.FHLC04700)。
发明人在实验中测试发现，只有White FHLC Membrane可以让髓鞘组织培养到20天以上，所有其他的膜，包括短期培养中用过的Mixed Cellulose Esters Membrane都只能培养到7-10天，之后组织就开始萎缩，溶解(图7)。在培养基方面，开始是采用25％的马血清(horse serum)，由于马血清常用于免疫组化实验，在细胞培养上很少用到，所以细胞培养级别的马血清很难买到，而且价格高昂，加上使用量大(25％)，所以费用高。通过各种尝试，发明人发现10％和5％FBS均可以顺利培养髓鞘组织到20天以上，而2％和1％FBS培养的髓鞘组织存活到10天左右开始降解，即使培养基中加入1％N2+2％B27+15nM T3也难以维持髓鞘组织的长期培养(图8)。从成本上考虑，我们采用5％FBS。
实施例3体外缺氧损伤/再生模型的确定
在体外脊髓的长期培养技术建立以后，发明人着手建立体外缺氧损伤/再生的模型，将重点确定缺氧处理的时间、药物干预的时间和再生的时间，及其相互之间的协同影响。通过相关的髓鞘指标分子的免疫荧光或者原位杂交的实验，确定最佳的实验方案。体外模型需要能模拟或复现体内缺氧损伤修复的过程。通过对多个髓鞘指标分子和神经元/轴突指标分子的染色来确定体外模型缺氧处理的时间、药物干预的时间和再生的时间长短，明确损伤和修复过程中各个不同的标志性的时间点。
发明人经过一系列实验(主要通过选择不同缺氧处理时间，其他条件比如药物干预时间需要根据药物作用机制不同来确定)，建立了小鼠胚胎脊髓的体外缺氧损伤/再生的模型。其技术路线如图3所示。
E13.5胚鼠脊髓体外培养2天后进行缺氧处理(1％氧浓度)，2天后恢复正常氧浓度(20％氧浓度)，一天后进行药物干预，继续培养16天后，就可以检测培养组织内髓鞘化程度。
正常组织的生理氧浓度大约在2％左右，1％氧浓度是一个较为温和的缺氧条件，适合做缺氧损伤后的自发修复实验。缺氧1天后，情况不是很稳定，有的情况下组织没有明显的缺氧损伤。缺氧3天以上，组织损伤比较严重，自发修复很难，而且很不完全。所以本发明选择缺氧2天。
实施例4体外缺氧损伤/再生模型的应用
胚鼠脊髓体外培养在培养2天后进行1％氧浓度下培养两天，进行缺氧损伤处理，之后恢复正常氧浓度，在正常培养条件下进行14-17天培养后能部分修复。
图4是本实施例长期培养的效果图(大于20天)，敲除P110alpha基因不利于缺氧损伤后的修复，而PI3K信号通路激动剂SC79(AA)能够有效的促进修复过程。实验中，SC79直接加入培养液中，浓度为4μg/ml。
本申请改进了膜和培养基，比以前的技术成本上，省了100倍左右，其中生物膜的价格从50元/样本降低到1元/样本，血清的使用也大大降低。平均下来，价格上降低到已有技术的1-2％。
本申请的这一体外长期培养体系，能够较好的用于体外大规模的药物筛选实验。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种胚胎脊髓体外长期培养体系，其特征在于：包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为5％explant culture medium：DMEM/F12+5％FBS+P/S+Glucose，培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50μg/ml及链霉素(S)25μg/ml；
所述生物亲和性滤膜为White FHLC Membrane。
2.一种胚胎脊髓体外短期培养体系，其特征在于：包括培养基和生物亲和性滤膜，所述培养基为1％explant culture medium：DMEM/F12+1％FBS+1％N2+2％B27+15nM T3+P/S+Glucose；培养基中Glucose浓度为6.5mg/ml；其中P/S包括青霉素(P)50μg/ml及链霉素(S)25μg/ml；所述生物亲和性滤膜为Mixed Cellulose Esters Membrane。
3.如权利要求1所述的一种胚胎脊髓体外长期培养体系或权利要求2所述的一种胚胎脊髓体外短期培养体系在胚胎脊髓体外培养中的应用，所述胚胎脊髓体外培养的方法包括将食品级不锈钢环放置孔板内，并加入体外培养的培养基，将胚胎脊髓从背侧分开，平摊在生物亲和性滤膜上，室管膜部分朝上，将生物亲和性滤膜放置于孔板的钢环上，37℃，5％二氧化碳状态漂浮培养，隔天半换培养基。
4.一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法，其特征在于，包括：将胚胎期E13.5时期的小鼠脊髓按照如权利要求3中所述的胚胎脊髓体外培养的方法培养，体外培养2天后进行缺氧处理，2天后恢复正常氧浓度，继续长期培养即可。
5.如权利要求4所述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在建立脊髓缺氧损伤模型中的应用。
6.如权利要求4所述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在髓鞘发育再生研究中的应用。
7.如权利要求4所述的一种胚胎脊髓的体外缺氧损伤模型的建立方法在脊髓缺氧损伤再生药物筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用的应用方法中，药物筛选过程中药物的使用时间为恢复正常氧浓度后一天进行药物干预，继续培养16天后，进行相关参数的检测。
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