CN109415694A - 用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法 - Google Patents

用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法 Download PDF

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Abstract

提供了用于通过使用三维细胞培养过程产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法、干细胞的三维细胞聚集体在产生细胞外囊泡中的用途、包含高浓度细胞外囊泡的干细胞的三维细胞聚集体的培养物，以及包含所述培养物的药物组合物。

Description

用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法
技术领域
本公开涉及一种使用三维细胞培养过程产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法、干细胞的三维细胞聚集体在产生细胞外囊泡中的用途、包含高浓度细胞外囊泡的干细胞的三维细胞聚集体的培养物，以及包含所述培养物的药物组合物。
背景技术
作为用于治疗无法治愈/难治性疾病的新范例，成人干细胞疗法已广泛应用于临床试验，并已报道了许多成功病例。
然而，存在离体培养以增殖从患者或供体中提取/选择的干细胞期间，由异种血清(例如，胎牛/小牛血清)的内化引起的人畜共患病问题；当干细胞被移植到体内时，由干细胞特征(诸如有力的增殖能力、相对大的细胞大小等)引起的肿瘤形成问题；风险因素(诸如导致梗塞的血管闭塞等)，并且因此，有必要找到用于成功进行干细胞注射/移植的疗法的解决方案。
此外，干细胞疗法的多功能性存在限制，因为当应用使用自体干细胞的疗法时，干细胞在干细胞的细胞外增殖能力、对病变的迁移能力、治疗因子分泌能力等方面的治疗功效在患者之间不同。
因此，已积极地进行了许多研究以避免可能由直接使用上述活干细胞引起的各种风险因素或问题。一些研究已报道了源自干细胞的细胞外囊泡可代替干细胞的治疗功能的结果(细胞和分子生命科学(Cell.Mol.Life Sci.)(2011)68:2667–2688)。
已出现了使用源自干细胞的细胞外囊泡的疗法，其可代替活干细胞的直接注射/移植。所述疗法在临床前试验中显示出许多功效，并且据报道一些病例已进入临床试验。
通过从患者或供体中提取和选择干细胞并使其在二维培养板中增殖来进行现有的干细胞培养。已知当在实验室中在二维培养板中培养成体干细胞时，生物学特性诸如原始干细胞能力和治疗因子分泌能力显著降低。
源自干细胞的细胞外囊泡的多项临床前研究已证明了它们的治疗功效，但通过现有二维培养技术在实验室中培养的干细胞具有非常低的细胞外囊泡分泌能力。因此，存在的问题是细胞外囊泡的产率太低而不能用作治疗剂。最近，据报道，通过在低氧条件下培养间充质干细胞，相当成功地增强了干细胞的细胞外囊泡分泌。然而，产率仍然很低，并且不足以应用于临床治疗。
为了将治疗性源自干细胞的细胞外囊泡的应用范围从研究阶段扩展到实际临床治疗，需要开发以足以向患者施用的量大量生产细胞外囊泡的技术。
发明内容
技术问题
为了解决这种低产率的问题，提供了一种以临床适用规模大量生产源自干细胞的细胞外囊泡的方法，其中进行干细胞的三维培养以形成类似于体内环境的条件，从而增加干细胞的活性和功能性。
一方面提供了一种产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法，所述方法包括进行干细胞的三维培养。
另一方面提供了一种用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的组合物，所述组合物包含通过干细胞的三维培养形成的干细胞聚集体。
又一方面提供了通过干细胞的三维培养形成的干细胞聚集体在产生源自干细胞的细胞外囊泡中的用途。
又一方面提供了一种通过培养干细胞聚集体获得的培养物。
又一方面提供了一种包含通过培养干细胞聚集体获得的培养物的药物组合物。
技术方案
已证明，干细胞的三维培养允许细胞自发地聚集以形成细胞聚集体，并且产生类似于干细胞所起源于的三维组织的体内细胞增殖环境和/或条件的环境和/或条件，并且因此，即使在实验培养期间，也可恢复或增强干细胞的原始生物活性，包括干细胞性、治疗因子分泌能力等。例如，当通过三维培养来培养间充质干细胞(MSC)时，发生细胞的自聚集，这类似于体内间充质组织中产生的间充质凝聚事件，并且因此，可恢复或增强干细胞的原始生物活性。因此，这表明当通过干细胞的三维培养形成细胞聚集体时，产生了类似体内的微环境，并且干细胞的原始活性被恢复或增强，并且因此，可以大量生产由干细胞分泌的细胞外囊泡。
本公开的一方面提供了一种产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法，所述方法包括进行干细胞的三维培养。
如本文所用，干细胞可用于包括胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞(iPS细胞)和祖细胞。例如，干细胞可以是选自由以下各项组成的组中的一种或多种：胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和祖细胞。干细胞可以是同源干细胞和/或自体干细胞。
胚胎干细胞可以是源自胚胎的干细胞，其中干细胞具有分化成任何组织的细胞的能力。
诱导多能干细胞(iPS细胞)也称为去分化干细胞并且是指具有多能性的细胞，如通过将细胞分化相关基因注入到分化的体细胞中并且在分化之前将其返回细胞阶段而诱导的胚胎干细胞。
类似于干细胞，祖细胞具有分化成特定类型细胞的能力，但祖细胞比干细胞更具特异性和靶向性，并且与干细胞不同，其经历有限数量的分裂。祖细胞可以是间充质祖细胞，但不限于此。在本公开中，祖细胞包括在干细胞的类别中，并且除非另有说明，否则“干细胞”被解释为包括祖细胞。
成体干细胞是从脐血(脐带血)或成人骨髓、血液、神经等中提取的干细胞，并且是指在它们即将分化成特定器官细胞之前的原始细胞。成体干细胞可以是选自由以下各项组成的组的一种或多种：造血干细胞、间充质干细胞和神经干细胞。成体干细胞可以是哺乳动物例如人的成体干细胞。成体干细胞有利地用于治疗不可治愈/难治性疾病，因为各种成体干细胞用于再生医学中实际需要的各种器官，并且成体干细胞可在移植后根据器官的特性进行分化，而它们难以增殖并且趋于易于分化。
在一个实施方案中，成体干细胞可以是间充质干细胞，例如，人间充质干细胞。间充质干细胞(MSC)，也称为间充质基质细胞(MSC)、多能基质细胞，其可分化成各种细胞，诸如成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞等。间充质干细胞可选自源自非骨髓组织(诸如胎盘、脐带血、脂肪组织、成人肌肉、角膜基质、婴儿牙齿牙髓等)的多能细胞。
细胞外囊泡意指颗粒状结构，其中从细胞释放(分泌)到细胞外环境中的各种生物分子，诸如具有各种功能的蛋白质(例如，各种生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子等)、RNA(mRNA、miRNA等)、脂质被与生物分子源自的细胞的膜相同的脂双层膜包围。
细胞外囊泡可以是源自干细胞的细胞外囊泡。
源自干细胞的细胞外囊泡可以是由干细胞释放的具有约50nm至约1微米(μm)平均直径的任何囊泡，并且具体地，是由干细胞释放的具有约100nm至约1μm平均直径的囊泡(也称为微囊泡)或具有约50nm至约100nm平均直径的囊泡(也称为外来体)或其混合物。在本公开中，除非另有说明，否则细胞外囊泡、微囊泡和外来体可彼此互换使用而不管其大小。
源自干细胞的细胞外囊泡是由囊泡所源自的干细胞的细胞膜包围的颗粒结构。源自干细胞的细胞外囊泡不仅可包括有用的生物分子(诸如蛋白质、核苷酸等)，而且还可包括作为囊泡膜的所有细胞膜组分，包括位于囊泡所源自的干细胞的细胞膜中的各种受体和通道，并且因此，源自干细胞的细胞外囊泡可在细胞与细胞的通信以及由干细胞通过细胞膜组分进行的与周围微环境的相互作用中起重要作用。
此外，由于位于细胞外囊泡的膜中的各种受体可特异性结合存在于其他细胞的细胞膜或细胞外基质中的特定配体，因此可以靶向特定的细胞、组织或微环境。
此外，在细胞外囊泡中，各种生物分子(诸如具有各种功能的蛋白质、RNA、脂质)被脂质双层膜包围，这可保护内部包封物免受降解酶和/或降解化学物质的影响，从而延长其保质期。
因此，与从干细胞直接细胞外释放治疗上有用的生物分子相比，包围在细胞外囊泡中的生物分子的释放可允许更安全和更具选择性的靶递送，并且还可参与细胞与细胞的通信。因此，有利的是生物分子可更适当和有效地发挥其功能。由于此优点，源自干细胞的细胞外囊泡的重要性已在使用干细胞的各种疗法中日益增加。
当如在现有培养方法中通过二维培养在板上培养干细胞时，它们被在单层的二维平面结构中培养。然而，干细胞所源自的体内组织具有三维结构，而不是二维平面结构。与三维组织相比，通过现有的二维细胞培养过程产生的单层细胞培养物显示出细胞与细胞接触的减少。因此，可能不会发生如在体内三维组织中的细胞之间或细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用。如上所述，当通过现有培养方法培养干细胞时，细胞外囊泡的产率非常低，这成为使用细胞外囊泡作为治疗剂的障碍。认为低产率与细胞之间或细胞与细胞外基质(ECM)之间的相互作用的破坏相关，所述相互作用与二维细胞培养期间由干细胞体内分泌细胞外囊泡有关。
在本公开中，如上所述，当通过三维细胞培养方法培养干细胞时，通过细胞的自聚集产生三维细胞聚集体。由此产生的三维细胞聚集体可提供类似于干细胞所源自的体内组织环境的环境。因此，它们在干细胞之间的通信中的功能变得与体内类似，并且细胞外囊泡可在相对类似于体内的环境下产生，从而导致提高细胞外囊泡的生产率。
因此，产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法可包括通过由三维细胞培养培养干细胞产生三维细胞聚集体。
通过三维细胞培养产生的三维细胞聚集体可具有例如球状结构，但不限于此。细胞聚集体可具有约50微米(μm)或更大、约70μm或更大、约100μm或更大、约130μm或更大、约150μm或更大，或约170μm或更大的平均直径以实现类似于体内组织的三维结构，并且细胞聚集体可具有约250μm、约230μm或更小，或约200μm或更小的平均直径以防止由于氧耗尽导致聚集体内的细胞坏死。例如，细胞聚集体可以是平均直径为约50μm至约250μm、约50μm至230μm、约50μm至约200μm、约70μm至约250μm、约70μm至230μm、约70μm至约200μm、约100μm至约250μm、约100μm至230μm、约100μm至约200μm、约130μm至约250μm、约130μm至230μm、约130μm至约200μm、约150μm至约250μm、约150μm至230μm、约150μm至约200μm、约170μm至约250μm、约170μm至230μm或约170μm至约200μm的三维细胞聚集体。
包含在三维细胞聚集体中的干细胞的数量可以是约10个细胞至约2500个细胞、约15个细胞至约2500个细胞、约20个细胞至约2500个细胞、约100个细胞至约2500个细胞、约200个细胞至约2500个细胞、约300个细胞至约2500个细胞、约400个细胞至约2500个细胞、约10个细胞至约2000个细胞、约15个细胞至约2000个细胞、约20个细胞至约2000个细胞、约100个细胞至约2000个细胞、约200个细胞至约2000个细胞、约300个细胞至约2000个细胞、约400个细胞至约2000个细胞、约10个细胞至约1500个细胞、约15个细胞至约1500个细胞、约20个细胞至约1500个细胞、约100个细胞至约1500个细胞、约200个细胞至约1500个细胞、约300个细胞至约1500个细胞、约400个细胞至约1500个细胞、约10个细胞至约1250个细胞、约15个细胞至约1250个细胞、约20个细胞至约1250个细胞、约100个细胞至约1250个细胞、约200个细胞至约1250个细胞、约300个细胞至约1250个细胞、约400个细胞至约1250个细胞、约10个细胞至约1000个细胞、约15个细胞至约1000个细胞、约20个细胞至约1000个细胞、约100个细胞至约1000个细胞、约200个细胞至约1000个细胞、约300个细胞至约1000个细胞、约400个细胞至约1000个细胞、约10个细胞至约800个细胞、约15个细胞至约800个细胞、约20个细胞至约800个细胞、约100个细胞至约800个细胞、约200个细胞至约800个细胞、约300个细胞至约800个细胞或约400个细胞至约800个细胞。在一个实施方案中，当三维细胞聚集体具有约150μm的平均直径时，其可包括约400个细胞至约500个细胞的干细胞，并且当三维细胞聚集体具有约200μm的平均直径时，其可包括约600个细胞至约800个细胞(例如，约700个细胞)的干细胞。
可通过本公开所属领域中已知的任何三维细胞培养技术进行三维细胞培养过程。例如，三维细胞培养过程可以是使用微孔阵列培养、多孔微球培养、悬滴培养、低附着板培养、膜基细胞分离培养、热提升(thermal lifting)培养、离心培养、半固体培养基培养等的细胞培养过程(参考：组织工程学(Tissue Engineering)：B部分，第20卷，第5号，2014)。用于三维细胞培养过程的细胞培养容器或培养支持物可用生物相容性材料诸如聚乙二醇(PEG)等进行表面处理。经表面处理的培养容器或培养支持物有利于均匀地形成大小受控制的细胞聚集体。在一个实施方案中，微孔可通过简单的公知的微制造技术诸如软光刻来制造。
为了使通过三维细胞培养过程产生的细胞聚集体具有在上述范围内的平均直径，培养容器或培养支持物(诸如微孔或多孔微球)的细胞培养空间(容器或孔的内部空间)的大小(平均直径)可以是约50μm或更大、约70μm或更大、约100μm或更大、约130μm或更大、约150μm或更大、或约170μm或更大、或约250μm、约230μm或更小、或约200μm或更小，例如，约50μm至约250μm、约50μm至230μm、约50μm至约200μm、约70μm至约250μm、约70μm至230μm、约70μm至约200μm、约100μm至约250μm、约100μm至230μm、约100μm至约200μm、约130μm至约250μm、约130μm至230μm、约130μm至约200μm、约150μm至约250μm、约150μm至230μm、约150μm至约200μm、约170μm至约250μm、约170μm至230μm或约170μm至约200μm。
通过在培养容器或培养支持物中(例如在微孔或多孔微球的每个孔中)接种细胞，并且在常规条件(例如，37℃，5％CO2)下使用干细胞培养中常用的培养基来培养细胞，可进行三维细胞培养过程直到细胞聚集体的大小变为上限。
例如，在使用微孔的三维细胞培养中，接种在每个微孔中的细胞的量可以是每微孔约1个细胞至约1000个细胞、约10个细胞至约1000个细胞、约100个细胞至约1000个细胞、约200个细胞至约1000个细胞、约300个细胞至约1000个细胞、约400个细胞至约1000个细胞、约500个细胞至约1000个细胞、约600个细胞至约1000个细胞、约1个细胞至约900个细胞、约10个细胞至约900个细胞、约100个细胞至约900个细胞、约200个细胞至约900个细胞、约300个细胞至约900个细胞、约400个细胞至约900个细胞、约500个细胞至约900个细胞、约600个细胞至约900个细胞、约1个细胞至约800个细胞、约10个细胞至约800个细胞、约100个细胞至约800个细胞、约200个细胞至约800个细胞、约300个细胞至约800个细胞、约400个细胞至约800个细胞、约500个细胞至约800个细胞、约600个细胞至约800个细胞、约1个细胞至约700个细胞、约10个细胞至约700个细胞、约100个细胞至约700个细胞、约200个细胞至约700个细胞、约300个细胞至约700个细胞、约400个细胞至约700个细胞、约500个细胞至约700个细胞或约600个细胞至约700个细胞，但不限于此。在与使用微孔的三维细胞培养方法不同的其他方法中，也可应用类似的细胞接种量，但不限于此。可使用通常认为适合于各种方法的量进行培养。
当细胞聚集体是通过三维细胞培养获得时，细胞增殖不会很大程度地发生，并且因此，接种细胞的数量和包含在三维细胞聚集体中的细胞数量可被解释为是相等的。
可培养通过三维细胞培养获得的细胞聚集体以诱导细胞的细胞外囊泡。
因此，在一个实施方案中，产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法还可包括培养细胞聚集体。
在具体实施方案中，产生源自成体干细胞的细胞外囊泡的方法可包括：
(1)通过由三维细胞培养来培养干细胞产生三维细胞聚集体；和
(2)培养细胞聚集体。
细胞聚集体的培养可在常规培养条件(例如，37℃，5％CO2)下进行。就这一点而言，细胞聚集体的培养可通过在搅拌、旋转和/或振动下进行摇动培养来进行，以增加细胞外囊泡的产生。例如，通过搅拌、旋转和/或振动进行摇动培养可以是有利的，因为可更有效地为三维细胞聚集体提供营养物和氧气。
在一个实施方案中，考虑到施加于细胞的应力，可在约40rpm或更低或约35rpm或更低的速度下在摇动下进行细胞聚集体的培养。例如，细胞聚集体的培养可在约10rpm至约35rpm、约15rpm至约35rpm、约20rpm至约35rpm、约25rpm至约35rpm或约30rpm至约35rpm的速度下在摇动下进行，但不限于此。摇动培养可以是轨道摇动、侧向摇动、圆形摇动等，并且可使用三维培养装置(诸如轨道摇动器、旋转壁容器生物反应器、旋转烧瓶等)进行，但不限于此。
细胞聚集体的培养可进行1天至30天、1天至25天、1天至20天、1天至17天、1天至15天、1天至13天、1天至10天、1天至7天、1天至5天、2天至30天、2天至25天、2天至20天、2天至17天、2天至15天、2天至13天、2天至10天、2天至7天、2天至5天、3天至30天、3天至25天、3天至20天、3天至17天、3天至15天、3天至13天、3天至10天、3天至7天、3天至5天、4天至30天、4天至25天、4天至20天、4天至17天、4天至15天、4天至13天、4天至10天、4天至7天或4天至5天。
通过培养通过三维细胞培养过程获得的细胞聚集体获得的培养物可包含从干细胞分泌的细胞外囊泡。与通过培养通过二维细胞培养过程获得的单层培养物获得的培养物相比，细胞聚集体培养物中源自干细胞的细胞外囊泡的含量可显著增加。在一个实施方案中，基于每100个干细胞的源自干细胞的细胞外囊泡的数量，通过培养通过三维细胞培养过程获得的细胞聚集体获得的培养物中源自干细胞的细胞外囊泡的含量可以是通过培养通过由二维细胞培养过程(例如，实施例1中描述的2D方法；在一般孔板中的非摇动条件下)培养相同干细胞获得的单层培养物而获得的培养物中源自干细胞的细胞外囊泡的含量的约两倍或更多、约5倍或更多、约9倍或约更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约20倍或更多、约25倍或更多、约30倍或更多、约35倍或更多、或约40倍或更多、约45倍或更多、约50倍或更多、约60倍或更多、约70倍或更多、约80倍或更多、约90倍或更多、或约100倍或更多，例如，多达约1000倍、约700倍、约500倍、约200倍、约150倍或约120倍，但不限于此。
当通过培养通过三维细胞培养过程获得的细胞聚集体获得的培养物使用例如荧光激活细胞分选(FACS)方法(例如，使用FACSVerse流式细胞仪(BD bioscience)测量)来测量时，培养物可每100个细胞包含约1个或更多、约2个或更多、约3个或更多、约5个或更多、约10个或更多、约15个或更多、约20个或更多或约25个或更多的源自干细胞的细胞外囊泡。
产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法还可包括在培养细胞聚集体后分离和/或纯化产生的细胞外囊泡。细胞外囊泡的分离和/或纯化可通过任何已知的常规方法进行，例如离心、过滤、尺寸排阻柱、exoquick等，但不限于此。
另一方面提供了一种用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的组合物，所述组合物包含干细胞聚集体。又一方面提供了一种产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法，所述方法包括培养干细胞的三维细胞聚集体。又一方面提供了干细胞的细胞聚集体在产生源自干细胞的细胞外囊泡中的用途。干细胞可从活体中分离。培养可离体进行。
细胞聚集体的培养可通过摇动培养进行，例如，通过在约10rpm至约35rpm、约15rpm至约35rpm、约20rpm至约35rpm、约25rpm至约35rpm或约30rpm至约35rpm的速度下摇动进行，但不限于此。
干细胞可以是成体干细胞，例如间充质干细胞，更具体地，是人间充质干细胞，但不限于此。
细胞聚集体可以是通过干细胞的三维细胞培养产生的三维结构。三维细胞培养物与上述相同。细胞聚集体可以是例如球状结构。细胞聚集体可具有约50μm或更大、约70μm或更大、约100μm或更大、约130μm或更大、约150μm或更大，或约170μm或更大的平均直径以实现类似于体内组织的三维结构，并且细胞聚集体可具有约250μm、约230μm或更小，或约200μm或更小的平均直径以防止由于氧耗尽导致聚集体内的细胞坏死。例如，细胞聚集体可具有约50μm至约250μm、约50μm至230μm、约50μm至约200μm、约70μm至约250μm、约70μm至230μm、约70μm至约200μm、约100μm至约250μm、约100μm至230μm、约100μm至约200μm、约130μm至约250μm、约130μm至230μm、约130μm至约200μm、约150μm至约250μm、约150μm至230μm、约150μm至约200μm、约170μm至约250μm、约170μm至230μm或约170μm至约200μm的平均直径。
又一方面提供了一种通过培养干细胞的细胞聚集体获得的培养物。当干细胞的细胞聚集体的培养物可使用例如荧光激活细胞分选(FACS)方法(例如，使用FACSVerse流式细胞仪(BD bioscience)测量)来测量时，其可每100个细胞包含约1个或更多、约2个或更多、约3个或更多、约5个或更多、约10个或更多、约15个或更多、约20个或更多、或约25个或更多，例如，约1个至约50个、约2个至约50个、约3个至约50个、约5个至约50个、约10个至约50个、约15个至约50个、约20个至约50个或约25个至约50个源自干细胞的细胞外囊泡。
在一个实施方案中，包含在通过培养干细胞的细胞聚集体获得的培养物中的源自干细胞的细胞外囊泡的数量可以为通过由现有常规二维培养方法(例如，实施例1中描述的2D方法；在一般孔板中的非摇动条件下)培养相同干细胞获得的培养物中源自干细胞的细胞外囊泡的数量的约两倍或更多、约5倍或更多、或约9倍或更多，例如，约两倍至约200倍、约5倍至约200倍、约9倍至约200倍、约两倍至约150倍、约5倍至约1500倍、约9倍至约150倍、约两倍至约120倍、约5倍至约120倍、约9倍至约120倍、约两倍至约100倍、约两倍至约100倍或约9倍至约100倍(参见图5a至图9)，但不限于此。
源自干细胞的细胞外囊泡可包含与血管生成、免疫调节、细胞迁移、抗凋亡等相关的各种治疗因子。例如，源自干细胞的细胞外囊泡可包含各种活性生物分子，诸如蛋白质(例如，各种生长因子、趋化因子、细胞因子、转录因子等)、基因、RNA(各种微RNA等)等。
因此，包含源自干细胞的细胞外囊泡的干细胞的细胞聚集体的培养物可有效地应用于各种疗法。
因此，又一方面提供了一种药物组合物，其包含干细胞的细胞聚集体和/或从其分离的细胞外囊泡的培养物。所述药物组合物可有效地用于治疗已应用了现有干细胞注射/移植疗法的疾病，诸如中枢神经系统疾病(例如中风、痴呆、脊髓损伤、帕金森病等)、关节炎、肾脏疾病、癌症等。
药物组合物可通过各种施用途径向受试者施用，诸如口服施用或肠胃外施用。例如，药物组合物可注射或移植到受试者的病变部位，或通过肠胃外途径施用，诸如血管内施用(静脉内或动脉内施用)、皮下施用等，但不限于此。
被施用药物组合物的受试者可以是选自哺乳动物(包括灵长类动物(诸如人、猴等)、啮齿动物(诸如大鼠、小鼠等))、鸟类等的动物，和/或源自其的(分离的)组织或细胞，或其培养物。
供获得作为活性成分包含在药物组合物中的干细胞的细胞聚集体的培养物的干细胞可以是源自与受试者相同物种的同源干细胞、源自受试者自身的自体干细胞或其混合物。
有益效果
近来，成体干细胞注射/移植疗法已积极地应用于治疗各种不可治愈/难治性疾病(中风、关节炎、痴呆、各种肾脏疾病、各种神经疾病、癌症等)，并且本公开可被应用为一种替代疗法以减轻由移植/注射活干细胞的疗法产生的风险因素。
附图说明
图1示出了使用软光刻微制造技术制造聚乙二醇(PEG)水凝胶微孔阵列的过程；
图2示出了显示通过三维细胞培养过程和二维细胞培养过程培养3天的培养物在显微镜下的观察结果的照片；
图3示出了显示通过三维细胞培养过程培养3天的培养物的活和死测定结果的照片；
图4a至图4d是通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(3D)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)3天获得的细胞外囊泡的FACS图(4a：3天和2D培养，4b：3天和2D w/摇动培养，4c：3天和3D培养，以及4d：3天和3D w/摇动培养)；
图5a至图5d是通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(3D)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)5天获得的细胞外囊泡的FACS图(5a：5天和2D培养，5b：5天和2D w/摇动培养，5c：5天和3D培养，以及5d：5天和3D w/摇动培养)；
图6a至图6d是通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(3D)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)7天获得的细胞外囊泡的FACS图(6a：7天和2D培养，6b：7天和2D w/摇动培养，6c：7天和3D培养，以及6d：7天和3D w/摇动培养)；
图7是示出通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(3D)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)3天获得的细胞外囊泡数量的图；
图8是示出通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(5d)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)5天获得的细胞外囊泡数量的图；
图9是示出通过二维培养(2D)、进行摇动的二维培养(2D w/摇动)、三维培养(7D)和进行摇动的三维培养(3D w/摇动)7天获得的细胞外囊泡数量的图；
图10示出了显示包含在源自干细胞的细胞外囊泡中的治疗因子的细胞因子阵列的图像；并且
图11是示出图10的图像的量化结果的图(左条(蓝色)：聚集体；右条(红色)；IBE)。
具体实施方式
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。然而，这些实施例仅用于说明目的，并且本公开的范围不旨在受这些实施例的限制。
实施例1：间充质干细胞的三维细胞培养
对于间充质干细胞的三维细胞培养，制备使用软光刻微制造技术制造的聚乙二醇(PEG)水凝胶微孔阵列(每个阵列包括1225个200μm大小的微孔)(参见图1)。将在实验室中培养的源自人骨髓的间充质干细胞接种在PEG微孔阵列上(600～700个细胞/微孔)。间充质干细胞在微孔中自发聚集以在12小时内形成具有均匀大小的细胞聚集体(具有约200μm的平均直径的球状结构)。因此，培养了每个阵列1225个具有球状结构(约200μm的平均直径)的间充质干细胞聚集体。从许多微孔阵列产生大量具有均匀大小的间充质干细胞球状体，并且然后以约35rpm的速度在轨道摇动下培养微孔阵列中的间充质干细胞球状体(培养条件：37℃；5％CO2，总培养时间段：3天、5天或7天；培养基：低葡萄糖DMEM(Invitrogen)+10％FBS+1％抗生素)。
将通过培养获得的具有均匀大小的三维间充质干细胞球状结构在轨道摇动器(Multi shaker 3D-200,FINE PCR,韩国)中以35rpm的速度在摇动下培养总共3天、5天或7天(包括球状体生产时间)。
为了比较，进行二维培养(2D和进行摇动的2D)。详细地，如上述的方法，将不进行摇动的二维培养组(2D)在一般的6孔板中培养总共3天、5天或7天，并且如上述的方法，将进行摇动的二维培养组(进行摇动的2D)以35rpm的速度在摇动下培养总共3天、5天或7天。
观察获得的间充质干细胞培养物的形态，并在图2中示出。在图2中，顶部图像是具有1×105个细胞/cm2的细胞密度(2D上的hMSC)的二维培养组的显微图像。中间图像是在具有1225个微孔的微孔阵列中接种5×105个2D培养的间充质干细胞后12小时的1225个球状体的显微图像(微孔中的D0MSC球状体)。底部图像是在将产生的1225个球状体转移至细菌级(细胞非粘性)培养皿中并且将其以35rpm在摇动下培养3天后获得的图像(进行摇动(35rpm)的悬浮液中的D3MSC球状体)。如图2所示，证实了与二维细胞培养不同，通过三维细胞培养在每个微孔中形成了一个具有均匀大小的间充质干细胞球状体。
为了检查培养的细胞的活性，使用活和死测定试剂盒(Invitrogen)根据制造商的手册使通过三维细胞培养(3天摇动培养)获得的培养物经受活和死测定。获得的结果如图3所示。如图3所示，证实了间充质干细胞球状体内的大多数细胞是活的。
实施例2：细胞外囊泡的量化
回收实施例1中通过三维细胞培养(进行摇动培养总共3天、5天或7天)获得的液体培养物。将回收的液体培养物以2,500g离心一次并以14,000g离心两次以获得在液体培养物中从干细胞分泌的细胞外囊泡，并且然后使用特异于人间充质干细胞的细胞膜的抗CD105抗体(Becton Dickinson,MCA1557F)和特异于磷脂膜的抗膜联蛋白V抗体(BectonDickinson,550474)通过荧光激活细胞分选(FACS)方法分析液体培养物中源自间充质干细胞的细胞外囊泡的量。为了比较，对于实施例1中描述的二维培养组(2D)和进行摇动的二维培养组(进行摇动的2D)，也以与上述相同的方式量化液体培养物中源自间充质干细胞的细胞外囊泡的量。
详细地，FACS方法如下进行：将20μl获得的细胞外囊泡悬浮于等体积的无菌PBS中。各自加入5μl APC荧光缀合的膜联蛋白V(脂质膜标记物)和FITC荧光缀合的CD105(人MSC标记物)阳性标记物(膜联蛋白V和CD105的各自抗体)。此过程证明，在本实施例中测量的微囊泡源自人MSC。向其中加入10μl计数珠，随后进行涡旋。向其中加入5μl 10×Ca2+结合缓冲液(Sigma)以允许膜联蛋白V和CD105结合。加入5μl PBS进行稀释，并且然后加入400μl10×Ca2+结合缓冲液进行稀释。使用FACSVerse流式细胞仪(BD bioscience)测量制备的样品。
关于获得的测量值，使用BD FACSuite软件(BD bioscience)来确定纯细胞外囊泡区域。测量总细胞外囊泡、膜联蛋白V和CD105标记物阳性细胞外囊泡，以及包括在所述区域中的计数珠180秒。
获得的结果分别在图4a(3天和2D培养)、图4b(3天和2D w/摇动培养)、图4c(3天和3D培养)、图4d(3天和3D w/摇动培养)、图5a(5天和2D培养)、图5b(5天和2D w/摇动培养)、图5c(5天和3D培养)、图5d(5天和3D w/摇动培养)、图6a(7天和2D培养)、图6b(7天和2D w/摇动培养)、图6c(7天和3D培养)和图6d(7天和3D w/摇动培养)中示出。在各图的左图中，P1表示粒径在1μm内的限制，并且P2表示具有已知大小的微珠的FACS计数用于P1的大小限制的可靠性。P2中计数的值与实际添加的微珠数量的比率是P1中计数的囊泡数量的可靠性。右图上的点是由P1中的红色框选择的区域的点，并且蓝色框中的点是对于膜联蛋白V和CD105两者为阳性的囊泡，并且所述数量用作囊泡的量化数据。
分别测量由图4a至图6d右图中的蓝色虚线框表示的，对于膜联蛋白V和CD105标记物为阳性的细胞外囊泡的数量，并且然后归一化以获得分别在图7(3天培养；对应于图4a至图4d)、图8(5天培养；对应于图5a至图5d)和图9(7天培养；对应于图6a至图6d)中示出的图。
如图5a至图9所示，对于膜联蛋白V和CD105为阳性(表示它们源自人间充质干细胞)的细胞外囊泡的数量(总MV)，与二维培养(2D或2D w/摇动)相比，通过三维培养(3D)3天(D3)增加了约9倍至约12倍，并且通过进行摇动的三维培养(3D w/摇动)3天(D3)增加了约77倍至约100倍；与二维培养(2D或2D w/摇动)相比，通过三维培养(3D)5天(D5)增加了约5倍，并且通过进行摇动的三维培养(3D w/摇动)5天(D5)增加了约51倍；与二维培养(2D或2Dw/摇动)相比，通过三维培养(3D)7天(D7)增加了约两倍至约6倍，并且通过进行摇动的三维培养(3D w/摇动)7天(D7)增加了约12倍至约43倍。这些结果表明，与二维培养相比，三维培养(进行或不进行摇动)显著增加了源自人间充质干细胞的细胞外囊泡。
实施例3：包含在通过三维细胞培养产生的源自间充质干细胞的细胞外囊泡中的治疗因子的分析
通过细胞因子阵列方法分析包含在通过三维细胞培养产生的源自间充质干细胞的细胞外囊泡中的治疗因子，并且使用购自R&D系统的Proteome ProfilerTM人XL细胞因子阵列试剂盒和包含在所述试剂盒中的组成部分(缓冲液、膜、抗体等)根据制造商的手册进行所有以下过程。
使用裂解缓冲液溶解从实施例2中获得的间充质干细胞球状体(通过3D w/摇动培养获得)分泌的细胞外囊泡的蛋白质。将涂覆有不同抗体的膜置于托盘中，并用封闭缓冲液封闭。在封闭后，向其中加入200μg每种样品，并使其在4℃下反应过夜。将膜用1x洗涤缓冲液洗涤三次并与检测抗体反应，并且然后用1x洗涤缓冲液洗涤三次。向其中加入链霉亲和素-HRP，并使其反应，并且然后将膜用1x洗涤缓冲液洗涤三次。将膜在暗室中暴露于X射线胶片10分钟。
为了比较，通过二维培养(参见实施例1的2D培养；3天培养)培养与实施例1中相同的干细胞(源自人骨髓的间充质干细胞)，并用缺血性脑提取物(IBE)处理24小时。使获得的培养物经受与上述相同的实验。已知对通过二维培养培养的干细胞的IBE处理可诱导分泌包含许多治疗因子的囊泡。在本实验中，将此二维培养物用作包含治疗因子的阳性对照组。
IBE的制备和处理如下进行：收集具有短暂大脑中动脉闭塞的动物模型(大鼠；参考“Kutluay Uluc等；Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular SutureOcclusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat；Journal of VisualizedExperiments(2011)”制备)的脑，并将其150mg/ml等分于敲除DMEM(Invitrogen)中，并且然后使用均化器均化。收集均化的脑并以10,000g离心10分钟。将上清液转移到管中，并使用0.2μm注射器过滤器过滤。在过滤后，将其1ml等分并在10℃和14,000g下离心45分钟。将各上清液收集在管中。使用敲除培养基制备20％IBE培养基(16ml敲除培养基+4ml IBE)，并使用瓶盖式过滤器(0.2μm)过滤制备的IBE培养基以除去污染物和残留的微粒。取下在2D间充质干细胞培养皿中培养3天的培养基，随后用PBS洗涤三次并用20％(v/v)IBE处理。在24小时后，收集培养基以获得细胞外囊泡，将其以与上述相同的方式进行分析。
显影的图像显示在图10中，并且其量化结果显示在图11中。如图10和图11所示，从间充质干细胞球状体(由hMSC-聚集体或聚集体表示)分泌的细胞外囊泡被证实包含大量各种治疗因子，等于或高于IBE处理的治疗因子。

Claims (22)

1.一种产生源自干细胞的细胞外囊泡的方法，所述方法包括通过由三维细胞培养过程培养干细胞来产生三维细胞聚集体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述干细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和祖细胞中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞外囊泡具有50nm至1μm的平均直径。
4.根据权利要求1所述的方法，其中在所述三维细胞培养过程中使用的培养容器或培养支持物的细胞培养空间的大小是50μm至250μm。
5.根据权利要求4所述的方法，其中在所述三维细胞培养过程中使用的所述培养容器或所述培养支持物的所述细胞培养空间的大小是100μm至200μm。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞聚集体具有50μm至250μm的平均直径。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述细胞聚集体具有100μm至200μm的平均直径。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括培养所产生的三维细胞聚集体。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述产生的三维细胞聚集体的培养通过摇动培养过程进行。
10.一种用于产生源自干细胞的细胞外囊泡的组合物，所述组合物包含干细胞的细胞聚集体。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述干细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和祖细胞中的一种或多种。
12.根据权利要求10所述的组合物，其中所述细胞聚集体是平均直径为50μm至250μm的三维细胞结构。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述细胞聚集体是平均直径为100μm至200μm的三维细胞结构。
14.一种培养物，所述培养物通过培养干细胞的细胞聚集体获得。
15.根据权利要求14所述的培养物，其中所述干细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和祖细胞中的一种或多种。
16.根据权利要求14所述的培养物，其中所述细胞聚集体是平均直径为50μm至250μm的三维细胞结构。
17.根据权利要求16所述的培养物，其中所述细胞聚集体是平均直径为100μm至200μm的三维细胞结构。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的培养物，其中所述培养物每100个干细胞包含约2个至约50个源自干细胞的细胞外囊泡。
19.干细胞的细胞聚集体，所述干细胞的细胞聚集体用于产生源自干细胞的细胞外囊泡。
20.根据权利要求19所述的细胞聚集体，其中所述干细胞是选自胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞和祖细胞中的一种或多种。
21.根据权利要求19所述的细胞聚集体，其中所述细胞聚集体是平均直径为50μm至250μm的三维细胞结构。
22.根据权利要求21所述的细胞聚集体，其中所述细胞聚集体是平均直径为100μm至200μm的三维细胞结构。
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